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PURIFICACION DE ADN A PARTIR DE MUESTRAS DE SANGRE.

RESUMEN:
La purificacin de ADN consiste en separar este ultimo de otras molculas
constitutivas de la clula. Para ello se necesitan de procesos especficos que
garanticen una correcta purificacin, entre los cuales se encuentra la destruccin y
lisis del material celular, seguido de una remocin de protenas tpicamente
obtenida por digestin de la protenasa K y la extraccin de ADN que puede estar
dada por diversas tcnicas, sin embrago en este caso el mtodo utilizado es el de
altas concentraciones de sales o salting out.

PALABRAS CLAVES
Extraccin de ADN, Salting out, purificacin.

INTRODUCCION.
El ADN est constituido por dos cadenas de nucletidos unidas entre s formando
una doble hlice. Los nucletidos estn integrados por un azcar (desoxirribosa),
un grupo fosfato y una base nitrogenada (adenina, guanina, timina o citosina)
(Alejos, L.et, al. sf)

La sangre es una fuente excelente de ADN. ste est presente en los glbulos
blancos (o leucocitos), pero no en los glbulos rojos humanos (eritrocitos o
hemates), pues stos carecen de ncleo. (Snchez, D et, al; 2007).
Si bien, en un principio se purificaban primero los glbulos blancos para luego
extraer ADN a partir de ellos, el posterior avance de la tcnica permite hoy en da
extraer ADN a aprtir de sangre entera con la misma pureza, sumando rapidez y
sencillez. (Roque, M et, al. 2012).
La extraccin consiste en el aislamiento y purificacin de molculas de ADN y se
basa en las caractersticas fisicoqumicas de la molcula. (Alejos, L.et, al. sf)

Los diferentes mtodos de extraccin de ADN de clulas sanguneas reportados


varan ampliamente. Estos mtodos se basan, en su mayora, en el uso de
solventes orgnicos txicos, como fenol/ cloroformo para la separacin de cido
nucleico de las protenas y dems componentes celulares. (Sambrook J et,
al.1989)
En general, los protocolos tradicionales consisten de cinco etapas principales:
homogeneizacin del tejido, lisis celular, separacin de protenas y lpidos,
precipitacin y redisolucin del ADN. (Alejos, L.et, al. sf)

Uno de estos mtodos fue reportado por Miller en 1988 y es conocido con el
nombre de purificacin salina o salting out. (Miller SA et, al. 1988). El ADN se asla
mediante precipitacin en presencia de alcohol isopropanol o etanol y se disuelve
en agua o en una solucin tamponada que puede contener conservantes del ADN,
tales como cido etilendiaminotetraactico (EDTA). (Gross-Bellard M ,1973). El
ADN es normalmente aislado de la capa leucocitaria o las muestras de linfocitos,
los cuales se obtienen por purificacin previa por centrifugacin o filtracin en
gradientes de densidad. (Gross-Bellard M ,1973).
En este estudio se tiene como objetivo purificar el and de una muestra de sangre
humana utlizando el metodo de salting out o de concentraciones de sales y
verificar su eficacia en lo resultados.

Conclusion:

- El metodo utilizado( salting out), resulta efectivo para la purificacion de adn


en muestras de sangre.
No se!!!!!!!!!!!!!!!!!!

ANALISIS:
Los grupos fosfato estn cargados negativamente y son polares, lo que le confiere
al ADN una carga neta negativa y lo hace altamente polar, caractersticas que son
aprovechadas para su extraccin. Los grupos fosfato tienen una fuerte tendencia a
repelerse, debido a su carga negativa, lo que permite disolver al ADN en
soluciones acuosas y formar una capa hidratante alrededor de la molcula. Pero,
en presencia de etanol, se rompe la capa hidratante y quedan expuestos los
grupos fosfato. Bajo estas condiciones se favorece la unin con cationes coma
Na+ que reducen las fuerzas repulsivas entre las cadenas de nucletidos y
permiten que el ADN precipite (Sambrook et al. 1989). Por otro lado, la carga neta
negativa del ADN le permite unirse a molculas y matrices inorgnicas cargadas
positivamente (Nasn 1965, Travaglini 1973, Sambrook et al. 1989, Sinden
1994)http://www2.inecc.gob.mx/publicaciones2/libros/710/extraccion.pdf

La solucin Tris como buffer


Como el pH puede influir y ser influido por un nmero de factores celulares, mantener un pH
estable es esencial para la ciencia experimental. Los buffers biolgicos, como la solucin Tris, son
importantes porque pueden mantener un pH estable a pesar de las influencias que podran
modificar el pH. El Tri (hidroximetil) aminometano, con un pKa de 8,1, es una solucin buffer eficaz
con un pH de entre 7 y 9. Debido a su rango neutro, la solucin Tris es una solucin buffer
comnmente utilizada en los laboratorios biolgicos. Sin embargo, la solucin reguladora Tris es
sensible a la temperatura y debe ser utilizada en la temperatura a la cual se logr el pH original
para evitar inexactitudes.
Lisis de las clulas
La lisis, o ruptura de las clulas, es el primer paso para la extraccin del ADN. Esto se logra
mediante el uso de una solucin buffer que contenga solucin Tris y EDTA (cido
Etilendiaminotetraactico). El EDTA se une a cationes divalentes tales como el calcio y el
magnesio. Dado que estos iones ayudan a mantener la integridad de la membrana celular, la
eliminacin de estos con EDTA desestabiliza la membrana. La solucin Tris es el principal
componente buffer; su funcin principal es la de mantener el pH del buffer en un punto estable, por
lo general 8,0. Adems, la solucin Tris interacta con el LPS (lipopolisacrido) de la membrana, lo
cual sirve para desestabilizar la membrana an ms.

La solucin Tris Protege al ADN de los cambios en el pH


Cuando las clulas se rompen, su ADN y contenido se vierten en el buffer. A menudo se incluyen
adems, la ARNasa (destruye el ARN), las proteasas (destruye las protenas), y el SDS
(dodecilsulfato sdico, solubiliza los fragmentos de membrana). En conjunto, este caldo de
contenido celular y fragmentos de ARN y protenas puede tener un gran impacto en el pH de la
solucin. Debido a que el ADN es sensible al pH, es importante que la solucin Tris regule el caldo
y mantenga el pH en un valor fijo.

Precipitacin del ADN


En la etapa final de la extraccin de ADN, se extrae el propio ADN de la solucin. En este punto, el
ADN es soluble en el buffer. Para extraer el ADN de la solucin, este se hace insoluble mediante la
adicin de etanol o isopropanol (alcohol isoproplico). Al hacer esto, el ADN se hace visible en la
solucin como una sustancia blanca filiforme. A pesar de que cuando el ADN es insoluble se lo
puede aislar de los componentes celulares restantes, no es "utilizable". Despus de aislarlo, se
elimina el alcohol, y el ADN debe ser devuelto a una solucin buffer biolgica, tal como la solucin
Tris, para ser utilizado.
http://www.ehowenespanol.com/funcion-solucion-buffer-tris-extraccion-adn-sobre_
BIBLIOGRAFIA .

- Snchez Daniel, et.al (2007) gentica humana- tomado de:


http://genoma.unsam.edu.ar/cursos/genetica_humana/GH_Guia2007.pdf

-Roque Maria,Gomz laura,jefferies Milagros(2012) gentica. Tomado de:


http://www.icb.uncu.edu.ar/upload/practicos-de-laboratorio

-Sambrook J, Fritsch E & Maniatis T Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd


edn. Cold Spring Harbor, NY: Cold S, Spring Harbor Laboratory.1989

- Miller SA, Dykes DD, Polesky HF. A simple salting out procedure for extracting
DNA from human nucleated cells
.
Nucl.Acids Res.1988;16(3):1215

-. Gross-Bellard M, Oudet P, Chambn P: Isolation of high-molecular-weight- DNA


from mammalian Cells. Eur J Biochem. 1973; 36(1):32-3

- Alejos laura,Aragn Maria, cornejo Amelia(sf) EXTRACCIN Y PURIFICACION


DE ADN. Tomado de:
http://www2.inecc.gob.mx/publicaciones2/libros/710/extraccion.pdf