COLORACIÓN DE GRAM
OBJETIVOS:
Identificar y diferenciar bacterias a través de esta tinción diferencial
DEFINICIÓN:
Es definida como una tinción diferencial, ya que utiliza dos colorantes y clasifica a las
bacterias en dos grandes grupos: bacterias Gram negativas y bacterias Gram positivas. Fue
desarrollada por el científico danés Hans Christian Gram en 1884; hoy en día, sigue siendo
una de las tinciones más utilizadas universalmente debido a lo económico, sencillo y eficaz
que resulta. En microbiología clínica resulta de gran utilidad, ya que a partir de muestras
clínicas directas provenientes de sitios estériles se puede saber de manera rápida las
características de la muestra y hacer una diferencia de los potenciales microorganismos
causantes de una infección
FUNDAMENTO DE LA TINCIÓN DE GRAM:
Los principios de la tinción de Gram están basados en las características de la pared celular
de las bacterias, la cual le confiere propiedades determinantes a cada microorganismo.
La pared celular de las bacterias Gram negativas está constituida por una capa fina de
peptidoglicano unida por lipoproteínas a una membrana celular externa, de composición
distinta a la interna. La membrana exterior está formada de proteína, fosfolípido y
lipopolisacárido.
Mientras que las bacterias Gram positivas poseen una pared celular gruesa de
peptidoglicano, además de dos clases de ácidos teicoicos: anclado en la cara interna de la
pared celular y unido a la membrana plasmática, se encuentra el ácido lipoteicoico, y más en
la superficie, el ácido teicoico que está anclado solamente en el peptidoglicano (también
conocido como mureína), pero no cuentan con membrana celular externa.
Así pues, la composición química y el contenido de peptidoglicano en la pared celular de las
bacterias Gram negativas y Gram positivas explica y determina las características tintoriales
La clave es el peptidoglicano, ya que es el material que confiere su rigidez a la pared celular
bacteriana, y las gram positivas lo poseen en mucha mayor proporción que las gram
negativas.
TECNICA DE LA COLORACIÓN:
1.- Cubrir el extendido con cristal violeta o violeta de genciana durante 1 minuto
2.- Decantar el colorante y lavar suavemente con agua destilada
3.- Cubrir el extendido con lugol por 1 minuto
4.- Lavar suavemente con agua destilada
5.- Decolorar con alcohol-acetona. Hasta que la preparación deje de perder color (30
segundos)
6.- Lavar con agua destilada
7.- Cubrir el extendido con fucsina o safranina por 1 minuto
8.- Lavar suavemente el exceso de colorante con agua destilada
9.- Drenar el frotis y secarlo al aire en posición vertical apoyado sobre un papel filtro o papel
absorvente
10.- Limpiar el reverso y observar en el microscopio.
EXPLICACIÓN DE LA TÉCNICA
Los lavados con agua tienen el objetivo de arrastrar mecánicamente el exceso de colorante y
quitar el alcohol-acetona.
[Link] cristal violeta constituye el colorante primario de la tinción, es de naturaleza básica y por
lo tanto tiene afinidad por sustancias cargadas negativamente como el peptidoglicano de la
pared bacteriana, por lo que bacterias Gram positivas y Gram negativas son teñidas de color
violeta.
2. Posteriormente, se coloca lugol, el cual sirve como mordiente e impide la salida del cristal
violeta por la formación de un complejo cristal violeta-yodo insoluble en agua que satura los
espacios del peptidoglicano de la pared bacteriana, evitando que disuelva y se pierda el
colorante durante el enjuague
Un mordiente es una sustancia que aumenta la fijación de algún colorante sobre una
superficie determinada, en este caso el cristal violeta aumenta su fijación a la pared
bacteriana. Conociendo que las paredes de los Gram positivos son ricos en ácidos teicoicos
no saturados estos muestran gran afinidad por los agentes oxidantes, todos los mordientes
por ejemplo el lugol son agentes oxidantes y su efecto en general consiste en dar un
carácter de mayor acidez de los ácidos teicoicos lo que aumenta la afinidad de estos por el
colorante básico cristal violeta.
3. En seguida, se coloca una mezcla de alcohol-acetona es un disolvente orgánico que
decolora la pared bacteriana disolviendo el complejo cristal violeta-lugol, esta decoloración
no afecta a las bacterias Gram positivas, debido a que:
- El alcohol-acetona, deshidrata la pared bacteriana rica en peptidoglicano de los
microorganismos Gram positivos lo cual cierra los poros de la pared, propiciando una
barrera que no permite la salida del complejo cristal violeta-lugol. En la pared de las
bacterias gramnegativos hay poco péptidoglicano y una gran cantidad de lípidos estos
últimos son disueltos por el alcohol-acetona, lo que permite el escape del complejo cristal
violeta-lugol.
- Las bacterias Gram positivas tienen una capa muy gruesa de peptidoglicano con gran
cantidad de enlaces entrecruzados de ácidos teicoicos los cuales son poco solubles en
alcohol-acetona formando una especie de barrera en la pared bacteriana que no permite la
salida del complejo cristal violeta-lugol por ende se retiene el cristal violeta-lugol en la pared
en el proceso de decoloración.
4. Por último, se coloca la safranina o fucsina (colorante de contraste o colorante
secundario) es un colorante catiónico que tiñe las paredes bacterianas ya que estas tienen
compuestos cargados negativamente, por consiguiente, las bacterias Gram negativas se
tiñen de color rosa, sin embargo, las bacterias Gram positivas no se tiñen debido a que su
pared celular está saturada del colorante cristal violeta y esto no permite la entrada de la
safranina.
Las bacterias Gram positivas se observan de color azul obscuro, morado o violeta, mientras
que las Gram negativas se observan de color rosa a rojo.
Las muestras útiles para su uso son líquidos estériles, biopsias para cultivo, abscesos,
hisopados, crecimiento de colonias aisladas en medios de cultivo.
CONSIDERACIONES A TOMAR EN CUENTA:
No todas las bacterias se pueden teñir por esta técnica ya que carecen de pared celular
(micoplasma) o su pared celular tiene una composición química diferente (micobacterias,
que cuentan con una gran cantidad de ácidos micólicos).
Dentro de los factores que alteran la tinción de Gram esta la
Edad de la bacteria.
Errores del operador.
Uso de antibióticos
A pesar de la gran utilidad de la tinción de Gram, este método debe ser valorado con
precaución, ya que la reacción puede variar según la edad de las células (cultivos viejos de
bacterias Gram positivas pueden perder capas de peptidoglicanos y teñirse como Gram
negativos) y la técnica empleada (al decolorar por un tiempo muy prolongado se puede
correr el riesgo que bacterias Gram positivas se tiñan como Gram negativas). Por esta
situación, junto a la muestra deben teñirse controles con bacterias Gram positivas (por
ejemplo, Staphylococcus aureus) y Gram negativas (por ejemplo, Escherichia coli).
INFORME DE LOS RESULTADOS:
Una tinción de Gram a partir de un espécimen clínico debe contener la siguiente
información:
Respuesta leucocitaria y su tipo ya sea PMN o MN (polimorfonuclear y mononuclear) en
términos de escasa o moderada cantidad.
Forma y coloración y a veces agrupación bacteriana en términos de escasa o moderada
cantidad.
En muestras de esputo sirve para evaluar la calidad de la muestra y se deben contar los
PMN y las células epiteliales con objetivo 10x, además de informar los morfotipos
bacterianos.
OBSERVACIÓN:
La flora bacteriana observada se informa por género y a veces la agrupación, pero no se
indica la especie ya que solo la identificación mediante las pruebas bioquímicas de los
cultivos bacterianos permite precisar la especie
