FACULTAD DE

CIENCIAS

Práctica N°2

TINCIONES DIFERENCIALES (Tinción de Gram)

Miguel Angel Vega Rueda - Jair Esteban Sotelo Castro

Grupo 1
jsoteloc@unal.edu.co - mvegaru@unal.edu.co
Departamento de Farmacia - Microbiología general

l. Introducción

La microbiología general cumple una función primordial en la comprensión de los

microorganismos y su interacción con su entorno; las características morfológicas y
estructurales de las bacterias son elementos esenciales para establecer su diversidad
taxonómica y su comportamiento biológico, así que dentro de este contexto, un área
fundamental de estudio es el análisis de las diferencias en la composición bioquímica de las
paredes bacterianas, lo que ha impulsado el desarrollo de técnicas de tinción a través de los
años [1]. Entre estas, se destaca la tinción de Gram, desarrollada por el bacteriólogo danés
Hans Christian Gram en 1884. Esta metodología representa una forma de tinción diferencial
que se ha desempeñado como método primordial en la identificación y clasificación de
bacterias, hongos y microorganismos que poseen pared celular , basándose en las
divergencias bioquímicas de la misma . Los resultados observables proporcionan un marco
taxonómico sólido para las bacterias, resultando en datos valiosos para su análisis. La técnica
de tinción de Gram se sustenta en la capacidad de los microorganismos para retener ciertos
colorantes durante el proceso de tinción, lo cual refleja está variaciones en la estructura
bioquímica de sus paredes celulares antes mencionada [2].

Las bacterias se han clasificado en dos grupos

principales según su respuesta a la tinción de
Gram: las Gram positivas (Gram +) y las Gram
negativas (Gram -). Las bacterias Gram
positivas presentan una morfología
caracterizada por la presencia de una robusta
pared que rodea su membrana citoplasmática
compuesta de de 8 a 20 capas de peptidoglicano
que a su vez tienen ácido teicoico y lipoteicoico,
estas dos sustancias le dan una mayor resistencia
a la bacteria a ser fagocitada lo cual favorece su factor de virulencia y además interfieren en
la regulación de otras funciones como el tránsito Mg2+ y permitir su adherencia a los
epitelios y ciertas superficies; en contraste, las bacterias Gram negativas muestran una
estructura de pared celular más delgada de 1 a 3 capas de peptidoglicano, que adicionalmente
presentan una capa adicional, una membrana externa compuesta principalmente por
FACULTAD DE
CIENCIAS

Práctica N°2

lipopolisacáridos. Estas disparidades bioquímicas en las capas celulares tienen un impacto

directo en la respuesta de las bacterias a la tinción de Gram [3].

La técnica se basa en la aplicación secuencial

de cuatro reactivos con lavados intermedios
entre la aplicación de uno y otro, los reactivos
utilizados son los siguientes: cristal violeta,
Lugol, alcohol-acetona y fucsina , así que el
principio radica en la interacción entre estos
reactivos y la composición de las paredes
microbianas.Cada reactivo tiene su función
específica para un correcto desarrollo de la
técnica [4].

El cristal violeta desempeña un papel fundamental en el proceso de tinción de Gram, siendo

el primer paso crucial en dicha técnica. Su función principal radica en la coloración inicial de
las bacterias presentes en la muestra (independientemente de la composición bioquímica de
su pared celular) ; esta acción resulta en una mejora significativa en la visualización de las
características morfológicas y estructurales de las bacterias. La interacción inicial entre los
microorganismos y el cristal violeta se basa en las propiedades electrostáticas y químicas. El
cristal violeta, debido a los grupos funcionales en su estructura molecular, predomina una
carga positiva. En contraste, el peptidoglicano, componente clave de la pared celular
bacteriana, presenta grupos funcionales con carga negativa, como los grupos carboxilo
(-COO-) presentes en los aminoácidos que lo constituyen. Esta diferencia de carga resulta en
atractivas interacciones electrostáticas entre el cristal violeta y las áreas negativamente
cargadas del peptidoglicano. Como resultado de estas interacciones, el cristal violeta se une a
los grupos funcionales negativos del peptidoglicano, formando enlaces iónicos y puentes de
hidrógeno que aseguran su fijación. Este proceso establece la base para los siguientes pasos
de la técnica.

Después de la aplicación del cristal violeta, se aplica la solución de lugol. El lugol es una
solución de yoduro de potasio (KI) y yodo elemental (I2) en agua que cuando se aplica a la
preparación bacteriana teñida con cristal violeta se combina el yodo (I2) con el cristal violeta
(CV+) para formar un complejo insoluble llamado complejo de yodo-cristal violeta
(I2-CV+). Este complejo se deposita dentro de las células bacterianas siendo más grande y
menos soluble que el cristal violeta solo, debido a esto, el complejo se adhiere y penetra en la
capa de peptidoglicano de las bacterias Gram positivas con mayor facilidad que en las
bacterias Gram negativas [5].

Durante el paso siguiente de la tinción de Gram, se realiza un lavado con alcohol-acetona, las
bacterias Gram positivas retienen el complejo de yodo-cristal violeta debido a su capa de
peptidoglicano más gruesa y estructura celular. En las bacterias Gram negativas, el alcohol
FACULTAD DE
CIENCIAS

Práctica N°2

disuelve la membrana externa lipídica y debilita la capa de peptidoglicano, permitiendo que

el complejo sea eliminado más fácilmente perdiendo la coloración otorgada por el cristal
violeta inicialmente

Finalmente se aplica fucsina el cual es un colorante de contratinción en la técnica de tinción

de Gram. Después de que las bacterias han sido tratadas con el cristal violeta y el lugol, se
lavan con alcohol - acetona para eliminar el exceso de colorante como se mencionó
anteriormente. En este punto, las bacterias se dividen en dos grupos principales: las que
retienen el cristal violeta (bacterias Gram-positivas) y las que no lo retienen (bacterias
Gram-negativas), así que para visualizar las bacterias que no retienen el cristal violeta y para
darles color, se aplica la fucsina para teñir las bacterias de color rojo o rosa, permitiendo su
diferenciación de las bacterias Gram-positivas que ya están teñidas de violeta. Por lo tanto, la
safranina ayuda a contrastar y diferenciar entre estos dos tipos de bacterias en la técnica de
tinción de Gram.

Otro aspecto importante aparte de la técnica de tinción en sí, es la buena preparación de la

muestra; se recomienda la utilización de cultivos jóvenes, con un período de crecimiento de
entre 12 y 24 horas, ya que las bacterias en cultivos jóvenes están en su fase de crecimiento
activo y exponen las características más representativas de sus paredes celulares. Durante esta
etapa, las bacterias están en su máxima actividad metabólica y su pared celular se encuentra
en un estado más uniforme y característico. Esto facilita la observación de las diferencias en
la estructura de la pared celular entre bacterias Gram positivas y Gram negativas [5].

Siguiendo con la técnica, la preparación adecuada de un frotis se debe de tener en cuenta ya

que se busca distribuir uniformemente las bacterias en una delgada capa sobre el
portaobjetos. Esto influye en la tinción al facilitar la interacción homogénea de los colorantes
con las células, asegurando una interpretación precisa de los resultados, de la mano es
pertinente la fijación con calor antes de la tinción para garantizar la integridad de las células
y su adherencia a la superficie del portaobjetos. Esta técnica de fijación con calor tiene como
objetivo prevenir la degradación de las estructuras celulares y minimizar los movimientos
celulares durante el proceso de tinción. Sin embargo, es importante tomar precauciones para
evitar efectos negativos:

● El calor moderado: El calentamiento excesivo puede provocar la ruptura de las

membranas celulares y la alteración de las estructuras bacterianas, lo que
distorsionaba los resultados de la tinción.

● Tiempo de exposición controlado: El tiempo de calentamiento debe ser adecuado

para permitir que las células se adhieran al portaobjetos sin que se produzcan cambios
estructurales significativos.
FACULTAD DE
CIENCIAS

Práctica N°2

● Pérdida de muestras: Una fijación demasiado vigorosa puede hacer que las células
se desprendan del portaobjetos, lo que dificultará su observación posterior..

En resumen, la técnica de tinción de Gram ha revolucionado la microbiología al permitir la

diferenciación taxonómica de bacterias según sus características celulares. La comprensión
de las diferencias en la composición bioquímica de las paredes bacterianas, la selección
adecuada de cultivos, la aplicación precisa de colorantes y el conocimiento de los procesos
involucrados son esenciales para el éxito y la interpretación de esta técnica.

ll. Objetivos

Objetivo general

● Identificar la presencia de microorganismos a partir de diferentes muestras y cultivos

tomados por los estudiantes.

Objetivos específicos

● Reconocer las diferentes formaciones que pueden llegar a tener los microorganismos,
como pueden ser, sus formas (cocos, bacilos) y sus agrupaciones (estreptococos,
estafilococos, tétradas o sarcinas)
● Correlacionar los diferentes conceptos aprendidos en la teoría acerca de la
composición de membranas y paredes celulares con lo observado en el laboratorio.
● Comprender la ciencia detrás de los microorganismos Gram positivos y Gram
negativos

lll. Materiales y reactivos

Materiales

Microscopio
FACULTAD DE
CIENCIAS

Práctica N°2

Láminas

Laminillas

Asas bacteriológicas

Muestras de Hagar

Reactivos

● solución salina 0.85%

● Reactivos para tinción de gram (Violeta de Gram, lugol, alcohol acetona y fucsina)
● aceite de inmersión

lV. Resultado y discusión

Colonia # 1
 FACULTAD DE
CIENCIAS

Práctica N°2

Morfología microscópica Descripción macro de la colonia

La colonia objeto de estudio presentó

una forma convexa y un distintivo
color amarillo quemado, con bordes
perfectamente definidos y una forma
circular. Su superficie exhibía un
acabado brillante. Para obtener una
mayor comprensión de su estructura
celular, se procedió a llevar a cabo la
tinción de Gram.

Análisis de género y especie probable

Los resultados de esta tinción revelaron una tonalidad violeta, indicando la presencia de una pared de
peptidoglicano gruesa que permitió la retención del complejo cristal violeta - yodo. Este resultado
confirmó la naturaleza Gram positiva de la bacteria bajo análisis, sugiriendo una estructura celular
característica.

Mediante la exploración de diversos campos microscópicos, se identificaron patrones de agrupación

bacteriana. La observación detallada reveló que la mayoría de las bacterias adoptan una morfología
de cocos. Específicamente, se destacaron agrupaciones de tétradas, mientras que en ciertas áreas de
los campos microscópicos se observaron configuraciones compatibles con estreptococos y otras
presentaron agrupamientos menos definidos. Esta diversidad en la disposición celular proporcionó
información valiosa sobre las interacciones y formaciones microbianas presentes.

La fuente de la colonia estudiada provino de muestras obtenidas a partir de un raspado de superficie

de uno de los lavamanos de un baño. Estas fuentes sugieren una presencia de la bacteria en el
entorno. Enfocándonos en las características morfológicas previamente descritas más la ausencia de
esporulación y la habilidad demostrada de adhesión a diversas superficies, se plantea una sugerencia
 FACULTAD DE
CIENCIAS

Práctica N°2

tentativa sobre la posible identidad de la bacteria. Los resultados apuntan hacia el género
Staphylococcus. En particular, la morfología de la colonia, en combinación con la capacidad
adhesiva y la ausencia de esporulación, dirigen la atención hacia Staphylococcus aureus [6].

En resumen, la microscopía y caracterización detallada de la colonia reveló características

morfológicas distintivas, comportamientos de agrupación y potenciales implicaciones taxonómicas.
Las observaciones respaldan la identificación tentativa de la bacteria como Staphylococcus aureus,
ofreciendo una perspectiva sólida para futuros análisis y exploraciones en el ámbito de la
microbiología ambiental y la identificación de especies bacterianas.

Colonia # 2

Morfología microscópica Descripción macro de la colonia

Se puede observar una colonia con unos

bordes no muy definidos con una
coloración blancuzca pero que no llega a
ser muy notoria, denotando las
características de un hongo filamentoso,
con esto en cuenta se procede a realizar
la tinción de Gram de la colonia para
observar su estructura microscópica.

Análisis de género y especie probable

Al llevar la colonia #2 al microscopio se pueden observar macroconidias, confirmando de esa manera

que se trata de un hongo, por lo tanto pertenece al reino fungi. Como se observa en la imagen las
 FACULTAD DE
CIENCIAS

Práctica N°2

microconidias se tiñeron de un color más rosado que violeta, esto dado que las macroconidias poseen
una pared fina y lisa, por lo general tienen forma cilíndrica de clava o de tornillo, dichas
macroconidias son hialinas (transparentes a simple vista).
Alrededor de las macroconidias se observaron pequeños bacilos Gram positivos los cuales
presentaban una espora subterminal en su estructura.
Con todo lo anterior en cuenta se puede determinar que el hongo analizado pertenece al género
Microsporum, esto ya que posee macroconidias Gram negativas por las características de su
membrana celular cuyo grosor no supera los 7 µ𝑚, dichos hongos se encuentran en diversas
superficies según su especie,dichos hongos son los causantes de diversas micosis (infecciones
causadas por hongos a animales o vegetales), dentro del género Microsporum existen varias especies
como lo son: M. ouinii, M. gallinae, M. ferrugineum, M. geophilic, a este último pertenece la
colonia observada en clase, ya que su característica principal es el crecer en superficies como el
suelo, lo cual concuerda con el sitio donde se tomó la muestra ya que fue el lavamanos de un baño y
pudo llegar allí cuando alguien disponía a lavarse las manos.

Colonia #3

Morfología microscópica Descripción macro de la colonia

 FACULTAD DE
CIENCIAS

Práctica N°2

A nivel macroscópico se logra observar

que la colonia es pequeña en diámetro,
lisa, presenta bordes ondulados no muy
definido, posee una tonalidad blancuzca y
tiene una pequeña colonia vecina que es
verdosa se intuye que es una colonia de
bacterias, se procede a observar su
estructura microscópica para confirmar.

Análisis de género y especie probable

Observando la colonia #3 al microscopio, se identifican bacilos grampositivos, dentro de dichos

bacilos hay lugares sin teñir (posibles esporas) esto se confirma claramente la presencia de
endosporas en los cúmulos de bacterias en la muestra. Dichas endosporas se encuentran en el interior
de los bacilos y no se ve una alteración en su morfología. Este detalle es útil en la identificación de
los tipos de bacilos presentes en el cultivo, donde se infiere que se trata del género Bacillus.

El género Bacillus engloba bacilos aerobios grampositivos . Mayoritariamente, son saprófitos y se

encuentran en suelos, aguas, aire y vegetación. Por tanto, con alta probabilidad, se puede confirmar
que pertenece a este género debido a su morfología de bastón, evidente en la imagen microscópica,
además de ser grampositiva.

Se asemeja al género Bacillus debido a la formación de endosporas que son centrales y no deforman
la estructura celular. Característicamente, los bacilos del género Bacillus miden entre 1x3 a 4 μm y
poseen extremos cuadrados, como se evidencia en la imagen. Por lo general estas colonias de bacilos
saprófitos (se alimentan de materia orgánica muerta) utilizan fuentes simples de carbono y nitrógeno
para crecer. La fase de esporulación se da cuando alguno de estos elementos se agota.

En cuanto a la especie Bacillus, podría corresponder a Bacillus subtilis. Bacillus subtilis es

grampositivo y común en suelos (coherente con el origen de la toma de la muestra).

Bacillus subtilis pertenece al género Bacillus, de la familia Bacillaceae, orden Bacillales, clase
Bacilli y filo Firmicutes en el dominio Bacteria. Aunque no es patógena para los humanos, puede
contaminar alimentos.[7]

Conclusiones

● De acuerdo a lo observado en el laboratorio se puede concluir que los

microorganismos que a simple vista no se pueden caracterizar mediante el
FACULTAD DE
CIENCIAS

Práctica N°2

conocimiento de su estructura se pueden observar aplicando la técnica tinción de

Gram.

● El análisis microscópico y la caracterización detallada de la colonia # 1 bacteriana

revelaron patrones de agrupación, morfología distintiva y comportamientos celulares
que respaldan la identificación tentativa de la bacteria como Staphylococcus aureus.

● El análisis microscópico de la colonia # 2 confirma su naturaleza fúngica al revelar

macroconidias y microconidias, identificando así su pertenencia al reino Fungi. La
estructura y características de las macroconidias sugieren que el hongo pertenece al
género Microsporum, específicamente a la especie M. geophilus. Esta elección se
respalda por su capacidad para crecer en lugares, como el entorno del lavamanos
donde se obtuvo la muestra, lo cual es coherente con su hábitat natural.

● los bacilos de la especie “ Bacillus subtilis”, en esta última colonia se observó una
limitación de la tinción de Gram, la cual es su incapacidad de teñir esporas, esto dado
que la espora es una estructura cuya pared es demasiado gruesa, incluso lo suficiente
para que el complejo violeta de Gram-Lugol no pueda ingresar, por lo tanto aunque la
tinción de Gram es un método confiable para saber la morfología de
microorganismos, indicando incluso el grosor de membrana o pared celular, tiene
falencias las cuales dependiendo el tipo de microorganismo puede frenar su correcto
análisis, por lo tanto se necesita el uso de otras técnicas de tinción, para el caso de las
esporas se utiliza la tincion de Schaeffer-Fulton.

Bibliografía

[1] Rojas A, (2023) Guías de laboratorio de Microbiología para Farmacia - TINCIONES

DIFERENCIALES ( Tinción de Gram ) (6-9)Pj

[2] Moyes, R., Reynolds, J., & Breakwell, D. (2009). Differential Staining of Bacteria: Gram
Stain. Current Protocols in Microbiology, 15.
https://doi.org/10.1002/9780471729259.mca03cs15.

[3] Prescott, L. M. (2002). Microbiology.

[4] G.B.C.E., J; Facklam R; Knapp, JS; Popovic, T; Wells, J; Dowell, SF; , Manual de
Laboratorio para la Identificación y Prueba de Susceptibilidad a los Antimicrobianos
Patógenos Bacterianos de Importancia para la Salud Pública en el Mundo en Desarrollo
.2004: World Health Organization
FACULTAD DE
CIENCIAS

Práctica N°2

[5] Cappuccino, J. G., & Welsh, C. T. (2017). Microbiology: a laboratory manual. Pearson
Education.

[6] Foster, T. (1996). Staphylococcus. Medical Microbiology. 4th edition.

[7]Graumann P (editor). (2012). Bacillus: Cellular and Molecular Biology (2nd edicion).
Caister Academic ´ Press. ISBN 978-1-904455-97-4. [1]. Ryan KJ; Ray CG (editors) (2004).
Sherris Medical Microbiology (4th edicion). McGraw Hill.