TEMA 2: REALIZACIÓN DE

BLOQUES DE TEJIDOS

Profesor: Manuel Munuera

Asignatura: Procesamiento citológico y tisular
ÍNDICE

1. Fundamentos y proceso de inclusión de muestras para microscopía óptica

y electrónica: deshidratación, aclaramiento e infiltración.
2. Proceso de tallado de la muestra.
3. Preparación y confección de bloques: Orientación de la muestra.
4. Preparación, programación, limpieza y mantenimiento de los equipos y
materiales.
5. Otras técnicas de procesamiento y estudio histocitológico.
Análisis de imagen. Esteorología. Microdisección láser.
1. Fundamentos y proceso de inclusión de
muestras para microscopía óptica y electrónica:
deshidratación, aclaramiento e infiltración.
 Inclusión: proceso por el cual eliminamos completamente el agua
existente en los tejidos y la sustituimos por un material sólido que mantenga
la estructura y la arquitectura entre los distintos elementos, impidiendo así
su fragmentación durante el corte.
 1. Fundamentos y proceso de inclusión de muestras para
microscopía óptica y electrónica: deshidratación, aclaramiento
e infiltración.

 Esta inclusión dependerá de con qué microscopio se vayan a observar las muestras

Microscopías

Óptica Electrónica

- Deshidratación - Deshidratación
(Alcohol) (Acetona y etanol)
- Aclaramiento (Xilol) - Líquidos intermedios
- Infiltración (Óxido de propileno)
(Parafina) - Inclusión (Epoxirresina)
1. Fundamentos y proceso de inclusión de
muestras para microscopía óptica y electrónica:
deshidratación, aclaramiento e infiltración.
Microscopia optica
1. La deshidratación: que puede realizarse mediante agentes químicos,
reactivos deshidratantes o por procedimientos fisicoquímicos. Las
principales características de los agentes deshidratantes son las siguientes:

 No deben alterar la estructura tisular.

 Deben ser rápidos.
 No endurecer demasiado los tejidos.
 Presentar mínima toxicidad o peligrosidad.

El más importante es el alcohol etílico, muy inflamable y muy caro, lo que

hace que industrialmente se use desnaturalizado con metanol (etanol).
 1. Fundamentos y proceso de inclusión de
muestras para microscopía óptica y electrónica:
deshidratación, aclaramiento e infiltración.
Pasos del proceso de Deshidratación:

Graduación creciente de los alcoholes (50º, 70º,

96º y absoluto). El volumen del alcohol debe ser
como mínimo 10 veces superior al de la muestra
a deshidratar. Se recomiendan varios baños
para disminuir el riesgo de endurecimiento del
tejido y para controlar el grado de saturación de
agua en el alcohol. La duración de la
deshidratación estará en función del tejido y su
contenido en agua (no es lo mismo el tejido óseo
que el conjuntivo). Un exceso de tiempo causa
endurecimiento excesivo del tejido.
 1. Fundamentos y proceso de inclusión de
muestras para microscopía óptica y electrónica:
deshidratación, aclaramiento e infiltración.
Otros agentes deshidratantes son:
 Acetona: actúa con rapidez, aunque aumenta la  Dioxano.
fragilidad el tejido en tiempos prolongados.

 Alcohol metílico: se puede usar como sustitutivo

del alcohol etílico, aunque es muy inflamable y  Alcohol isopropílico.
muy tóxico.

 Tetrahidrofurano
 Alcohol butílico: muy lento, miscible con la parafina.
 1. Fundamentos y proceso de inclusión de
muestras para microscopía óptica y electrónica:
deshidratación, aclaramiento e infiltración.
2. Aclaramiento: Consiste en sustituir el agente deshidratante por una sustancia miscible
con el medio de inclusión.
 El agente aclarante adecuado dependerá de su rapidez para eliminar el agente
deshidratante, del respeto de las estructuras de los tejidos, de su fácil eliminación y
de su toxicidad y peligrosidad. Se recomiendan varios baños de aclarante para
evitar que éste pierda sus propiedades.
 El principal agente aclarante es el Xilol (Dimetilbenceno).
 Ventajas del Xilol: es el más rápido, endurece poco los tejidos,
fácil eliminación del medio de inclusión y fácil manejo.

 Inconvenientes: muy tóxico, sólo aclara desde el alcohol

absoluto, tiende a volver blanquecino el tejido y en tiempos
prolongados endurece el tejido.
1. Fundamentos y proceso de inclusión de
muestras para microscopía óptica y electrónica:
deshidratación, aclaramiento e infiltración.
Otros agentes aclarantes son:
 Tetracloruro de carbono (CCL4)
 Benceno

 Tolueno (metilbenceno)
 Cloroformo (CHCl3)
 Dioxano
 1. Fundamentos y proceso de inclusión de
muestras para microscopía óptica y electrónica:
deshidratación, aclaramiento e infiltración.
3. La infiltración o inclusión: Consiste en sustituir el agente aclarante por un medio sólido que
proporcione la dureza y homogeneización suficientes al tejido para que del mismo se puedan
obtener secciones finas y de calidad.

 Se recomiendan varios baños de agente infiltrante para su total

penetración. El medio más usado en la rutina del laboratorio es la
parafina.

 El proceso de inclusión puede hacerse tanto manual como automático. Los reactivos y el
número de baños dependerán del tamaño de las muestras que vayamos a incluir:
 Piezas pequeñas: Menor cantidad de baños y tiempos menos prolongados.
 Piezas grandes: Mayor cantidad de baños y tiempos más prolongados.

 Existen procesadores automáticos que, además de sumergir las muestras en los diferentes
reactivos, utilizan la temperatura y la presión, porque aumentando ambas se optimiza y
acelera el trabajo, penetrando mejor en los tejidos.
1. Fundamentos y proceso de inclusión de
muestras para microscopía óptica y electrónica:
deshidratación, aclaramiento e infiltración.
 1. Fundamentos y proceso de inclusión de
muestras para microscopía óptica y electrónica:
deshidratación, aclaramiento e infiltración.
 Para un trabajo de rutina
con muestras de diferentes
tamaños se emplean
programas de tiempos
medios en aparatos
automáticos.

 Un programa estándar
rutinario sería el siguiente:
1. Fundamentos y proceso de inclusión de
muestras para microscopía óptica y electrónica:
deshidratación, aclaramiento e infiltración.
Microscopia electrónica

 A grandes rasgos, los procesos de inclusión son idénticos a los

descritos para la microscopía óptica. Debemos saber cuál es el
producto final que queremos obtener para usar los reactivos,
tiempos y metodología adecuados. Los cortes deben presentar
unas características fundamentales: deben ser extraordinariamente
finos y conservar la estructura celular que se quiere observar.
 1. Fundamentos y proceso de inclusión de
muestras para microscopía óptica y electrónica:
deshidratación, aclaramiento e infiltración.
1. Deshidratación. Los agentes más usados son la acetona y el
etanol, solos o en combinación. Este proceso debe ser exhaustivo,
ya que la menor presencia de agua imposibilitará el corte
posterior. La cantidad de baños y sus tiempos suelen ser inferiores
debido a que las muestras para microscopía electrónica son
sensiblemente menores en tamaño
2. Líquidos intermedios. A pesar de que el etanol y la acetona son
miscibles con el agente de inclusión, es muy recomendable usar
un agente de transición que facilite la penetración en el medio de
infiltración. El más común es el epoxipropano u óxido de propileno,
cuando el medio de inclusión sea alguna epoxirresina
3. Inclusión. Comúnmente se utilizan medios de inclusión de tipo
plástico (los más utilizados son las epoxirresinas), aunque existen
otras variedades. La metodología es válida en general. Suelen
conservar muy bien las estructuras subcelulares. Entre sus
inconvenientes encontramos su viscosidad, que dificulta la
penetración en el tejido, y su elevada toxicidad.
 2. Proceso de tallado de la muestra
 Consiste en la realización de cortes de las zonas más representativas o en
aquéllas que por protocolo deban ser analizadas microscópicamente.
 El patólogo seleccionará el
material que se va a emplear y a
estudiar y lo incluirá en casetes,
preparados e identificados con el
número de biopsia que le
corresponde.
 Si es una biopsia de tamaño
pequeño la muestra se incluirá
entera, si es de gran tamaño se
han de incluir como mínimo los
márgenes de resección
quirúrgicos, una muestra de lo que
macroscópicamente se considere
patológico y una muestra de lo
que se considere normal.
 2. Proceso de tallado de la muestra
Vídeos de tallado de muestras
 Corazón
https://www.youtube.com/watch?v=GMG7CdmncyU

 Prostatectomiatotal
https://www.youtube.com/watch?v=npr0LUfeQhs

Documento PRL en el tallado

https://www.insst.es/stp/basequim/010a-tallado-de-muestras-en-anatomia-
patologica-exposicion-a-formaldehido-actualizada-en-2018
 3. Preparación y confección de
bloques: Orientación de la muestra.
Finalizado proceso de inclusión se pasa a la formación de bloques sólidos que puedan ser
adaptados al microtomo.
 3. Preparación y confección de
bloques: Orientación de la muestra.
 Para la realización de los bloques se utilizan las llamadas estaciones de
inclusión o parafineros, que constan de:

 Un dispensador de parafina líquida.

 Una placa caliente, para mantener los bloques

calientes hasta que realicemos el bloque o para
orientar la pieza cuando estemos realizando el
bloque.

 Una placa fría de pequeño tamaño, para

ayudarnos a orientar la pieza al hacer el bloque, y
una de mayor tamaño para ir dejando los bloques
ya hechos.
3. Preparación y confección de
bloques: Orientación de la muestra.
 3. Preparación y confección de
bloques: Orientación de la muestra.
 El material esencial para hacer bloques es el siguiente:

 Pinzas de inclusión. Deben ser metálicas, de punta redonda y con dientes; el tamaño no
debe ser excesivo para evitar problemas en el manejo de las piezas pequeñas.

 Mechero de alcohol. En él se calentarán las

pinzas para que no se queden pegadas a ellas
ni la parafina ni las muestras.

 Moldes metálicos. Se pueden calentar y enfriar rápidamente para una óptima realización
de los bloques. Los hay de diferentes tamaños, dependiendo de la muestra, y en ellos se
ajustan perfectamente los casetes en los que se ha realizado en proceso de inclusión.
 3. Preparación y confección de
bloques: Orientación de la muestra.
 La orientación de las muestras en los bloques es esencial para obtener un
corte y posterior diagnóstico correctos por lo que a la hora de hacer los
bloques hay que intentar siempre:
 Siempre se corte la parte más blanda de la muestra al principio y la
más dura al final.
 Se vea con cada corte la mayor cantidad posible de tejido.
 En mucosas y pieles, que se vean todas las capas del tejido.
 La mayoría de las veces simplemente hay que colocar la muestra
como el patólogo/a indique.
 Siempre que se tengan dudas preguntar al patólogo que lo talló.
 3. Preparación y confección de
bloques: Orientación de la muestra.
 El proceso de realización de bloques sería el siguiente:
1. Sacar los bloques del procesador
2. Disponerlos en la placa caliente del Parafinero, para mantener caliente y líquida la parafina de las muestras.
3. Coger un casete, quitarle la tapa y mantenerlo sobre la placa caliente.
4. Seleccionar el molde adecuado dependiendo del tamaño de la pieza.
5. Dispensar parafina líquida en el molde hasta que rebase el depósito para la pieza y ponerlo en la placa
caliente.
6. Coger con las pinzas la muestra del casete y ponerla en el molde con parafina líquida con la orientación
adecuada.
7. Poner el molde en la placa fría para que la base de la placa se solidifique y la muestra no sufra variaciones
de orientación.
8. Coger el casete del que se ha extraído la muestra y colocarlo sobre el molde con la muestra.
9. Dispensar parafina líquida sobre el molde con la muestra y el casete, hasta que esté lleno.
10. Dejar el bloque sobre la placa fría hasta que se forme el bloque sólido.
11. Desmoldar cuando el bloque esté completamente frío
4. Preparación, programación, limpieza y
mantenimiento de los equipos y materiales.

 Como la maquinaria que se utiliza es muy delicada hay que llevar un

mantenimiento y limpieza adecuada para los equipos
 4. Preparación, programación, limpieza y
mantenimiento de los equipos y materiales.
Procesador de tejidos
 Antes de usarlo hay que hacer siempre una serie de comprobaciones:
• Limpieza propia del aparato.
• Cantidad y limpieza de los líquidos.
• Limpieza de la zona donde se depositen las muestras antes de su procesado.
 Una vez finalizado el programa, después de sacar la muestras, hay que:
• Comprobar la limpieza de la parafina en la que finalizó el programa.
• Comprobar la limpieza de los cestillos que contienen las muestras.
• Comprobar la limpieza de la cubeta donde finalice el proceso si esta es la
misma que donde empieza.
• La limpieza hay que efectuarla con Xilol, alcohol absoluto y agua, en este
orden.
 4. Preparación, programación, limpieza y
mantenimiento de los equipos y materiales.
 El mantenimiento del procesador tiene varios procesos:
• Cambiar periódicamente los líquidos que se emplean por otros limpios, ya
que con el paso de los días y las muestras se van ensuciando y van
perdiendo pureza y eficacia.
• Los servicios especializados llevarán a cabo programas de mantenimiento
periódicamente, que incluyen verificar todas las garrafas, las uniones de
éstas con el aparato, las mangueras por las que circulan los líquidos, los
motores y diversos componentes electrónicos.
 4. Preparación, programación, limpieza y
mantenimiento de los equipos y materiales.
Estaciones de inclusión
 El mayor problema de estos aparatos es que trabajan durante muchas horas a
temperaturas muy elevadas.
 Antes de comenzar a usarlos, hay que comprobar que:
o La parafina esté líquida con suficiente temperatura para su óptimo uso.
o Tener cantidad suficiente de parafina líquida para hacer todos los bloques.
o La placa caliente debe estar a la temperatura óptima.
o La placa fría debe estar encendida (fría).
o Si la estación de inclusión tiene programador, asegurarse de que se encienda
una hora antes de que comience el servicio y se apague después de cerrar
éste.
 4. Preparación, programación, limpieza y
mantenimiento de los equipos y materiales.
 Es muy importante la limpieza de las diferentes partes que forman el parafinero:
o El dispensador de parafina, para evitar que se obstruya.
o La placa caliente, para evitar contaminaciones entre las muestras y
también para evitar que un exceso de parafina se filtre por las partes
internas del aparato y provoque averías.
o La placa fría, ya que si no se produce contacto entre el molde y la placa
no se solidificará bien la parafina y la orientación puede no ser correcta. La
parafina sólida que pueda quedar en forma de restos sobre la placa hace
de aislante térmico entre la placa y el molde.
 El mantenimiento se basa en general en la limpieza rutinaria, con limpiezas
periódicas exhaustivas y revisiones periódicas de los servicios especializados de
los circuitos electrónicos, calentadores y ventiladores de las diferentes placas.
5. Otras técnicas de procesamiento y estudio
histocitológico. Análisis de imagen. Esteorología.
Microdisección láser.

Inclusión en Inclusión en
gelatina celoidina

Inclusión en Inclusión en
medios plástico
hidrosolubles (resinas)
 5. Otras técnicas de procesamiento y estudio
histocitológico. Análisis de imagen. Esteorología.
Microdisección láser.
Inclusión en gelatina

 Se utiliza sobre todo para cortes

macrométricos de órganos completos.
Al ser soluble en agua no es necesario
deshidratar y aclarar, aunque sí hay
que eliminar completamente el fijador
del tejido.
 5. Otras técnicas de procesamiento y estudio
histocitológico. Análisis de imagen. Esteorología.
Microdisección láser.
Inclusión en celoidina
 Se emplea en trabajos neurohistológicos,
muestras duras, frágiles o de gran
heterogeneidad. Entre sus inconvenientes
destaca que no pueden obtenerse cortes
menores de 10 μm y que tiene un proceso
muy largo que puede contarse en
semanas.
 5. Otras técnicas de procesamiento y estudio
histocitológico. Análisis de imagen. Esteorología.
Microdisección láser.
Inclusión en medios hidrosolubles
 Se utiliza para demostrar elementos
intratisulares que puedan desnaturalizarse
por calor o por agentes deshidratantes,
como por ejemplo enzimas o lípidos. El más
utilizado es el polietilenglicol y sus
derivados.
5. Otras técnicas de procesamiento y estudio
histocitológico. Análisis de imagen. Esteorología.
Microdisección láser. Inclusión en plástico
 Por ejemplo, metilmetacrilato,
glicolmetacrilato,
butilmetacrilato, resinas
hidrosolubles, etc. Se emplean
para el estudio de tejido óseo
sin decalcificar o materias de
elevada dureza. Conservan la
estructura excepcionalmente
5. Otras técnicas de procesamiento y estudio
histocitológico. Análisis de imagen. Esteorología.
Microdisección láser.

Análisis de
Estereología
imagen

Microdisección
láser
 5. Otras técnicas de procesamiento y estudio
histocitológico. Análisis de imagen. Esteorología.
Microdisección láser.
Análisis de imagen

 Ya se han analizado los

diferentes tipos de microscopía
que se utilizan para ver y
diagnosticar las preparaciones
histológicas. También es
fundamental conocer los
métodos de digitalización de
imágenes y telepatología para
poder trabajar con las
imágenes en el ordenador.
 5. Otras técnicas de procesamiento y estudio
histocitológico. Análisis de imagen. Esteorología.
Microdisección láser.
Estereología

 Es la interpretación espacial de secciones,

teniendo en cuenta que los tejidos son
tridimensionales.

 La estereología nos proporciona

herramientas para extrapolar la
tridimensionalidad de las secciones
bidimensionales vistas en el microscopio. Es
especialmente útil cuando la muestra tiene
una dimensión espacial menor que el
material original.
 5. Otras técnicas de procesamiento y estudio
histocitológico. Análisis de imagen. Esteorología.
Microdisección láser.
Microdisección láser

 Es una técnica práctica y fiable para

conseguir separar grupos celulares
específicos que nos interesan en una sección
bidimensional de tejido de aquellos que no
nos interesan.

 Se emplea sobre todo en estudios

moleculares.

 Ejemplo: se pueden “capturar” las células

tumorales de todas las células inflamatorias
no tumorales de alrededor.