Actividad enzimática vs inmunoturbidimetría para la

determinación de Ceruloplasmina
Les parece mejor otro titulo?
Resumen: (si o si es separada la introducción, materiales y métodos, resultados,
conclusión)? Se que esto depende del metodo
La ceruloplasmina, ferroxidasa que requiere cobre para su activación, se utiliza junto a
otros estudios clínicos para arribar al diagnóstico de la enfermedad de Wilson y Menkes.
En dichas patologías, la concentración de cobre circulante es baja por lo que la
ceruloplasmina se encuentra principalmente en su forma inactiva (apoceruloplasmina).
Existen diversas metodologías para determinarla. Los métodos enzimáticos como el de
Henry y col que determinan la porción activa y los métodos inmunológicos como el
inmunoturbidimétrico de Roche que mide ambas porciones, activa (holoceruloplasmina) y
la inactiva. Los últimos son más rápidos y precisos debido a su automatización, sin
embargo si los pacientes poseen holoceruloplasmina baja, se sobreestima el valor y no
arribamos al diagnóstico. Entonces, al utilizar la inmunoturbidimetría en pacientes con
holoceruloplasmina baja se sobreestima el valor y no se arriba al diagnóstico. Ésto no se
vio reflejado en nuestro estudio obteniendo una correlación entre ambos métodos
(r=0,916, p<0,0001) y una subestimación del método inmunoturbidimétrico frente al
enzimático en el estudio de concordancia.
Introducción:
La ceruloplasmina (ferroxidasa - I, EC 1.16.3.1.) es una proteína de fase aguda y de
transporte que se sintetiza en el hígado [1] [4]. A pesar de que se ha contemplado por
mucho tiempo como un transportador de cobre, su principal función es la actividad
ferroxidasa (oxidando el hierro ferroso a férrico)[1] [2] [4].
Entre las patologías que cursan con aceruloplasminemia se encuentran la enfermedad de
Wilson [1] (degeneración hepatolenticular) y la enfermedad de Menkes [1] (defecto
congénito en la absorción de cobre) [4]. Los pacientes con enfermedad de Menkes tienen
una sobrevida de 2 a 3 años, sin embargo la sobrevida en la enfermedad de Wilson
depende de un diagnóstico oportuno. [3] [1] Es por esto que resulta crucial contar con un
ensayo de calidad para determinar ceruloplasmina.
Existen diversos métodos para la determinación en el laboratorio de la Ceruloplasmina. El
método de referencia, que data de la década de los 60 es la determinación de la actividad
enzimática. [5] [7] [8] [9]. Éste método mide la holoceruloplasmina (porción
biológicamente activa cargada de cobre). [6] El mismo tiene buena sensibilidad y
especificidad, pero al tratarse de una técnica manual, demanda mucho tiempo y requiere
de un operador entrenado.
En la actualidad, el desarrollo y la aplicación de ensayos inmunológicos disponibles
comercialmente es cada vez mayor en los laboratorios clínicos, generalmente
nefelometría automatizada o inmunoturbidimétria para detectar ceruloplasmina sérica
[10]. A diferencia del método de referencia (actividad enzimática), estos ensayos
inmunológicos miden tanto la holoceruloplasmina como la apoceruloplasmina (porción no
funcional). [11]
Tanto en los pacientes con enfermedad de Wilson como en aquellos con enfermedad de
Menkes, la concentración de cobre circulante es baja. Esto aumentaría la proporción de
apoceruloplasmina, pudiendo obtenerse resultados no comparables entre ambas
metodologías. [12]
El objetivo de éste trabajo es evaluar la correlación y concordancia entre el método
enzimático de referencia y un método inmunoturbidimétrico. La importancia radica en
conocer si este nuevo método inmunoturbidimétrico puede reemplazar al método de
referencia, brindando al médico y paciente información clínica de calidad para arribar al
diagnóstico de forma temprana evitando complicaciones.
Materiales y métodos
Se realizó un estudio ANALÍTICO TRANSVERSAL ¿esta bien? para el cual se utilizaron
muestras de suero de niños con solicitud de ceruloplasmina que concurrieron al
Laboratorio Central del HIAEP “Sor María Ludovica” de La Plata en el período Abril 2013 -
Mayo 2021. ¿Y SI PONGO 2018-2021? SOLO 2 MUESTRAS SON DE 2013. Se excluyeron las
muestras con volumen insuficiente para ser procesadas por ambas metodologías y
aquellas que pertenecían al mismo paciente dejando solo la muestra más actual.
Las muestras fueron analizadas por el método de Henry y col [5] y el método
inmunoturbidimétrico CERU® (Roche, cobas c311). Cuando fue necesario los sueros se
conservaron a -20°C. ¿Pongo esto? ¿Implicaría blanquear que no fueron procesados
simultáneamente?
Los datos demográficos de la población se obtuvieron a través del Sistema Informático de
Laboratorio (LIS) de Wiener® y de planillas de trabajo del Sector Metabolopatías del
Laboratorio Central. Los mismos se volcaron en planillas de Microsoft Excel®.
El análisis estadístico consistió, en una primera instancia, de eliminar los outliers. Para
esto se utilizó la distancia de Mahalanobis para análisis multivariado y se transformó a
probabilidad (p<0,001). Se utilizó la prueba de Kolmogorov - Smirnov (p<0,05) para una
muestra para conocer la distribución de datos. La correlación se realizó a través del
estudio de Pearson [15] (p<0,05) entre el método considerado como referencia (actividad
enzimática) y el inmunoturbidimétrico (método de estudio). Para ambos análisis se utilizó
el programa IBM SPSS Statistics versión 21 . Además, se representó gráficamente la
dispersión de datos y se calculó el R2 utilizando el programa Microsoft Excel®.
El análisis de concordancia se llevó a cabo mediante la gráfica de Bland Altman. A partir
del mismo, se realizó un gráfico de sesgos y se le aplicó regresión lineal con el programa
IBM SPSS Statistics versión 21 (p<0,05)[16].
Consideraciones éticas
Según lo establecido en la Resolución 1480/2011 “Guía para investigaciones en seres
humanos”, este trabajo queda exento de la evaluación por parte del Comité de Ética en
investigación y la consiguiente elaboración de un consentimiento informado. ¿Sera
importante hacerlo pasar por comite de etica para certificar este parrafo? Lo saque del
trabajo de chagas de las chicas en el que les dijeron que no era necesario pasarlas porque
ya tenian el pedido de dicha solicitud.
Resultados
Se analizaron un total de 60 resultados de Ceruloplasmina determinadas tanto por el
método enzimático como por el inmunoturbidimétrico en el período 2013-2021. 2018-
2021. El 27% (17) corresponde a pacientes de género femenino y el 73% (43) a pacientes
de género masculino. Respecto a la localización, el 24% (14) de los niños se hallaba
hospitalizado al momento de la toma de muestra, mientras que el 73% (43) concurrió de
manera ambulatoria al Laboratorio Central. Además, el 3% (3) corresponde a muestras
derivadas de un centro de menor complejidad. La edad media de los pacientes incluidos
en el estudio (60) fue de 7,30 años.
La distancia de Mahalanobis no evidenció la presencia de ningún outlier por lo que se
utilizaron los 50 resultados para el análisis estadístico. Se utilizó la prueba de Kolmogorov -
Smirnov (p<0,05) para una muestra para conocer la distribución de datos, obteniéndose
una distribución normal por lo que se pudo utilizar para la correlación el coeficiente de
Pearson dando un valor r = 0.916. Además, se graficó la dispersión de datos que muestra
tendencia recta con R2 = 0,7719.
Gráfico 1: Gráfica de dispersión de datos con tendencia recta.

Para el análisis de concordancia, se convirtió la actividad enzimática obtenida por el

método de Herny y col. a concentración. Acá no encontré de dónde viene esa conversión
que se hace para informarlo en concentración, pero hay que aclararlo ya que para hacer
concordancia deben estar en las mismas unidades. Luego con los datos obtenidos se
realizó un gráfico de Bland Alman [17] para conocer la correlación a distintos rangos de
concentración y evaluar así si existe concordancia. Previamente se comprobó que las
diferencias entre métodos tengan una distribución normal mediante la prueba de
Kolmogorov - Smirnov (p<0,05).
Gráfico 2: Gráfico de Bland Altman.
En el eje “y” se grafican las diferencias entre las concentraciones obtenidas por el método
de referencia enzimático y el método inmunoturbidimétrico en estudio. En el eje “x” se
representa el promedio de las concentraciones medidas por ambos métodos, la recta
horizontal central marca la media de las diferencias mientras que las rectas horizontales
que se encuentran a ambos lados representan ± 1.96 DS.
Gráfico 3: Gráfica de sesgos
Se aplicó regresión lineal al gráfico de Bland Altman obteniéndose una recta con
pendiente positiva con un R2: 0,385.
Discusión y conclusión
En el presente trabajo se evidenció una correlación estadísticamente significativa entre el
método inmunoturbidimétrico y el enzimático para la determinación de Ceruloplasmina.
Ésto no se evidencia en los estudios publicados que establecen la sobreestimación de los
valores obtenidos con el método inmunoturbidimétrico (especialmente en los grupos con
enfermedad de Wilson y Menkes) ya que mide también Holoceruloplasmina [18] [19] [20].
Es importante contemplar que la diferencia en correlación obtenida entre los distintos
trabajos y el presente, está influenciada por la performance de la metodología utilizada. Es
decir, existen distintos tipos de técnicas inmunoturbidimétricas y enzimáticas que cuentan
con sensibilidad, especificidad, límite de detección y sensibilidad a interferentes
diferentes. Además, al ser el método enzimático manual, hay que considerar el error
propio del operador y de la metodología por su reproducibilidad.
Al contrario de lo esperado, al analizar los datos se puede observar que el valor obtenido
por el método inmunoturbidimétrico fue menor que el enzimático. Ésto se evidencia en la
gráfica de Bland Alman, presentando un sesgo positivo que señala una diferencia positiva
entre los valores obtenidos por el método de referencia (enzimático) y el
inmunoturbidimétrico. Además, éste sesgo es menor a concentraciones más bajas (el
análisis de sesgo da una recta con pendiente positiva), lo cual es clínicamente importante
ya que los valores de toma de decisión médica son aquellos en los que la concentración
está por debajo del límite de referencia [13] [14]. Esto podría deberse a la metodología
enzimática utilizada ya que se cuenta con un espectrofotómetro de simple haz, por lo que
no existe blanco de reactivo y si el sustrato se oxida con la luz, da valores superiores al
real, ya que esa oxidación no se resta por carecer de blanco.
A pesar de que el análisis estadístico indica que hay correlación entre ambos métodos y
que el sesgo positivo evidenciado tiene escaso efecto en los rangos de decisión clínica,
resulta importante señalar alguna de las limitaciones del presente estudio.
Una de las limitaciones de este estudio radica en qué no se pudo evaluar el método sobre
una población sana, por lo que aún considerando sólo aquellos resultados dentro del
rango de referencia utilizado en el Laboratorio Central del HIAEP Sor María Ludovica, no es
suficiente para evaluar cómo correlacionan ambos métodos en dichos pacientes. Además,
no es suficiente el número de pacientes incluidos en este trabajo para evaluar si la
correlación se ve modificada en los distintos grupos de patologías, como se evidencia en
los estudios previamente publicados.
Otra de las limitaciones fue que se analizaron muestras del mismo paciente de distintas
fechas, por lo que la población es sesgada. Está limitacion fue difícil de subsanar ya que
debido a la baja prevalencia de la Enfermedad de Wilson y Menkes, el número de
muestras recibidas por el Sector de Metabolopatías es bajo y si tomáramos una muestra
de cada paciente no podríamos realizar un análisis estadístico. ¿Esto lo dejo? Otra de las
limitaciones observadas es que aunque el N (60) utilizado es suficiente para realizar un
análisis estadístico, el mismo sigue siendo pequeño y existe la posibilidad de considerar
que un nuevo método es adecuado aun cuando no lo sea en verdad. Se recomienda que
los estudios de correlación y concordancia tengan al menos 100 individuos/muestras. [17]
Por todo lo mencionado anteriormente, resultaría interesante realizar más estudios que
involucren un número de muestras mayor y contando con pacientes potencialmente
sanos y enfermos (especialmente con Wilson y Menkes).
Sin embargo, debido a la rapidez, precisión y fácil automatización y a los resultados
estadísticos obtenidos en este trabajo que avalan su utilización, el método
inmunoturbidimétrico podría ser usado con carácter diagnóstico y reemplazar al método
enzimático de referencia.
Bibliografia
¿Esta bien citado?
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