Departamento de Bioanálisis Clínico

Guía de Laboratorio # 3

I. DATOS GENERALES
Asignatura: Bioquímica clínica I.
Tema: Determinación cuantitativa de Glucosa y Glicohemoglobina A1c.

II. OBJETIVOS.
1. Establecer la muestra de elección para el análisis de glucosa y glicohemoglobina, así
como los factores que interfieren en su medición.
2. Ejecutar las técnicas analíticas para evaluar la concentración de glucosa y
glicohemoglobina A1c.
3. Interpretar los resultados obtenidos en cada una de las determinaciones con base a valores
de referencia y al control de calidad.

III. INTRODUCCION.

La diabetes mellitus es una enfermedad que cursa con una hiperglucemia, causada por un
déficit de insulina. El diagnóstico clínico debe realizarse teniendo en cuenta todos los datos
clínicos y de laboratorio. Una de las pruebas de rutina cuando se sospecha de diabetes es la
prueba de glucosa en ayunas, siendo este carbohidrato la mayor fuente de energía para las
células del organismo; la insulina facilita la entrada de glucosa en las células.

Otra prueba que es de mucha importancia es la glicohemoglobina A1C, análisis de sangre que
indica los niveles promedio de glucosa en la sangre (azúcar en la sangre) durante los últimos
3 meses. Una prueba de hemoglobina A1c (HbA1c) mide la cantidad de azúcar en la
sangre (glucosa) adherida a hemoglobina en los últimos tres meses. Es un promedio de tres
meses porque ese es el tiempo de vida típico de los glóbulos rojos.

IV. DESARROLLO.
Actividades

1. Organizarse en grupos equitativos para la práctica.

2. Preparar el material a utilizar.
3. Realizar el análisis de las muestras en lectura directa (Concentración) o en modo
Absorbancia.
4. Cada subgrupo deberá trabajar de manera ordenada, guardando silencio en el área de
trabajo.

5. Al finalizar deben dejar el área ordenada y limpia, bancos debajo de la mesa.

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Ensayos

1. Determinación Cuantitativa de Glucosa

Principio del método

La glucosa oxidasa (GOD) cataliza la oxidación de glucosa a ácido glucónico. El peróxido
de hidrógeno (H2O2), producido se detecta mediante un aceptor cromogénico de oxígeno,
fenol-ampirona en presencia de peroxidasa (POD):

La intensidad del color formado es proporcional a la concentración de glucosa presente en la

muestra ensayada.

Muestras: Suero o plasma libre de hemólisis y de ictericia. Sueros de pacientes tratados con
N-acetilcisteína (NAC, tratamiento de sobredosis de paracetamol), N-acetil-p-benzoquinona
imina y/o metamizol pueden dar resultados falsos bajos de glucosa. La muestra debe ser
tomada antes de la administración del metamizol.

Procedimiento:
1. Condiciones del ensayo: Longitud de onda: 500 nm, Hg 546 nm
2. Cubeta: 1 cm paso de luz
3. Temperatura: 20-25°C o 37ºC
4. Ajustar el espectrofotómetro a cero frente a agua destilada.
5. Pipetear en una cubeta:
Blanco Standard Muestra
RT mL 1.0 1.0 1.0
Standard µL --- 10 ---
Muestra µL --- --- 10

6. Mezclar e incubar 10 minutos de 20-25°C o 5 minutos a 37ºC.

7. Leer la absorbancia (A) del Patrón y la muestra, frente al Blanco de reactivo, antes de 60
minutos.
8. Realice los cálculos e interprete según los valores de referencia.

O bien directamente:
C = 5.55 x Ab Muestra = mmol/l
Ab St

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9. La prueba es lineal hasta una concentración de glucosa de 400 mg/dl o 22.2 mmol/l. si la
concentración de glucosa en la muestra es superior a estos límites diluya la muestra 1+2
con agua destilada y repita la determinación. Multiplique el resultado por 3.

10. Valores de referencia

Suero o plasma (en ayunas): 75-115 mg/dl o 4.2-6.2 mmol/l
2. Determinación Cuantitativa de Hemoglobina A1c
Principio del método
Después de preparar el hemolizado, donde se elimina la fracción lábil, las hemoglobinas son
retenidas por una resina de intercambio catiónico. La hemoglobina A1c se eluye
específicamente después de lavar la fracción AbA1a + b, y se cuantifica mediante una lectura
fotométrica directa a 415 nm.
Muestra: Sangre completa recolectada con heparina o EDTA.
Preparación: Los reactivos están listos para usarse. Llevar a temperatura ambiente (21-
26°C) unos pocos minutos antes de usarse.
Preparación de la columna
El almacenamiento a largo plazo de las columnas conduce a un empaquetamiento excesivo
de la resina que disminuye el caudal y alarga el paso de elución. Para recuperar la eficiencia
de flujo es recomendable que 10 minutos antes de comenzar la prueba, invierta las columnas
para volver a poner el contenido en su lugar, colóquelas en su posición vertical y deje que la
resina se asiente durante unos minutos.
Algunas burbujas de aire pueden aparecer ocasionalmente dentro del lecho de resina. Su
presencia no altera el rendimiento de la prueba.
Siempre quite la tapa superior de la columna primero y la tapa inferior en segundo lugar.
luego, utilizando el extremo redondeado de una pipeta, empuje el disco superior hacia la
superficie de resina teniendo cuidado de no comprimirlo. Deje que la columna se drene
completamente para desperdiciar.
Procedimiento operativo
1. Condiciones del ensayo: Longitud de onda: 415 nm (405-425); Cubeta: 1 cm paso de luz;
Temperatura: 21-26°C
2. Ajustar el espectrofotómetro a cero frente a agua destilada.
3. Preparación del hemolizado y eliminación de la fracción lábil. Pipetear en tubos del test:

Sangre 50 µl
Reactivo 1 200 µl

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Sacudir y dejar en reposo a temperatura ambiente por 10-15 minutos. El hemolizado será
usado en los pasos 5 y 6.
4. Prepare una columna (ver preparación)
5. Separación y lectura de la fracción HbA1c. Pipetee cuidadosamente sobre el filtro
superior.
Hemolizado 50 µl Dejar la columna drenar por completo.
Para drenar cualquier muestra de residuo deje arriba el disco superior.
Pipetee:
Reactivo 2 200 µl Dejar la columna drenar por completo.
Pipetee:
Reactivo 2 2.0 ml Dejar la columna drenar por completo.
Coloque la columna sobre un tubo de ensayo 16 x 100 mm y adicionar:
Reactivo 3 4.0 ml Recolectar el eluado (fracción HbA1c)
Agite bien y lea la absorbancia de la fracción HbA1c a 415 nm contra agua destilada.

6. Lectura de Hb total
Pipetear dentro de los tubos de ensayo 16x160 mm:
Reactivo 3 12.0 ml
Hemolizado 50 µl
Agite bien y lea la absorbancia a 415 nm contra agua
destilada.

7. Cálculos
%HbA1c = AbHbA1c ÷ (3 x AbHbTotal) x 100
8. Valores de referencia
Rango normal: 4.2 - 6.2 %
Diabético bien controlado: 6.7 - 9.1 %
Diabético descontrolado: ˃ 9.1 %
La prueba tiene un rango de medición de 4.3 % (límite de detección) a 17 %.
9. Interferencias
Los valores erróneos pueden obtenerse a partir de muestras con cantidades anormalmente
elevadas de otras hemoglobinas como resultado de su elución simultánea con HbA1c (HbF)
de las diferencias en su glicación de la HbA (HbS).
Nota:
Los valores obtenidos son independientes de la temperatura cuando se trabaja en el intervalo
recomendado (21-26 ° C). Si la temperatura de trabajo está fuera del rango, multiplique el
valor obtenido por el factor correspondiente que se muestra en la siguiente tabla:

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Temperatura de trabajo Factor
18°C 1.29
19°C 1.18
20°C 1.12
27-30°C 0.91

V. BIBLIOGRAFIA.
1. Química Clínica /Anderson Cockaine.
2. Bioquímica clínica Allan Gaw.
3. Inserto de glucosa Human
4. Inserto de HbA1c Cypress Diagnostics

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