3-3-2021 Actividad # 4

Laboratorio de Microbiología

Integrantes:
Sthephany Montenegro
2-745-1905
Manuel Trejo
6-720-861
Barbara Antoniu
8-1003-909
Pilar Beaton
8-843-1235
 Introducción

La tinción de Gram o coloración de Gram es un tipo de tinción diferencial

empleado en bacteriología para la visualización de bacterias, sobre todo en
muestras clínicas. Debe su nombre al bacteriólogo danés Christian Gram (1853-
1938), que desarrolló la técnica en 18841. Se utiliza tanto para poder referirse a la
morfología celular bacteriana, como para poder realizar una primera aproximación
a la diferenciación bacteriana, considerándose bacterias grampositivas a las que
se visualizan de color morado, y bacterias gramnegativas a las que se visualizan
de color rosado y rojo
 Objetivos

 Conocer las características de la tinción de Gram

 Describir el proceso de realización de una tinción de Gram
 Explicar lo que ocurre, a nivel de la pared bacteriana, de cada paso de la
 Tinción de Gram
 Explicar la utilidad de la tinción de Gram
 Descripción

Materiales:
 Portaobjetos
 Asa bacteriológica
 Microscopio
 Cristal violeta 2,0%
 Lugol
 Etanol 95%
 Safranina 0,25%
 Agua

Procedimiento:
a) Primero, se debe preparar el frotis, para esto se debe añadir una gota de
agua sobre el portaobjetos, y luego se debe añadir una pequeña cantidad
de la bacteria, se debe extender por el portaobjetos y se deja secar al aire.
b) Luego, se debe fijar la muestra por calor a la llama.
c) Se deben añadir unas gotas de cristal violeta sobre la superficie de la
muestra, y se deja reposar por 1 minuto.
d) Se retira el cristal violeta de la muestra y, se añade lugol sobre la superficie
y se debe dejar reposar por 1 minuto.
e) Se retira el lugol y se decolora con etanol.
f) Luego, se retira el alcohol con agua y se añade safranina sobre la
superficie. Se debe dejar reposar por un minuto y medio, luego se retira la
safranina con agua.
g) Se procede a observar la muestra con ayuda del microscopio. Se deben
identificar las Gram + y las Gram -.

Explicación Gram positiva y Gram Negativa

Bacterias gram positiva
Las gram positivas quedan cristal violeta debido que la pared celular de las
bacterias gram positivas está formada por una membrana lipídica y pared de
peptidoglucano, siendo éste el principal componente que permite diferenciarlas
con la pared de las gram negativas, pues al teñirlas es gracias a él, al grosor que
éste le proporciona, que se logra mantener la coloración del cristal violeta en el
interior de la célula al teñirla con la tinción gram.
Por lo tanto, al añadirle safarina esta no teñirá a las células gram positivas porque
durante la tinción de gram el colorante (cristal violeta) penetra en todas las células
a través de la pared bacteriana.
Bacterias gram negativa
Las bacterias gram negativas quedan color rojo opaco, ya que las gram negativas
presentan dos membranas lipídicas entre las que se localiza una fina pared celular
de peptidoglucano, mientras que las bacterias grampositivas presentan solo una
membrana lipídica y la pared de peptidoglicano es mucho más gruesa.
Al ser la pared fina, no retiene el colorante durante la tinción de Gram, incluso si
le es añadido el cristal violeta, la mezcla de alcohol-acetona decolora las bacterias
gram-negativas que poseen una pared celular más completa, tienen membrana
externa que forma un saco rígido alrededor de la bacteria. Sin embargo, al
añadirle la safranina teñirá las células gram negativa que están sin colorantes, en
color rojo opaco, debido a su membrana externa que forma un saco alrededor de
la bacteria.
Utilidad de Tinción Gram
El objetivo de Gram era conseguir una prueba con la que fuera posible diferenciar
diferentes grupos de bacterias para así poder estudiarlas y clasificarlas. La prueba
resultó todo un éxito y pronto se convirtió en una técnica muy útil no solo para el
estudio de las bacterias, sino también para poder identificarlas rápidamente en
una infección y seleccionar el antibiótico más adecuado para tratarla.
La tinción de Gram se utiliza en todas las situaciones de hospitales, clínicas o
centros de investigación en las que se tenga que hacer una primera aproximación
a la naturaleza de una infección bacteriana.
Cuando se solicita un cultivo, siempre que se sospecha una infección bacteriana o
a veces una infección fúngica. Se realiza también cuando el resultado de un
cultivo es positivo, a partir de una muestra de las bacterias que han crecido en el
cultivo.
Infecciones de orina, neumonías, meningitis, sepsis, enfermedades intestinales,
enfermedades de transmisión sexual, infecciones cardíacas, úlceras cutáneas
infectada. La tinción de Gram puede realizarse sobre cualquier muestra de tejido
vivo en el que pueda haber bacterias.
Después de realizarla, es posible que los científicos y médicos ya tengan todo lo
que necesitan para enfocar correctamente el tratamiento. También hay veces en
las que deben realizarse pruebas de diagnóstico complementarias, pero
igualmente la tinción de Gram sigue siendo la base.
 Investigación de Preparación de Reactivos

Formulación
Solución Concentración Preparación
1. Disuelva 2 g de violeta
cristal en 20 ml de alcohol
Solución A: etílico al 95%.
Cristal violeta (pureza del colorante 2. Disuelva 0,8 g de oxalato de
de por lo menos, el 90%)........ 2 g. amonio monohidrato en 80 ml
Cristal
Etanol (95%)................. 20 ml de agua desionizada.
violeta al
3. Mezcle las soluciones de
2.0 %
Solución B: cristal violeta y oxalato de
Oxalato de amonio................ 0,8 g. amonio monohidrato para
Agua destilada.................... 80 ml. hacer la tinción cristal violeta.
Filtra la mancha si es
necesario.
Combinar el yodo y el yoduro
de potasio con la ayuda de un
El Lugol es una disolución de yodo
mortero.
molecular I2 y yoduro
Lavar el contenido de éste con
potásico KI en agua destilada.
pequeñas alícuotas de agua
Yodo (químicamente puro)...... 1 g
destilada.
Lugol Yoduro de potasio.................... 2 g
Agregar agua suficiente para
Agua destilada................... 300 ml.
obtener un total de 300 ml.
Agitar fuertemente.
Almacenar la solución en un
frasco de vidrio color ámbar.

– Debe utilizarse el etanol a la

concentración de 70% v/v que
tiene un poder antiséptico
superior al de concentraciones
más elevadas. Para obtener 1
Etanol 95%................... 500 ml.
litro de etanol al 70% v/v: •
Acetona........................... 300 ml.
Etanol al tomar 785 ml de etanol al 90%
95 % v/v o 730 ml de etanol al 95%
v/v, o 707 ml de etanol al 99%
v/v; • completar hasta 1 litro
con agua destilada o, en su
defecto, con agua filtrada; •
dejar enfriar y reajustar hasta 1
litro con agua (al mezclarlo, se

Safranina (pureza del colorante,
90…………….....................0,25g
Etanol (95%) …...................10 ml.
Safranina Agua destilada.............. 1000 ml.
Cristal Violeta 2.0%
reduce el volumen)
Disolver el colorante en 10 ml.
de etanol, Agregar el agua
destilada, filtrar y Almacenar
en frasco de vidrio color
ámbar.
Etanol
Safranina Lugol
 Conclusión

En microbiología la herramienta por excelencia para identificar especies

bacterianas son las tinciones, las cuales consisten en técnicas de diagnóstico en
las que se aplica un colorante en la muestra para que este revele información
importante sobre el grupo bacteriano ante el que nos encontramos.
Al obtener una muestra de algún tejido, a priori, infectado y prepararla para
visualizarla en el microscopio, si no realizamos algunos tratamientos previos, no
veríamos absolutamente nada. En el día a día de la microbiología, las
preparaciones tienen que teñirse.