L3-ML-001 Manual de Laboratorio de Biologia Celular

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Universidad Autnoma de Baja California L3-ML-001
Facultad de Medicina y Psicologa Revisin

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ML Manual de Laboratorio de Biologa Celular Pgina 1 de 68
Manual de Laboratorio de Biologa Celular
Clave de la materia: 11268
Plan de estudios 2010-1
Laboratorio 3
Autor o autores:
Dr. Carlos Vera
Dra. Diana Bueno
Dr. Horacio Almanza
Elabor Revis Autoriz
Dr. Horacio Almanza

M. C. Christian Rodrguez A DR. Renn Gonzlez Ramrez
GC-FR-012 Rev. 3
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NDICE
Sesin Nombre de la sesin Pagina

No.
1 Encuadre, clasificacin y separacin de Residuos Peligrosos Biolgico- 5

Infecciosos (RPBI) generados en el Laboratorio
2 Uso del microscopio ptico y tcnicas avanzadas de microscopa 14
3 Preparacin de soluciones y manejo de bscula analtica y pHmetro 21
4 Fragilidad osmtica del eritrocito 23
5 Tecnologa del DNA recombinante (clase terica) 25
6 Manejo de Micropipetas 29
7 Purificacin de DNA 36
8 Enzimas de restriccin 39
9 Electroforesis de ADN en gel de agarosa 42
10 Grfica de resultados de electroforesis 44
11 Bases tericas de la electroforesis de protenas (clase terica) 46
12 Electroforesis de Protenas 48
13 Transfeccin de bacterias con plsmido pGLO 57
14 Observacin de resultados de transfeccin 60
15 Cultivos celulares (clase terica/practica) 62
16 Resultados del mantenimiento de cultivos celulares (clase terica/practica) 66
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PRLOGO
El principal motivo de publicar este manual es proveer a los estudiantes de la Facultad de
Medicina y Psicologa de la Universidad Autnoma de Baja California campus Tijuana, con
una gua til sobre los protocolos que actualmente se aplican en el Laboratorio de Biologa
Celular. En esta edicin del manual se incorporan las diferentes competencias de forma
clara, a la vez que proporciona informacin experimental esencial.
I. Introduccin.
Este Manual de Laboratorio de Biologa Celular est destinado a los estudiantes del curso
de Biologa Celular y est escrito en un estilo interesante y expresivo. Presenta, de modo
condensado y claro, una descripcin de las relaciones estructurales y funcionales ms
importantes entre los procesos celulares. Cubre un amplio espectro: desde las bacterias
hasta las formas especializadas de las clulas de los animales y las plantas superiores, y
desde los componentes de las biomembranas hasta las complejas estructuras implicadas
en las interacciones entre las clulas. Proporciona informacin sobre las bases qumicas,
fsicas, metodolgicas y posibilidades de la biologa celular. Incluye numerosos esquemas
y en algunas sesiones figuras originales, a dos colores, que contribuyen a dar mayor
claridad al texto.
II. Competencia general de la asignatura.

Comprender la clula como unidad funcional de un organismo complejo (como el ser
humano), a travs de los mecanismos moleculares que integran la estructura y funcin
celular, para as poder comprender el funcionamiento de tejidos, rganos y sistemas en
condiciones normales e inferir las causas que originan un estado patolgico, con una
actitud responsable y de compromiso hacia su formacin.
III. Reglamento de laboratorio de biologa celular.

Normas de orden.
a) Los alumnos deben esperar fuera del laboratorio hasta que el maestro o instructor
llegue y stos les indiquen que pueden entrar. Si los maestros o instructores no se
presentan al laboratorio las prcticas no podrn realizarse, y es responsabilidad de los
tcnicos de laboratorio que los alumnos permanezcan fuera de l.
b) Los alumnos deben solicitar autorizacin al profesor de la materia para salir del
laboratorio. Los alumnos debern presentarse con un mximo de 10 minutos de
retardo, con ms tiempo de retardo el alumno perder el derecho a la prctica
correspondiente.
c) Los alumnos deben usar BATA BLANCA, LARGA Y LIMPIA, para ingresar al
laboratorio. Deben ponerse la bata antes de ingresar as como quitrsela a la salida, la
cual doblarn y colocarn en una bolsa de plstico para su lavado en casa.
d) Deben presentarse al laboratorio adecuadamente preparados con su manual,
previamente consultado sobre la sesin o prctica correspondiente. De no cubrir este
requisito no podrn efectuar la prctica.
e) Debe leer con detenimiento la tcnica a seguir, en caso de existir dudas consultar
antes de iniciar la prctica al instructor o el profesor.
f) El trabajo de laboratorio requiere de orden y silencio, por lo que cualquier alumno que
juegue o altere el orden dentro del laboratorio podr ser expulsado de la prctica y se
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le anotara inasistencia. Si reincide podr ser sujeto a suspensin temporal o

permanente del curso, sujeto a criterio del maestro.
g) El aseo del laboratorio es de primordial importancia, por lo que los alumnos deben
cooperar a mantener limpia su mesa de trabajo y el material que as se lo requiera. La
basura debe depositarse en los basureros.
h) Por ningn motivo pueden permanecer los alumnos en el laboratorio despus de la
salida del maestro o instructor.
IV. Mecanismos de evaluacin y evidencia de desempeo en el

laboratorio de biologa celular.
El laboratorio de Biologa celular se evaluara bajo el siguiente esquema:
Tpico a
Evaluacin Valor Descripcin del tpico a evaluar
evaluar
Puntualidad y El alumno se presenta oportunamente a la prctica y con la indumentaria
Asistencia 5%
asistencia y los requerimientos solicitados.
El alumno identificara y dispondr de los residuos peligrosos biolgico-
Evaluacin de
infecciosos (RPBI) en la estacin de destreza y evaluacin de RPBI con
destrezas
una eficiencia del 100%.
Exposicin de Se asignara a los alumnos un artculo (en ingles) de investigacin en un
articulo de tema relevante a biologa celular. Se evaluara a travs de la traduccin
Participacin investigacin del artculo y la exposicin.
65%
en la sesin
El alumno interpretara los resultados de las diferentes sesiones con
Cuestionario
responsabilidad y tica.
Calidad del El alumno elaborara una conclusin sobre la competencia aprendida en

reporte las diferentes sesiones.
Comprender la clula como unidad funcional de un organismo complejo
(como el ser humano), a travs de los mecanismos moleculares que
integran la estructura y funcin celular, para as poder comprender el
Examen funcionamiento de tejidos, rganos y sistemas en condiciones normales
Examen 30
departamental e inferir las causas que originan un estado patolgico, con una actitud
responsable y de compromiso hacia su formacin en las diferentes
sesiones realizadas en el laboratorio de biologa celular.
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IV. PROGRAMACIN DE PRCTICAS
1. Sesin 1: Encuadre, clasificacin y separacin de Residuos

Peligrosos Biolgico-Infecciosos (RPBI) generados en el
Laboratorio y bioseguridad en la prctica mdica.
2. Competencia a desarrollar en la sesin.

Manejar los RPBI, identificando, separando, disponiendo en los recipientes adecuados y
anotando en la bitcora correspondiente, para mantener el sitio de trabajo tal y como est
consignado en la NOM-087-SEMARNAT-SSA1-2002 y la gua de cumplimiento de la
Norma Oficial Mexicana y evitar la contaminacin y los accidentes, con responsabilidad,
disciplina y honradez.
3. Mecanismos de evaluacin y evidencia de desempeo.
Que el alumno identifique y disponga los residuos peligrosos biolgico-infecciosos (RPBI)

en la estacin de destreza y evaluacin de RPBI con una eficiencia del 100%.
4. Fundamento terico e informacin de apoyo.

En la sesin 1: Encuadre:
Normatividad en el laboratorio
Responsabilidades ante el SGC
Buenas prcticas de laboratorio
Criterios de evaluacin del laboratorio
Caractersticas del reporte de prcticas
Uso del manual de prcticas
Sanciones
Para primero y segundo semestre realizar la sesin de RPBI dando a conocer la
NOM-087-SSA-SEMARNAT-2002 en estaciones y descripcin de su aplicacin.
Para tercer, cuarto y quinto semestre hablar sobre la importancia de manejo
adecuado de RPBI y su aplicacin en hospitales, consultorio y casa; adems de
sealar los que se generan en el laboratorio especfico (Nota: hay libre practica
para cada maestro adapte le sesin a su semestre).
En la realizacin de las prcticas del Laboratorio de Biologa Celular, se generan RPBI por
lo que es importante conocer y aplicar las Normas Oficiales Mexicanas en especial la
NOM-087-SEMARNAT-SSA1-2002 y la gua de cumplimiento de la Norma Oficial
Mexicana. Los generadores de RPBI son los lugares pblicos, sociales o privados, fijos o
mviles cualquiera que sea su denominacin, que estn relacionados con servicios de
salud y que presten servicios de atencin mdica ya sea ambulatoria o para internamiento
de seres humanos y utilizacin de animales de bioterio o zooterio. En las reas de
generacin de los establecimientos generadores, se debern separar y envasar todos los
residuos peligrosos biolgico-infecciosos, de acuerdo con sus caractersticas fsicas y
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biolgicas infecciosas, conforme a la Norma Oficial Mexicana. Durante el envasado, los

residuos peligrosos biolgico-infecciosos no debern mezclarse con ningn otro tipo de
residuos municipales o peligrosos.
Los generadores y prestadores de servicios, adems de cumplir con las disposiciones

legales aplicables deben: cumplir con las disposiciones correspondientes a las siguientes
fases de manejo, segn el caso:
a) Identificacin de los residuos.
b) Envasado de los residuos generados.
c) Almacenamiento temporal.
d) Recoleccin y transporte externo.
e) Tratamiento.
f) Disposicin final.
El laboratorio debe contar con sealamientos y letreros alusivos a la peligrosidad de los

mismos, en lugares y formas visibles, el acceso a esta rea slo se permitir al personal
responsable de estas actividades. Algo importante para considerar es minimizar la
generacin de RPBI identificando y segregando los materiales que NO los contengan, por
ejemplo: papel de envoltura de gasa estril, envoltura de la jeringa, protector de las agujas,
etc. En el desarrollo de las actividades se deber separar adecuadamente los materiales
que son reciclables, depositndolos en los recipientes destinados para su posterior
tratamiento y recuperacin (Ejemplo: tubos de ensayo, matraces, etc.). En el manejo de
RPBI se debern utilizar los implementos de proteccin personal para su manejo e
identificar los sitios designados en el laboratorio para depositarlos.
En esta prctica se dar disposicin a los residuos biolgicos peligrosos basndonos como
lo menciona la NOM-087-SEMARNAT-SSA1-2002 segn corresponda al tipo de
contenedor y color. Los RPBI que se generan en el desarrollo de una prctica de los
laboratorios (Microbiologa, Parasitologa, Biologa Celular, Patologa, Histologa) pueden
ser los siguientes: tubos con sangre, jeringas, algodones, como se realiza el envasado de
los residuos segn la clasificacin.
Los tubos con las muestras de sangre en recipiente hermtico Rojo, si los tubos son de
plstico se pueden envasar en una bolsa Roja y depositar en el rea de RPBI en trancito
dentro del laboratorio para que posteriormente pase al rea de almacn temporal general
de la Facultad.
Cultivos y cepas que se generan en diferentes prcticas se envasaran en bolsa de

plstico roja, cumpliendo las especificaciones que marca la NOM-087-SEMARNAT-SSA1-
2002.
Patolgicos en este laboratorio se pueden generar lquidos patolgicos, los que se

envasaran en recipientes rgidos amarillos y cuando fuesen slidos patolgicos se
envasaran en bolsa amarilla, para depositarlo en el almacn temporal del laboratorio.
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Los punzocortantes se envasan en contenedor rgido rojo como los portaobjetos,

cubreobjetos, agujas, lancetas, estos se depositan en el rea de almacn temporal del
laboratorio. En caso de tener algn incidente respecto a los RPBI se debe de seguir el
manual de bioseguridad (LC-ML-002_Manual_de_bioseguridad) donde se cuenta con las
instrucciones dependiendo del incidente que se trate y se soluciona con el material para
esta contingencia que se encuentra localizado en el rea de manuales de laboratorio.
Residuos no anatmicos se generan guantes gasas, abate lenguas, cubre bocas, etc.,
los cuales se envasan en bolsa roja en la rea de almacn temporal del laboratorio.
TABLA No. 1: ENVASADO DE RPBI
Denominacin Estado fsico Envasado Descripcin
La sangre y sus componentes, slo en su forma

lquida, as como sus derivados no comerciales,
incluyendo las clulas progenitoras,
Liquido hematopoyticas y las fracciones celulares o
acelulares de la sangre resultante
(hemoderivados),
Envase Rojo Hermtico Suero y plasma tubo de vidrio.
Sangre
Slido y
lquidos en Cogulo, suero y plasma en tubo de plstico con
recipientes tapadera.
con tapa
Bolsa roja
Solid Cultivos en caja y placas de Microescan
Bolsa roja
Cultivos y
cepas de
agentes
infecciosos Solid Cultivos en Tubos de vidrio
Recipiente hermtico
Guantes contaminados, medios de transporte, asas

Slidos de plstico.
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Bolsa roja
Colorantes y lquido de enjuague de tinciones.

Liquido
Recipiente hermtico
Patolgicos Slido/liquido Biopsias, rganos, animales, tejidos.
Bolsa Amarilla / Envase

amarillo
Gasas, hisopos, papel, guantes, algodn que se
encuentre empapado de sangre u otro
contaminante,
Residuos no
Slido Tiras reactivas, asas de plstico, placas de
anatmicos
reaccin, cubetas de plstico para el espectro,
jeringas, pipetas transfer de plstico, abatelenguas
Bolsa Roja
Lancetas, agujas, agujas de bolsa de sangra,

Residuos
capilares de hematocrito, aplicadores, tubos rotos,
punzocortantes Slido
portaobjetos y cubreobjetos, puntillas, jeringas de
insulina.
Envase rojo hermtico
para punzocortantes
El rea temporal de depsito se encuentra previamente sealada en el Laboratorio con el

smbolo universal que lo identifica, todos los recipientes que contienen RPBI deben ser
colocados en estos sitios.
Ejemplos de reas temporales (RPBI) previamente sealadas en el laboratorio
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De acuerdo a la NOM-087-SEMARNAT-SSA1-2002 el personal responsable del manejo de

los RPBI (sangre, cultivos y cepas de agentes infecciosos, patolgicos, residuos no
anatmicos y objetos punzocortantes), realiza otras actividades como es: recoleccin y
transporte al almacn general (por el personal de mantenimiento), almacenamiento y
entrega a la empresa tratadora (Tcnicas medioambientales WINCO), elaboracin de
registros, bitcoras, reportes, capacitacin, monitoreo, disposicin y tratamiento interno y
externo.
Cules son las recomendaciones para llevar a cabo la recoleccin y

el transporte interno de los RPBI?
1.- Recoleccin y Transporte Interno: Consiste en la recoleccin y el traslado de los

desechos desde los sitios de generacin hasta el almacenamiento temporal y final.
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Cules son los requisitos para el almacenamiento temporal?
Una vez realizada la recoleccin interna por el personal encargado, se debern transportar
los residuos al rea especfica denominada almacn temporal, (menos los generadores de
RPBI clasificados en el nivel I de acuerdo con la NOM-087-SEMARNATSSA1-2002). Esta
rea sirve para el acopio y almacenamiento de los residuos, mismos que sern
almacenados dentro de los carros de recoleccin y debern estar rotulados con el smbolo
universal de riesgo biolgico, con la leyenda RESIDUOS PELIGROSOS BIOLGICO-
INFECCIOSOS.
Cul es el periodo de almacenamiento temporal mximo de acuerdo

al nivel del establecimiento generador?
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Existen tres niveles de generacin de residuos segn la Norma Oficial Mexicana NOM-087-
SEMARNAT-SSA1-2002 y los periodos de almacenamiento temporal estn sujetos al nivel
de generacin de los R.P.B.I. como se muestra a continuacin.
NIVEL I NIVEL II NIVEL III
Unidades hospitalarias de 1 a Unidades hospitalarias de 6 Unidades hospitalarias de

5 camas e instituciones de hasta 60 camas; ms de 60 camas;
investigacin con excepcin
de los sealados en el Nivel Laboratorios clnicos y bancos Centros de produccin e
III. de sangre que realicen investigacin
anlisis de 51 a 200 muestras experimental en
Laboratorios clnicos y bancos al da; enfermedades
de sangre que realicen infecciosas;
anlisis de 1 a 50 muestras al Bioterios que se dediquen a la
da. investigacin con agentes Laboratorios clnicos y
biolgico-infecciosos, o bancos de sangre que
Unidades hospitalarias realicen anlisis a ms de
psiquitricas. Establecimientos que generen 200 muestras al da, o
de 25 a 100 kilogramos al
Centros de toma de muestras mes de RPBI. Establecimientos que
para anlisis clnicos. generen ms de 100
kilogramos al mes de
RPBI.
El periodo de almacenamiento temporal estar sujeto al tipo de establecimiento generador,

como sigue:
(a) Nivel I: Mximo 30 das.
(b) Nivel II: Mximo 15 das.
(c) Nivel III: Mximo 7 das.
Qu se debe hacer para realizar la recoleccin y transporte externo

de los RPBI?
La recoleccin y el transporte externo de los RPBI, deber realizarse conforme a lo
dispuesto en los ordenamientos jurdicos aplicables y adems cumplir con lo siguiente:
1. Slo podrn recolectarse los residuos que cumplan con el envasado, embalado y
etiquetado o rotulado como se establece en la Norma.
2. Los residuos peligrosos biolgico-infecciosos no debern ser compactados durante su

recoleccin y transporte.
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3. Los contenedores deben ser desinfectados y lavados despus de cada ciclo de

recoleccin.
4. Los vehculos recolectores deben ser de caja cerrada y hermtica, contar con sistemas
de captacin de escurrimientos, y debern contar con sistemas de refrigeracin para
mantener los residuos a una temperatura mxima de 4 C.
5. Adems los vehculos con capacidad de carga til de 1,000 kg o ms debern operar
con sistemas mecanizados de carga y descarga.
6. Durante su transporte, los RPBI sin tratamiento no debern mezclarse con ningn otro
tipo de residuos.
En qu consiste el tratamiento de RPBI?

Los RPBI sern tratados por mtodos fsicos o qumicos que garanticen la eliminacin de
microorganismos patgenos y deben hacerse irreconocibles para su disposicin final en los
sitios autorizados.
Cuando un objeto tiene agentes biolgico-infecciosos se dice que es un objeto sptico.

Cuando una cosa est libre de estos agentes se dice que es un material asptico, es
decir, que hay asepsia. Cuando se aplican medidas para eliminar a estos agentes se dice
que se aplica antisepsia. Estas medidas pueden ir desde el aseo o limpieza, la higiene, la
desinfeccin, o la esterilizacin.
Los mtodos de tratamiento que apliquen tanto a establecimientos generadores como a

prestadores de servicio dentro o fuera de la instalacin del generador, requieren
autorizacin previa de la SEMARNAT, sin perjuicio de lo establecido por la Secretara de
Salud de conformidad a las disposiciones aplicables a la materia.
Norma Oficial Mexicana NOM-003-SSA2-1993, Para la disposicin de sangre humana y

sus componentes con fines teraputicos.
Norma Oficial Mexicana NOM-010-SSA2-1993, Para la prevencin y control de la

infeccin por Virus de la Inmunodeficiencia Humana.
Norma Oficial Mexicana NOM-013-SSA2-1994, Para la prevencin y control de las

enfermedades bucales.
Norma Oficial Mexicana NOM-036-SSA2-2002, Prevencin y control de enfermedades.

Aplicacin de vacunas, toxoides, sueros, antitoxinas e inmunoglobulinas en el humano.
5. Equipo, Instrumental, Material e insumos.

a) Recipientes y bolsas especiales para depsito de RPBI
b) Jeringas, tubos, gasas, asas de inoculacin, caja petri y todo el material que
potencialmente pueda generarse en los diferentes laboratorios y reas generadoras.
6. Metodologa de la sesin.
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Se realizara una introduccin sobre el reglamento para trabajar en los diferentes

laboratorios de la FMP, posteriormente se comentara una descripcin de la NOM-087-
SEMARNAT-SSA1-2002 y se realizara un ensayo con una estacin de destreza que
contenga diferentes residuos producidos en el laboratorio (jeringas, tubos, gasas, asas de
inoculacin, caja petri y punzocortantes) para que el alumno identifique y disponga los
residuos peligrosos biolgico-infecciosos (RPBI) con una eficiencia del 100%.
7. Bibliografa.
Ver al final del manual.
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1. Sesin 2: Uso del microscopio ptico y tcnicas de microscopia.
Ser competente en el manejo adecuado del microscopio ptico, observando laminillas e

identificando diferentes tipos de clulas teidas con hematoxilina e inmuno-histoqumica
para que en la prctica mdica pueda realizar un buen uso del microscopio ptico.

Cuestionario
Cules son las diferentes partes del microscopio?
Cul es la diferencia entre las tinciones de hematoxilina e inmuno-histoqumica?
Los resultados deben de ser reportados e interpretados con responsabilidad y tica.
Elaboracin de una conclusin sobre la competencia aprendida.
El microscopio (de micro: pequeo, y scopio: observar) es un instrumento que permite

observar objetos que son demasiado pequeos para ser vistos a simple vista. El tipo ms
comn y el primero que se invent es el microscopio ptico. Se trata de un instrumento
ptico que contiene una o varios lentes que permiten obtener una imagen aumentada del
objeto y que funciona por refraccin. La ciencia que investiga los objetos pequeos
utilizando este instrumento se llama microscopa. En general, cualquier microscopio
requiere los siguientes elementos: una fuente (como un haz de fotones o de electrones),
una muestra sobre la que acta dicha fuente, un receptor de la informacin proporcionada
por la interaccin de la fuente con la muestra, y un procesador de esta informacin (en
general, una computadora). Las partes que tiene un microscopio son las siguientes: los
oculares, el cabezal, el brazo, los objetivos, un condensador, el macrmetro y micrmetro,
la base, la platina y una fuente de luz.
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Figura 1: Se muestran las diferentes partes que componen el microscopio ptico.

Dadas las dimensiones extremadamente pequeas de los objetos materiales que estudia,
la biologa celular y molecular depende ms de instrumentos y tcnicas en comparacin a
cualquier otra rama de la biologa.
Por consiguiente, para estudiar estas materias es necesario conocer y manejar

adecuadamente un microscopio de luz, instrumento que permiti a los bilogos descubrir la
existencia fsica de la clula. Adicionalmente al uso del microscopio ptico tradicional,
existen tcnicas avanzadas de microscopa que nos permiten visualizar de una manera
ms precisa la estructura interna de la clula, ya sea porque permiten un grado mayor de
resolucin de la imagen o por resaltar ciertos componentes o compartimientos celulares.
Las tcnicas de microscopa ptica por contraste de fase e interferencia diferencial utilizan
las diferencias en el modo de transmisin de la luz a travs de regiones celulares con
diferente ndice de refraccin. El uso de marcadores fluorescentes que se fijan a molculas
especficas, permite su visualizacin al absorber la luz de una cierta longitud de onda y
emitirla en otra longitud de onda (ms larga). Las tcnicas de microscopa electrnica
permitan visualizar estructuras celulares ms all de la limitacin impuesta por la longitud
de onda de la luz visible (200 nm) (microscopa electrnica de transmisin), y es posible
incluso observar estructuras de manera tridimensional (microscopa electrnica de barrido).
Tincin de hematoxilina
La hematoxilina (C.I. 75290) es un compuesto que se obtiene de la planta leguminosa

Haematoxylum campechianum L., conocida tambin con el nombre de palo de Campeche.
Es un producto natural que al ser oxidado constituye una substancia de color morado
oscuro denominada hematena. Se utiliza en histologa para teir los componentes
aninicos (cidos) de los tejidos, a los que da una coloracin violeta. Tie intensamente los
ncleos de las clulas, dado que estos contienen cidos nucleicos ricos en radicales
cidos. Si bien la hematoxilina es una sal neutra, suele ser denominada como un colorante
bsico, ya que el componente cromgeno reside en el complejo catinico (bsico) de la
misma. Es de notar que la tincin histolgica por hematoxilina no indica la constitucin
qumica de los componentes celulares, sino la densidad de cargas elctricas negativas de
los mismos.
10x 40x
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100x
Figura 2: Microscopio ptico: Se muestran tres cortes de crvix observados con diferentes
lentes (10X, 40X y 100X) teidos con hematoxilina.
Inmuno-histoqumica
La inmuno-histoqumica es un estudio histopatolgico que se basa en la utilizacin de un

anticuerpo especfico, previamente marcado mediante un enlace qumico con una enzima
que puede transformar un sustrato en visible, sin afectar la capacidad del anticuerpo para
formar un complejo con el antgeno, aplicado a una muestra de tejido orgnico,
correctamente fijada e incluida en parafina. El complejo antgeno - anticuerpo as formado,
mediante la utilizacin de alguna de las tcnicas especficas (peroxidasa, antiperxidas,
fluorescena, etc.), permite ser localizado e identificado dentro de las muestras tisulares o
citolgicas a estudiar, logrando la identificacin de marcadores antgenos caractersticos de
distintas lneas de diferenciacin y funcionalismo celular, con lo que se determina el tipo de
clula involucrado en la muestra.
10x 40x
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100x
Figura 3: Microscopio ptico: Se muestran tres cortes de crvix observados con diferentes
lentes (10X, 40X y 100X) teidos por inmuno-histoqumica.
Figura 4: Imgenes de la misma

clula utilizando diferentes
tcnicas de microscopa ptica:
Superior: microscopa
ptica convencional;
Central: contraste de
fase;
Inferior: interferencia
diferencial.
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Figura 5: Imgenes de microscopa utilizando marcadores fluorescentes para

componentes celulares especficos. Izquierda: filamentos de actina; Central:
microtbulos; y Derecha: filamentos intermedios.
Figura 6: Microscopa electrnica. Izquierda: Imagen de barrido del estereocilio de una

clula del odo interno; Derecha: Imagen de transmisin de una mitocondria.
5. Equipo, instrumental, material e insumos.

Microscopio ptico.
Laminillas con diferentes tipos celulares.
Papel y lquido para limpieza de lentes de microscopio.
Aceite de inmersin.
Imgenes representativas de los diferentes tipos de microscopa avanzada.
Bata larga
Guantes de ltex
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Lentes protectores
A. El alumno (a) deber dominar los siguientes temas antes de iniciar la prctica:
1. Unidades y equivalencias correspondientes a micrmetros (m) y nanmetros (nm)
2. Cuanto miden generalmente las clulas procariotas y las eucariotas
3. Cul es la longitud de onda del espectro visible en humanos
B. El instructor (a) mostrar imgenes representativas de cada una de las tcnicas

avanzadas de microscopa.
C. El instructor (a) mostrar los elementos ms importantes de un microscopio ptico.
D. Se observarn diferentes laminillas bajo el microscopio con el siguiente procedimiento:

a) Coloque la laminilla sobre la platina en el centro, deslizando los clips
sujetadores.
b) Verifique que el objetivo que est colocado para la visualizacin sea el de
menor aumento.
c) Coloque mediante el movimiento de la platina la muestra de estudio en el
centro.
d) Mediante el ajuste macromtrico y bajo la visin directa de la platina, acercar la
platina al objetivo hasta alcanzar una distancia de 2 mm. aproximadamente
entre el cubreobjetos y el objetivo.
e) Posteriormente viendo a travs del ocular y usando el ajuste micromtrico,
enfocar la muestra a observar. Ajustar el diafragma para mejorar la iluminacin.
f) Una vez observando las caractersticas de la muestra con el objetivo menor,
cambiar el objetivo por el siguiente de mayor aumento. Enfocar la imagen con
el ajuste micromtrico y observar la diferencia.
g) Barrer la muestra a travs de movimientos de arriba hacia abajo en forma de
ondas.
h) Cambie nuevamente el objetivo hacia el de mayor aumento. Ajuste
nuevamente la imagen con el ajuste micromtrico y ajuste el diafragma para
mejor iluminacin.
ES IMPORTANTE EL SEGUIMIENTO DE ESTOS PASOS PORQUE DE ESTO DEPENDE

EL XITO DE LA OBSERVACIN AL MICROSCOPIO.
E. Los alumnos (as) observarn y realizarn un dibujo de lo observado de las laminillas de

diferentes tipos celulares.
7. Bibliografa.
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1. Sesin 3: Preparacin de soluciones y manejo de bscula analtica

y pHmetro.
Ser competente en la utilizacin de la balanza y del manejo y calibracin del pHmetro,

comprender los conceptos de molaridad, pH y nmero de Avogadro, as como la
importancia de elaborar soluciones en el rea de investigacin, para que en la prctica
mdica pueda preparar soluciones con exactitud.
3. Mecanismos de evaluacin y Evidencia de desempeo.

Cuestionario
Cules son las diferentes partes de la balanza analtica?
Qu es molaridad, pH y nmero de Avogadro?
Como se puede ajustar el pH a una solucin?
Calidad de las notas de su cuaderno de prcticas.
Y calidad del reporte.

Las soluciones son utilizadas ampliamente en el rea de investigacin dada la posibilidad
de mantener las clulas en un medio semejante al lquido extracelular, lo que permite la
viabilidad y sobrevivencia de las mismas. Estas soluciones varan en su composicin
dependiendo del tipo celular con el que se trabaje ya que algunas se enriquecen con
aminocidos y albmina para mantener sus membranas.
La caracterstica de estas soluciones es la exactitud con la que se preparan tanto en su

composicin como en su pH y osmolaridad. El pH con el que se trabaja para cualquier tipo
celular es de 7.4 y una osmolaridad de 280-290 mOsm/L.
a) Balanza
b) Esptula
c) Vaso de precipitados de 500 ml
d) Agitador magntico
e) Mosca para agitacin
f) Cilindro graduado de 500 mL
g) Matraz aforado de 250 mL
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h) pHmetro electrnico
i) Soluciones de calibracin para pHmetro (pH 4, pH 7 y pH 10)
j) Agua desionizada
k) Solucin de hidrxido de sodio 1M y 100 mM
l) HCl concentrado
m) NaCl
n) NaHCO3
o) KCl
p) CaCl2
q) MgSO4
r) KH2PO4
s) Acetato de Sodio
t) Glucosa
1. El alumno (a) deber dominar los siguientes conceptos antes de iniciar la prctica:
a) Moles y soluciones molares
b) Nmero de Avogrado
c) pH
d) Amortiguadores (Buffers)
2. El instructor (a) realizar una demostracin prctica de las siguientes destrezas:

a) Preparacin de una solucin
b) Calibracin, uso y cuidados del pHmetro
c) Los alumnos (as) organizados en equipos de trabajo procedern a preparar
soluciones conforme a las instrucciones del profesor (a).
Para la elaboracin de las soluciones se harn los clculos correspondientes para cada sal
y as pesar la cantidad requerida. Una vez hechos los clculos se proceder a pesar cada
sal. Estas sales se colocarn en el vaso de precipitado. Se agregar agua desionizada y
con un agitador magntico se agitar la solucin hasta disolver las sales. Una vez disueltas
las sales se proceder a la lectura de pH y se ajustar al volumen final. La solucin se
llevar a un pH final de 7.4 con HCl y/o hidrxido de sodio.
7. Bibliografa.
GC-FR-012 Rev. 3
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1. Sesin 4: Fragilidad osmtica del eritrocito.

Comprender los conceptos de fragilidad osmtica de la membrana eritrocitaria, as como
la importancia de los detergentes en las membranas celulares, para que en la prctica
mdica pueda entender el efecto que tienen los diferentes medicamentos sobre los
eritrocitos.

Cuestionario
Qu es una solucin hipotnica?
Qu es una solucin hipertnica?
Qu es una solucin isotnica?
Calidad del reporte.

La membrana eritrocitaria es la ms sencilla de las membranas celulares. Esta consta de
una doble capa lapida y un esqueleto proteico en su cara citoplasmtica. La morfologa del
eritrocito depende de la osmolaridad del medio en que se encuentra. En condiciones
fisiolgicas (osmolaridad de 290 mOsm/Kg), el eritrocito tiene forma de disco bicncavo.
En esta prctica se visualizarn al microscopio los cambios morfolgicos del eritrocito en

medios hper-, normo- e hipo-osmolares.

Equipo:
a) Microscopio ptico
Material:
a) Laminillas portaobjetos
b) Cubreobjetos
c) Papel y lquido para limpieza de lentes de microscopio.
d) 4 tubos de microcentrifuga de 1.6 mL
e) 1 Jeringa de 10 mL con aguja
f) Torniquete para venoclisis
g) 1 tubo recolector de sangre con EDTA o heparina
h) Recipiente hermetico rojo para productos contaminados con sangre
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Insumo:
a) Aceite de inmersin.
b) 500 ml de Solucin estril de NaCl al 1.8%
c) Agua destilada
d) 20 ml de solucin de sodio-dodecil-sulfato (SDS) al 0.1%
e) Antisptico para limpieza de piel antes de la venopuncin
1. Antes de la prctica, el alumno estudiar los conceptos de smosis, difusin y los

principales tipos de transporte de solutos a travs de las membranas celulares.
2. Se obtendr sangre fresca (aprox. 5 mL) de uno de los alumnos del subgrupo,
utilizando la tcnica apropiada de venopuncin y se transferir la sangre a un tubo
conteniendo EDTA o heparina.
3. Preparar una solucin NaCl al 1.8% en 1.5ml de agua desionizada.
4. A partir de la solucin NaCl al 1.8%, realizar diluciones para obtener las soluciones
de NaCl al 0.9% y al 0.45%.
5. Agregar 1 gota de SDS al 0.1% a una de las soluciones al 0.9%.
6. Colocar 1 gota de sangre a cada una de las soluciones. Mezcle con cuidado.
7. Aplique 1 gota de cada una de las suspensiones obtenidas en una laminilla
portaobjetos y cubra cuidadosamente con un cubreobjetos. Visualice la morfologa
eritrocitaria al microscopio.
7. Bibliografa.
GC-FR-012 Rev. 3
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1. Sesin 5: Tecnologa de DNA recombinante (clase terica).

Comprender las principales tcnicas utilizadas en biotecnologa celular y el impacto de la
misma en la medicina moderna, para que en la prctica mdica pueda realizar proyectos
de investigacin en biologa celular.

Un artculo por alumno para traduccin y exposicin en las prximas sesiones, relacionado
con la clase de biologa celular y las metodologas presentadas en la sesin de Tecnologa
de DNA recombinante.
Discutir los resultados de la prctica.
Entrega del reporte de la conclusin de la prctica.
Las ciencias de la salud han experimentado un gran desarrollo en las dos ltimas dcadas;
la aplicacin de la biotecnologa y la biologa molecular ha abierto un prometedor panorama
en el que las posibilidades de desarrollar nuevas estrategias diagnsticas y teraputicas se
incrementan da a da. La decodificacin del genoma humano y de otros organismos, ha
incrementado el entendimiento (incluso hasta el nivel molecular) de diferentes procesos
fisiolgicos y pato-fisiolgicos. Mxico no se puede dar el lujo de ser indiferente y pasivo en
el umbral de esta revolucin cientfica; son muy grandes las posibilidades que ofrece en
cuanto al cuidado de la salud y es absolutamente indispensable aprovecharlas. Las
consecuencias de invertir ahora en la formacin de recursos humanos calificados no solo
se reflejarn en un mejor estado de salud de la poblacin, sino que adems tendrn un
impacto financiero enorme, ya que al comparar los costos de prevencin de enfermedades
frecuentes, frente a los costos de tratamiento crnico y de rehabilitacin de sus secuelas y
las bajas en la fuerza productiva del pas, resulta en un balance econmico muy favorable.
El no apoyar adecuadamente las ciencias de la salud con un enfoque hacia la

biotecnologa convertira a nuestro pas en simple espectador de los descubrimientos
mdicos que se vislumbran, y lo que es peor, lo convertira en un simple consumidor
cautivo de los productos o estrategias desarrollados en otros pases.
Tcnicas ms importantes en biologa celular.
La centrifugacin es un mtodo por el cual se pueden separar slidos de lquidos de

diferente densidad mediante una fuerza rotativa, la cual imprime a la mezcla con una fuerza
mayor que la de la gravedad, provocando la sedimentacin de los slidos o de las
partculas de mayor densidad. El objetivo de la centrifugacin es separar slidos insolubles
(de partculas muy pequeas difciles de sedimentar) de un liquido. Para ello, se aplica un
fuerte campo centrfugo, con lo cual las partculas tendern a desplazarse a travs del
medio en el que se encuentren con la aceleracin.
GC-FR-012 Rev. 3
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La purificacin de DNA es un paso clave en la experimentacin en Biologa Molecular.

Los mtodos de purificacin de DNA se clasifican en dos grandes categoras, segn
pretendan purificar DNA cromosmico o DNA plasmdico. La purificacin de DNA
plasmdico es la base de cualquier experimento de clonacin molecular. El problema
principal que hay que resolver es la separacin del DNA plasmdico y DNA cromosmico.
En esta prctica hemos elegido el mtodo de lisis alcalina, por su simplicidad, bajo coste
y reproducibilidad.
La electroforesis en agarosa permite separar molculas de DNA, cuando stas son

sometidas a un campo elctrico y atradas hacia el polo opuesto a su carga neta. Hay dos
fuerzas de accin opuesta que determinan la velocidad de la partcula. Primero, la fuerza
elctrica atrae en DNA hacia el electrodo y la intensidad de la atraccin es directamente
proporcional a la carga. Segundo, la fuerza de rozamiento se opone a la migracin y su
intensidad depende del tamao y la forma de la partcula.
Una enzima de restriccin (o endonucleasas de restriccin) es aquella que puede

reconocer una secuencia caracterstica de nucletidos dentro de una molcula de ADN y
cortar el ADN en ese punto en concreto, llamado sitio o diana de restriccin, o en un sitio
no muy lejano a ste, dependiendo de la enzima. Los sitios de restriccin cuentan con
entre 4 y 12 pares de bases, con las que son reconocidos. El mecanismo de corte de DNA
se realiza a travs de la ruptura de dos enlaces fosfodister en la doble hebra, lo que da
lugar a dos extremos de DNA. stos pueden ser romos (cuando los enlaces rotos
coinciden) o Cohesivos/escalonados. Estos ltimos tienen tendencia a volver a unirse de
modo espontneo, ya que los extremos se pueden unir a otros extremos coincidentes que
pueda haber en la cercana.
En biologa molecular, transformacin es la alteraciones genticas resultantes de

introducir ADN por virus (transduccin) o por contactos intercelulares entre bacterias
(conjugacin). A la transformacin de clulas animales se le llama transfeccin. El trmino
transformacin es tambin usado, de manera ms general, para describir mecanismos de
transferencia de ADN o ARN en biologa molecular (es decir, teniendo en cuenta ms que
las consecuencias genticas). Por ejemplo la produccin de transgnicos como maz
transgnico requiere la insercin de nueva informacin gentica en el genoma del maz
usando el mecanismo apropiado de transferencia de ADN; el proceso se le llama
comnmente transformacin.
La clonacin del DNA puede definirse como la recombinacin in vitro de un fragmento de

DNA con un DNA vector con capacidad de replicacin autnoma. El fragmento de DNA
se replicar junto con el DNA vector en la clula hospedadora y as ser posible obtenerlo
en un nmero elevado de copias.
Las etapas bsicas son:
1) Extraccin y fragmentacin especfica del DNA del organismo que nos interesa.
2) Unin de los fragmentos de DNA: fragmento del DNA que nos interesa + vector de
transformacin y replicacin.
3) Introduccin en las clulas receptoras del DNA recombinante.
4) Seleccin de colonias aisladas que porten molculas de DNA recombinante.
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La secuenciacin de ADN es un conjunto de mtodos y tcnicas bioqumicas cuya

finalidad es la determinacin del orden de los nucletidos (A, C, G y T) en un
oligonucletido de ADN. La secuencia de ADN constituye la informacin gentica
heredable del ncleo celular, los plsmidos, la mitocondria y cloroplastos (En plantas) que
forman la base de los programas de desarrollo de los seres vivos. As pues, determinar la
secuencia de ADN es til en el estudio de la investigacin bsica de los procesos
biolgicos fundamentales, as como en campos aplicados, como la investigacin forense.
El desarrollo de la secuenciacin del ADN ha acelerado significativamente la investigacin
y los descubrimientos en biologa. Las tcnicas actuales permiten realizar esta
secuenciacin a gran velocidad, lo cual ha sido de gran importancia para proyectos de
secuenciacin a gran escala como el Proyecto Genoma Humano. Otros proyectos
relacionados, en ocasiones fruto de la colaboracin de cientficos a escala mundial, han
establecido la secuencia completa de ADN de muchos genomas de animales, plantas y
microorganismos.
La reaccin en cadena de la polimerasa, conocida como PCR por sus siglas en ingls
(Polymerase Chain Reaction), es una tcnica de biologa molecular desarrollada en 1986
por Kary Mullis, cuyo objetivo es obtener un gran nmero de copias de un fragmento de
ADN particular, partiendo de un mnimo; en teora basta partir de una nica copia de ese
fragmento original, o molde.Esta tcnica sirve para amplificar un fragmento de ADN; su
utilidad es que tras la amplificacin resulta mucho ms fcil identificar con una muy alta
probabilidad virus o bacterias causantes de una enfermedad, identificar personas
(cadveres) o hacer investigacin cientfica sobre el ADN amplificado. Estos usos
derivados de la amplificacin han hecho que se convierta en una tcnica muy extendida,
con el consiguiente abaratamiento del equipo necesario para llevarla a cabo.
El Western blot, o inmunoblot, es una tcnica analtica usada para detectar protenas
especficas en una muestra determinada (una mezcla compleja de protenas, como un
extracto tisular). Mediante una electroforesis en gel se separan las protenas atendiendo al
criterio que se desee: peso molecular, estructura, hidrofobicidad, etc. Hay casi tantas
posibilidades como tipos de electroforesis existen. Luego son transferidas a una membrana
adsorbente (tpicamente de nitrocelulosa o de PVDF) para poder buscar la protena de
inters con anticuerpos especficos contra ella. Finalmente, se detecta la unin antgeno-
anticuerpo por actividad enzimtica, fluorescencia... De esta forma se puede estudiar la
presencia de la protena en el extracto y analizar su cantidad relativa respecto a otras
protenas. Esta tcnica es hoy en da imprescindible en varios campos de la biologa, como
la biologa molecular, la bioqumica, la biotecnologa o la inmunologa. Existe toda una
industria especializada en la venta de anticuerpos (monoclonales y policlonales) contra
decenas de miles de protenas diferentes.
La terapia gnica consiste en la insercin de copias funcionales de genes defectuosos o

ausentes en el genoma de un individuo. Se realiza en las clulas y tejidos con el objetivo
de tratar una enfermedad. La tcnica todava est en desarrollo, motivo por el cual su
aplicacin se lleva principalmente a cabo dentro de ensayos clnicos controlados, y para el
tratamiento de enfermedades severas, bien de tipo hereditario o adquirido.
Terapia gnica somtica: se realiza sobre las clulas somticas de un individuo,

por lo que las modificaciones que implique la terapia slo tienen lugar en dicho
paciente.
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Cdigo

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Terapia in vivo: la transformacin celular tiene lugar dentro del paciente al

que se le administra la terapia. Consiste en administrarle al paciente un
gen a travs de un vehculo (por ejemplo un virus), el cual debe localizar
las clulas a infectar. El problema que presenta esta tcnica es que es muy
difcil conseguir que un vector localice a un nico tipo de clulas diana.
Terapia ex vivo: la transformacin celular se lleva a cabo a partir de una
biopsia del tejido del paciente y luego se le trasplantan las clulas ya
transformadas. Como ocurre fuera del cuerpo del paciente, este tipo de
terapia es mucho ms fcil de llevar a cabo y permite un control mayor de
las clulas infectadas. Esta tcnica est casi completamente reducida a
clulas hematopoyticas pues son clulas cultivables, constituyendo as un
material transplantable.
Terapia gnica germinal: se realizara sobre las clulas germinales del paciente,
por lo que los cambios generados por los genes teraputicos seran hereditarios.
No obstante, por cuestiones ticas y jurdicas, sta clase de terapia gnica no se
lleva a cabo hoy en da.

No aplica
El instructor (a) expondr la clase terica sobre las tcnicas ms importantes en
biologa celular.
Centrifugacin y separacin de organelos.

Purificacin de DNA
Electroforesis en agarosa
Enzimas de restriccin
Transformacin
Clonacin de DNA
Secuenciacin de ADN
Reaccin de polimerasa en cadena
Western, Northern y Southern- Blot
Anlisis de huellas digitales de DNA
Terapia gnica
7. Bibliografa.
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Cdigo

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1. Sesin 6: Manejo de micropipetas.
Ser competente en el manejo adecuado de las micropipetas y la importancia en

experimentacin de la exactitud en el volumen de los reactivos, para que en la prctica
mdica pueda realizar un buen uso de la nanociencia.

Cuestionario
Qu es nanociencia?
Cmo se puede descalibrar una micropipeta?
Cules son las diferentes partes de la balanza analtica?
Exposicin y discusin del artculo por los alumnos.

El uso preciso de micropipetas es de suma trascendencia en las tcnicas de biologa
molecular. La mayora de las reacciones involucran volmenes muy pequeos (en el orden
de los microlitros L-) por lo que cualquier error en la manipulacin de los mismos puede
generar errores difciles de detectar e incluso afectar el resultado final del experimento.
Las micropipetas automticas nos han aportado mayor practicidad y bioseguridad. Una
mayor velocidad para dispensar muestras y reactivos con excelente precisin y sin
posibilidad de contaminacin entre ellos; en tcnicas donde el tiempo operativo resultaba
crtico, como ser en reacciones enzimticas. Tiempo despus, la gran mayora de estas
pruebas de laboratorio fueron automatizadas.
Dems est decir su excelente practicidad, precisin y seguridad cuando se desarrollaron

las tcnicas inmunoanalticas, mucho ms aun con el desarrollo de las tcnicas de PCR,
donde han mejorado la calidad de los materiales utilizados en su construccin con la
posibilidad de ser autoclavables En los ltimos 20 aos tomamos mayor conciencia de las
enfermedades a la que podamos estar expuestos en la manipulacin de fluidos biolgicos,
la necesidad de no contaminar ensayos con residuos no deseables para los mismos, el
incremento del nmero de muestras a procesar y por sobre todo, la tendencia de tener un
mayor control sobre la calidad de los ensayos con la utilizacin de pequeos volmenes de
muestra en cada uno de ellos. Fue por ello que los equipos automticos y la generalizada
utilizacin de micropipetas provocaron un cambio fundamental en las prcticas de
laboratorio.
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Cdigo

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Fue tambin, con el nacimiento del inmunoanlisis en la dcada de los aos 60, con
tcnicas isotpicas y posteriormente con las tcnicas no isotpicas en la dcada de los
aos 80, la necesidad de dispensar los reactivos tales como soluciones radiactivas en el
caso de las isotpicas (RIA e IRMA), cumpliendo con las medidas de radioproteccin y las
no isotpicas (EIA y ELISA) para manipular reactivos altamente cancergenos, hicieron que
su utilizacin se transforme en una necesidad imprescindible. Tampoco podemos dejar de
lado la necesidad de una alta precisin requerida para dispensar las muestras, calibradores
y controles de calidad, donde el volumen de los mismos es una consecuencia de las masas
que entran en juego en una inmunoreaccin primaria en el inmunoanlisis; podemos
mencionar a modo de ejemplo que en un ensayo de Estradiol por alguna de las tcnicas
inmunoanalticas, el clculo de la concentracin en una muestra biolgica depender de la
interpolacin de una curva de calibracin comprendida entre menos y ms 2 veces la Kd.
del anticuerpo involucrado en el ensayo. Los volmenes utilizados de los calibradores,
muestras y estndares de ese ensayo son constantes y oscilan entre 50 y 100 L, segn
sea el desarrollo del sistema inmunoanaltico de una empresa productora de reactivos, el
rango de masas de Estradiol en los calibradores estarn comprendidos entre 2 y 200
picogramos contenidos en dichos volmenes.
Es sabido la gran diversidad de marcas, modelos, orgenes o procedencias y precios de las

micropipetas que hoy se ofrece en nuestro mercado y el mundo. Tambin es sabido, los
que hemos pasado muchos aos con el uso de las mismas, de las predilecciones que cada
profesional ha tenido por una marca y/o modelo determinado, probablemente se debi a las
diferencias existentes que haba entre ellas 2 dcadas atrs. Hoy no podemos decir que
hay micropipetas malas o buenas, luego que en el mundo las empresas han globalizado la
produccin en escala, la produccin OEM, los acuerdos entre compaas, la tercerizacin
de distintas etapas de la produccin, muchas marcas histricas europeas o americanas
han derivado parte o la totalidad de su fabricacin a pases asiticos, como tambin nuevas
marcas han aparecido en el mundo en la ltima dcada, todas de muy buena calidad y
teniendo un mismo factor comn: en muchos casos el mismo fabricante y el mismo origen
o pas de procedencia.
Uso correcto de las micropipetas.

Las micropipetas son dispositivos que permiten medir volmenes pequeos que van desde
1 l hasta 1 ml o ms. Al igual que las pipetas stas pueden ser para contener o para
verter volmenes. Durante el curso utilizaremos micropipetas para verter, ya sea un
volumen fijo o un volumen variable. En las de volumen variable, se puede seleccionar un
volumen dentro de un rango de valores determinado. La micropipeta ms comnmente
usada en los laboratorios de biologa celular fue introducida por la compaa Eppendorf y
este nombre se adopt de forma genrica para estos dispositivos, aunque hoy en da
existen una gran cantidad de compaas y modelos similares que funcionan bajo un mismo
principio de pistones para operar. Por lo tanto, es aconsejable consultar las instrucciones
del fabricante sobre el empleo correcto de cada modelo. Sin embargo, todas ellas utilizan
puntas descartables plsticos que se ajustan al extremo de la micropipeta. En estas puntas
de plstico es donde se deposita el lquido a medir.
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Cdigo

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Figura numer 1.
En la figura 1 se presenta el esquema general de las micropipetas a utilizar durante el

curso. A1: botn pulsador, A2: tornillo del botn pulsador, B: rueda dentada de graduacin
del volumen, C: cono de la pipeta, D: expulsor de punta y E: punta o tip descartable. Para
absorber el lquido, el pistn es presionado hasta una primera posicin, el tip es puesto en
contacto con el lquido y luego, lentamente, se permite que el pistn vuelva a su posicin
original. Este paso permite el llenado del tip con el volumen correspondiente. El tip de
plstico generalmente no se seca por fuera ya que se considera que su superficie no
absorbe lquido. A continuacin se describen las instrucciones especficas para los
modelos de micropipetas que se utilizarn durante el curso.
1. Seleccin de la micropipeta a utilizar segn el volumen a dispensar. La mayora de la

micropipetas indican en el botn pulsador el rango o volumen mximo que pueden
pipetear. Para prevenir un dao en el mecanismo interno de la micropipeta recuerde nunca
sobrepasar los volmenes mximos permitidos para cada micropipeta.
2. Debido a que la micropipeta tiene un rango de volumen ajustable, es necesario

seleccionar el volumen a medir. Para ello se debe localizar el indicador de volumen,
compuesto de tres dgitos que se deben leer de arriba hacia abajo. En la parte ms baja del
indicador hay una escala que permite el ajuste del volumen al ltimo dgito o decimal
GC-FR-012 Rev. 3
Cdigo

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permitido segn el caso. En las micropipetas de 2 hasta 200 l, los dgitos negros indican
microlitros y los dgitos rojos representan dcimas de microlitro.
3. Ajustar el volumen de la pipeta con el tornillo del botn pulsador (figura 1, A2) o la rueda
de graduacin del volumen (Figura 1, B), hasta llegar a 1/3 por encima del valor deseado.
Luego, lentamente, girando el tornillo o la rueda, disminuir el ajuste hasta el valor deseado
prestando atencin para no excederlo. Si se excede, es aconsejable repetir el
procedimiento de ajuste. Siempre se debe ajustar el volumen deseado desde un volumen
ms alto disminuyendo las indicaciones del indicador.
4. Seleccionar la punta o tip plstico apropiado para la micropipeta: la punta debe ajustarse
al cono de la micropipeta (figura 1). Al insertar la punta en el cuerpo de la pipeta hay que
aplicar una fuerte presin con movimiento giratorio para asegurar la hermeticidad. Nunca
usar la pipeta con lquidos sin la punta colocada. Es posible que la punta plstica se
encuentre en una caja tambin plstica que facilita su uso. Si la punta no queda bien
ajustada o no est en caja, deber ajustarse con la mano sin tocar la superficie que estar
en contacto con la solucin a extraer.
5. Aspiracin: apretar el botn pulsador hasta el primer tope (figura 2, A)
6. Con la pipeta en posicin vertical, sumergir la punta entre 1 mm y 3 mm en la muestra.
7. Lentamente se aspira el lquido al relajar la presin del dedo sobre el botn pulsador
(figura 2, B). Si este paso no se realiza con atencin, puede entrar
aire en la punta y la cantidad de muestra aspirada no es la adecuada.
8. Esperar un segundo y retirar la punta del lquido.
9. Dosificacin: colocar la parte inferior de la punta contra la pared interior del recipiente
donde se depositar el lquido, con un ngulo entre 10o y 40 o.
10. Apretar el botn pulsador suavemente hasta el primer tope (figura 2, C) y esperar un
segundo.
11. Apretar el botn pulsador hasta el segundo tope para vaciar el resto del lquido (figura
2, D).
12. Manteniendo apretado el botn pulsador en el segundo tope, retirar la pipeta

deslizando la punta por la pared del recipiente. Soltar luego el botn pulsador (figura 2, E).
13. Expulsar la punta apretando el botn del expulsor (figura 2, F y figura 2, D).
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Figura numer 2.
Posiciones de la micropipeta a la hora de medir un volumen especfico. A: Botn pulsador

en el primer tope, B: la punta de la micropipeta es sumergida entre 1 mm y 3 mm en la
muestra para luego liberar el botn pulsador suavemente hasta su posicin original, C:
Forma correcta de dispensar el lquido medido en el recipiente correspondiente, D:
Posicin de la micropipeta al apretar el botn pulsador hasta el segundo tope, E: Vuelta a
la posicin inicial, F: Expulsin de la punta, la cual debe ser descartada en un recipiente
apropiado.
Para no daar el sistema interno de pistones que posee la micropipeta:
-el luido nunca debe entrar en contacto con el cono de la micropipeta

-nunca vuelque la micropipeta con la parte de arriba hacia abajo
-nunca coloque la micropipeta en forma horizontal si la punta tiene lquido
-nunca ajuste el volumen fuera del rango de la micropipeta
Con respecto a la micropipeta multicanal, stas tienen la ventaja de que se puede pipetear
el mismo volumen al mismo tiempo en varios recipientes a la vez.
Estas micropipetas fueron diseadas principalmente para los ensayos en formato micro,
donde se utiliza tambin un plato de plstico de 96 pozos para trabajar esa cantidad de
ensayos de forma simultnea. Las micropipetas multicanal son dispositivos ms complejos
que las micropipetas unicanal ya que bsicamente pueden repetir varias veces la funcin
que realiza esta ltima en un solo momento. Para ello, poseen un solo mango, botn
pulsador, etc pero un cono que permite la insercin de 4 hasta 12 puntas al mismo tiempo.
En el curso se utilizarn micropipetas multicanales (12 canales) con un rango de volumen
de 50 l a 300 l similares a las de la figura 3. Para su uso, se deben tener los mismos
cuidados que con las micropipetas unicanal, adems de cerciorarse que todas las puntas
estn bien colocadas, extrayendo la misma cantidad de solucin y que no se observen
burbujas de aire en ninguna.
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Figura 3. Micropipeta multicanal (8 canales), modelo Biohit de rango de volumen de 50 l a

300 l. Este tipo de micropipeta es muy til para microensayos semi automatizados o
automatizados en platos descartables de 96 pozos.
a) Balanza
b) Micropipetas y puntillas de 100 L y 1000 L.
c) Vasos de precipitado 100 mL
GC-FR-012 Rev. 3
Cdigo

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1.- El alumno deber dominar las unidades y equivalencias correspondientes a mililitros
(mL) y microlitos (L) antes de iniciar la prctica.
2.- El instructor realizar una demostracin prctica del uso de micropipetas.
3.- Cada alumno (a) utilizar las pipetas para cargar diferentes volmenes en un vaso de
precipitado y pesarlo en la balanza. Se proceder a agregar la cantidad referida por el
instructor (a) hasta completar el volumen establecido y posteriormente retirarlo hasta vaciar
el vaso de precipitado. Se deber consignar el peso obtenido cada vez que se agregue o
retire el volumen tanto durante la carga como durante la descarga del volumen.
7. Bibliografa.
GC-FR-012 Rev. 3
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1. Sesin 7: Purificacin del DNA.
Ser competente en la toma de sangre venosa, as como la importancia de extraer y

cuantificar DNA por medio de la medicin del radio de absorcin 260/280 en el
espectrofotmetro, para que en la prctica mdica pueda realizar un buen uso de diferente
instrumental de laboratorio para investigacin o diagnstico.

Cuestionario
Qu es DNA?
Cmo se cuantifica el DNA?
Cules son los diferentes equipos que se utilizan para cuantificar el DNA?
Discutir los resultados de la prctica.
Entrega del reporte de la discusin de la prctica.
El kit DNeasy utiliza tecnologa avanzada con membranas-geles de silicn para una
purificacin rpida y eficiente de DNA celular. El sistema buffer esta optimizado para
permitir la lisis celular seguida de unin selectiva de DNA a la membrana DNeasy. La
centrifugacin remueve completamente a los contaminantes e inhibidores enzimticos
como las protenas y cationes divalentes.
El procedimiento DNeasy es sencillo. Las muestras son sometidas a lisis utilizando

proteinasa K. Las condiciones de amortiguamiento son las apropiadas para la unin del
DNA a la membrana. Despus de una centrifugacin breve los contaminantes pasan a
travs de la membrana y los contaminantes remanentes son removidos en 2 fases de
lavado. El DNA purificado con DNeasy presenta un radio A260/A280 en el rango de 1.7 a
1.9.
Equipo:
a) Micro centrfuga
Material:
a) Buffers necesarios para purificacin de DNA de una muestra de sangre venosa,
segn el kit DNeasy de Qiagen
b) Buffer PBS
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c) Mini columnas en tubos de 2mL
d) Tubos de micro centrfuga de 1.6 mL
e) 1 Jeringa de 10 mL con aguja
f) Torniquete para venoclisis
g) 1 tubo recolector de sangre con EDTA o heparina
h) Micropipeta de 10L con pipetas desechables
i) Contenedor para productos contaminados con sangre
j) Marcador permanente de laboratorio (sharpie)
Insumo:
a) Proteinasa K
b) Antisptico para limpieza de piel antes de la venopuncin
c) Bao mara a 37 C
d) CTAB (Hexadecyltrimethylamonio bromuro)
1.-Se obtendr sangre fresca (aprox. 5 ml) de uno de los alumnos del subgrupo, utilizando
la tcnica apropiada de venopuncin y se transferir la sangre a un tubo conteniendo EDTA
o heparina.
2.- Agregar 20 L de proteinasa K a un tubo de micro centrfuga de 1.5mL con CTAB 10%.
3.- Aadir 150 L de sangre anticoagulada al tubo de 1.5mL y 50 Lde PBS.
4.- Agregar 200 L de buffer AL. Mezcle por medio de vrtex por pulso por 15 s.
5.- Incubar a 56 C por 10 min.
6.-Centrifugar brevemente (shortspin) para remover los residuos de la tapadera.
7.-Aadir 200 L de etanol (96-100%) a la muestra y mezclar por vrtex de pulso por 15s.
Despus de mezclar, centrifugar brevemente.
8.- Agregar el contenido de la muestra a una columna con membrana (en un tubo de 2mL),
cierre la tapadera y centrifugue a 8000 rpm por 1min. Coloque la columna en un tubo nuevo
de 2mL y elimine el tubo con el filtrado.
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9.- Cuidadosamente abra la tapadera de la columna y aada 500 L de buffer AW1. Cierre
la tapadera y centrifugue a 8000 rpm por 1 min. Coloque la columna en un tubo nuevo y
elimine el filtrado.
10.- Abra cuidadosamente la tapadera de la columna y aada 500 l de buffer AW2. Cierre
la tapadera y centrifugue a mxima velocidad por 3 min. Si no hay problemas de AW2
residual, continu con el paso 11, si hay problemas realizar el paso 10.1.
10.1) Opcional. Si hay problemas de buffer AW2 residual, colocar la columna en un tubo
nuevo y eliminar el filtrado. Centrifugar a mxima velocidad por 1 min.
11.-Colocar la columna en un tubo nuevo y eliminar el filtrado. Cuidadosamente abra la

tapadera de la columna y aada 200 l de buffer AE o agua destilada. Incubar a
temperatura ambiente (15-25 C) por 1 min y centrifugue a 8000 rpm por 1 min.
12.- Medir la concentracin de DNA en el espectrofotmetro.
Precauciones especiales:
El buffer AL y AW1 contienen una sal caotrpica (hidrocloruro de guanidina), que puede ser
irritante. El buffer AW2 contiene cido de sodio como preservativo. Este es altamente
txico y puede reaccionar explosivamente con el plomo o cobre de las tuberas.
7. Bibliografa.
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1. Sesin 8: Enzimas de restriccin.
Entender los principios fundamentales de ingeniera gentica, especficamente las enzimas

de restriccin para su uso como herramienta de la biologa molecular. Conocer la forma
de utilizacin de enzimas de restriccin en el laboratorio de Biologa Celular.

Cuestionario
Qu es una enzima de restriccin?
Mencione dos experimentos en donde se pueden utilizar las enzimas de restriccin?
Las tcnicas que se introducen en esta prctica son las bases de las tcnicas de huellas de
DNA (fingerprinting) y anlisis forense de DNA. Pruebas de ADN, utilizacin de restos
orgnicos para identificar el cido desoxirribonucleico (ADN) de una persona. Se ha
realizado un buen nmero de pruebas cientficas que prueban que el ADN es la base de la
herencia, entre las que se pueden destacar: a) en el proceso normal de reproduccin
celular, los cromosomas (estructuras con ADN) se duplican para proporcionar a los ncleos
hijos los mismos genes que la clula madre; b) las mutaciones provocadas se producen por
una alteracin de la estructura del ADN que tienen como efecto una grave alteracin de la
descendencia de las clulas afectadas; c) el ADN extrado de un virus basta por s mismo
para reproducir el virus entero, por lo que parece claro que, en la esfera jurdica y a efectos
legales, tiene toda la informacin gentica para ello. Por todo ello, el ADN puede llegar a
ser muy til en Derecho, no slo para identificar a una persona gracias a los restos
orgnicos encontrados donde se haya cometido un crimen (en especial en delitos contra la
libertad sexual o en los que se ha ejercido violencia), sino tambin para determinar la
filiacin biolgica de una persona.
cido desoxirribonucleico (ADN), material gentico de todos los organismos celulares y

casi todos los virus. El ADN lleva la informacin necesaria para dirigir la sntesis de
protenas y la replicacin. Se llama sntesis de protenas a la produccin de las protenas
que necesita la clula o el virus para realizar sus actividades y desarrollarse. La replicacin
es el conjunto de reacciones por medio de las cuales el ADN se copia a s mismo cada vez
que una clula o un virus se reproducen y transmite a la descendencia la informacin que
contiene. En casi todos los organismos celulares el ADN est organizado en forma de
cromosomas, situados en el ncleo de la clula.
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ESTRUCTURA
Cada molcula de ADN est constituida por dos cadenas o bandas formadas por un
elevado nmero de compuestos qumicos llamados nucletidos. Estas cadenas forman una
especie de escalera retorcida que se llama doble hlice. Cada nucletido est formado por
tres unidades: una molcula de azcar llamada desoxirribosa, un grupo fosfato y uno de
cuatro posibles compuestos nitrogenados llamados bases: adenina (abreviada como A),
guanina (G), timina (T) y citosina (C). La molcula de desoxirribosa ocupa el centro del
nucletido y est flanqueada por un grupo fosfato a un lado y una base al otro. El grupo
fosfato est a su vez unido a la desoxirribosa del nucletido adyacente de la cadena. Estas
subunidades enlazadas desoxirribosa-fosfato forman los lados de la escalera; las bases
estn enfrentadas por parejas, mirando hacia el interior, y forman los travesaos.
Los nucletidos de cada una de las dos cadenas que forman el ADN establecen una
asociacin especfica con los correspondientes de la otra cadena. Debido a la afinidad
qumica entre las bases, los nucletidos que contienen adenina se acoplan siempre con los
que contienen timina, y los que contienen citosina con los que contienen guanina. Las
bases complementarias se unen entre s por enlaces qumicos dbiles llamados enlaces de
hidrgeno. En 1953, el bioqumico estadounidense James Watson y el biofsico britnico
Francis Crick publicaron la primera descripcin de la estructura del ADN. Su modelo
adquiri tal importancia para comprender la sntesis proteica, la replicacin del ADN y las
mutaciones, que los cientficos obtuvieron en 1962 el Premio Nobel de Medicina por su
trabajo.
Equipo:
a) Microcentrfuga
Material:
a) Buffer de restriccin.
b) Tubos de micro centrfugo
c) Marcador permanente de laboratorio (sharpie)
Insumo:
a) Fago Lambda DNA
b) Enzimas de restriccin (Eco RI, Pst I, Hind III, RNApolimerasa)
c) DNA Lambda
d) Bao mara a 37 C
e) Hielo.
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El alumno (a) deber dominar antes de la prctica los temas relacionados con enzimas de
restriccin, funcionamiento y aplicaciones, previamente discutidos en la prctica 6.
1) Tome los eppendorf que contienen la solucin stock de enzimas, DNA lambda y buffer
de restriccin. Mantenga todas las enzimas de restriccin en hielo.
2) Tome un eppendorf de cada color y ponga una etiqueta:
Claro= L = DNA Lambda

Violeta= P = Pst I
Verde= E = Eco RI
Naranja= H = Hind III
Coloque los reactivos en cada tubo de acuerdo a la tabla siguiente:
Tubo DNA Buffer Pst I Eco R1 Hindi
L 4l 6l ---- ------ ---------
P 4 l 5 l 1l ------ --------
E 4 l 5l ---- 1 l -------
H 4 l 5 l ---- ------ 1 l
3) Mezcle los componentes con golpeteo con los dedos

4) Ponga los eppendorf a incubar por 2 horas a bao Mara a 37 C
5) Al terminar coloque las muestras en el refrigerador hasta la siguiente prctica de
laboratorio.
7. Bibliografa.
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1. Sesin 9: Electroforesis de ADN en gel de agarosa.
Ser competente para realizar, monta y correr geles de agarosa por electroforesis, para
que en la prctica mdica pueda realizar un buen uso de diferente instrumental de
laboratorio para investigacin o diagnstico.

Cuestionario
Qu es la agarosa?
Cmo se prepara un gel de agarosa?
Cules es el instrumental que se utiliza para realizar los geles de agarosa?
Correr un gel de agarosa, mtodo utilizado en los laboratorios de Biologa celular y

molecular para diferenciar los distintos cortes del DNA producidos por enzimas de
restriccin, bases de la ingeniera gentica.
La concentracin e integridad del ADN extrado, as como el tamao de distintos
fragmentos de ADN (por ejemplo, productos de PCR) pueden ser verificadas mediante
electroforesis en geles de agarosa o poliacrilamida. La electroforesis consiste en la
separacin de molculas (protenas, isoenzimas, cidos nucleicos) a travs de una matriz
tamponada (agarosa, acrilamida, almidn). La matriz funciona como un filtro, separando las
molculas en un campo elctrico, de acuerdo al tamao y la carga neta que poseen. En el
caso de los cidos nucleicos, el grupo fosfato es el responsable por la fuerte carga negativa
en condiciones de pH neutro, haciendo que los fragmentos migren hacia el polo positivo
(nodo) durante la electroforesis.

Equipo:
a) Cmara para elaboracin de geles
b) Cmara para electroforesis de gel
Material:
a) 1 matraz de Erlenmeyer por equipo.
b) Agitador magntico con temperatura
c) Peine con dientes
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d) Cinta adhesiva de laboratorio

Insumo:
a) Agarosa
b) TAE
c) Mosca para agitacin
El alumno (a) deber dominar antes de la prctica, el tema de electroforesis de DNA,
previamente discutido en prctica 6. Se prepara un gel de agarosa al 0.8% con un grosor
de 0.75 a 1.0 cm. Esto se logra agregando 0.8 g de agarosa a 100 mL de TAE 1X. La
agarosa debe ser disuelta utilizando un buffer de electroforesis, no agua. Cuando el gel de
agarosa ha solidificado, se inicia el cargado de la muestra de DNA para electroforesis.
PREPARACIN DE LA CMARA DE ELECTROFORESIS:

1.- Cuando coloque el gel en la base de la cmara de electroforesis, asegrese que los
orificios para colocar la muestra se encuentran en el ctodo (electrodo negro) al final de la
base. Las muestras de DNA migrarn hacia el nodo (rojo), fin de la base durante la
electroforesis.
2.- Prepare el volumen requerido de buffer de electroforesis 1X (el buffer utilizado para la
electroforesis ser idntico al utilizado para la preparacin del gel).
3.- Sumergir el gel a ms o menos 2 mm de buffer de electroforesis. Con cuidado retire el

peine del gel en una posicin jalndolo de manera recta.
4.- Prepare las muestras para cargar el gel.

5.- Cargue las muestras en los orificios utilizando micropipetas. Coloque 10L de cada tubo
(L, P, E y H) en orificios separados de la cmara. Los geles se leen de izquierda a derecha.
6.- Coloque la tapadera de la cmara en su lugar y coloque los electrodos a la fuente de

carga, el nodo con el nodo (rojo con rojo) y ctodo con ctodo (negro-negro). Asegrese
que ambas puntas elctricas estn conectadas al mismo canal de la fuente de poder.
7.- Realice la electroforesis a 120 volts. Poco tiempo despus de que se aplica la corriente,
el colorante de cargado se ve cmo migra a travs del gel hacia el lado positivo de la
cmara.
8.- Cuando la electroforesis se ha completado, apague la fuente de luz, desconecte los

electrodos de las entradas y remueva la tapa de la cmara.
9.- Retire la cmara de geles.
10.- Regrese el excedente de lquido del contenedor.
7. Bibliografa.
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1. Sesin 10: Grfica de resultados de electroforesis.
Ser capaz de analizar los resultados obtenidos mediante la electroforesis de ADN para
estimar el valor aproximado del peso molecular de las diferentes bandas observadas de
DNA, para que en la prctica mdica pueda entender los resultados de biologa celular y
molecular para diagnostico o investigacin.

Interpretar los resultados con la orientacin adecuada en el cuaderno de prcticas.

La estimacin del tamao de las bandas observadas mediante la tcnica de electroforesis
de ADN, es un procedimiento til que permite identificar el tamao aproximado de los
segmentos de ADN en funcin de su distancia de migracin en un campo elctrico.
La resolucin y velocidad de separacin de fragmentos de ADN por electroforesis son

reguladas a travs de la concentracin de agarosa (o acrilamida) en el gel y el voltaje
aplicado durante la electroforesis. La agarosa funciona como un filtro en el que los
fragmentos de menor tamao migran ms rpidamente hacia el nodo que aquellos de
mayor tamao. Al aumentar la concentracin de agarosa se dificulta el movimiento de los
fragmentos a lo largo del gel, permitiendo obtener una mayor resolucin en los fragmentos
de menor longitud. El incremento del voltaje aumenta proporcionalmente la velocidad de
migracin de los fragmentos en el gel.
Los cidos nucledos separados en geles de agarosa pueden visualizarse mediante tincin
con colorantes fluorescentes, lo cual permite evaluar su integridad y estimar su
concentracin mediante un anlisis comparativo con patrones de concentracin conocida.
Los colorantes fluorescentes actan mediante insercin entre las pares de bases que
conforman el cido nucleco. El bromuro de etidio es ampliamente utilizado para la
visualizacin de ADN y ARN. Sin embargo, ste es un reactivo altamente txico, con
propiedades mutagnicas, por lo que debe ser manejado con extremo cuidado en el
laboratorio. En la actualidad existen colorantes fluorescentes alternativos, como SYBR
Safe, SYBR Gold, SYBR Green I, Vistra Green y Syto60, desarrollados especficamente
para reducir los riesgos potenciales de mutagnesis. La tcnica para la cuantificacin de
ADN consiste simplemente en la utilizacin de una secuencia de concentraciones de
solucin patrn de ADN con la que se comparan muestras de ADN de concentracin
desconocida. El clculo de las concentraciones se hace bajo la luz ultravioleta segn la
fluorescencia. Debe evitarse la exposicin prolongada a la luz ultravioleta, incluso con
mscara de proteccin. La estimacin de las concentraciones de ADN puede realizarse
sobre una fotografa digital del gel tomada bajo luz ultravioleta si se cuenta con un
analizador de imgenes.
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La concentracin de agarosa y el voltaje con los que se debe trabajar depende del tamao
del segmento de ADN que se quiera visualizar. Los segmentos de gran tamao, el del ADN
total 2 (proveniente de una extraccin de ADN), deben trabajarse con concentraciones del
0.8% y a voltajes de 60V para evitar la fragmentacin del mismo. Los segmentos de
1500pb en adelante con geles al 1%, los segmentos de 500pb a 1500pb en geles 1,5% o
2% y los pequeos segmentos de de 100pb a 500pb (los microsatlites por ejemplo) en
geles al 4% o 6%. Para estos el voltaje puede variar de 20V a 120V de pendiendo de la
velocidad a la que quiera que migre el ADN, a voltajes elevados ms rpido corren las
muestras.
5. Equipo, Instrumental, material e insumos.
Equipo:
a) Transiluminador de BioRad.
d) El alumno (a) deber traer una regla graduada para esta prctica.
- Los alumnos medirn la distancia de cada banda observada con respecto al borde del gel.
Esto se realizar en cada banda para cada una de las enzimas de restriccin utilizadas.
- Utilizando la referencia conocida de los tamaos de las bandas generadas al utilizar la

enzima HindIII en el ADN del lamba fago, se proceder a calcular el tamao aproximado
de las bandas obtenidas por las enzimas EcoRI y PstI.
7. Bibliografa.
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1. Sesin 11: Bases tericas de la electroforesis de protenas.

Comprender los conceptos de electroforesis, as como la importancia de los diferentes
niveles de estructura de las protenas, para que en la prctica mdica pueda entender el
efecto que tienen las protenas sobre los procesos biolgicos en los seres vivos.

Cuestionario
Defina electroforesis?
Como se realiza un gel para protenas?
La electroforesis de protenas en geles con una matriz de poliacrilamida, comnmente

denominada electroforesis en poliacrilamida (PAGE, 'poliacrilamida gel electroforesis')
es sin duda alguna una de las tcnicas ms ampliamente usada para caracterizar mezclas
complejas de protenas. La electroforesis en poliacrilamida es un mtodo conveniente,
rpido y econmico a nivel de muestra pues se requieren slo cantidades del orden de
microgramos de protena.
Las protenas presentan una carga elctrica neta si se encuentran en un medio que tenga
un pH diferente al de su punto isoelctrico y por eso tienen la propiedad de desplazarse
cuando se someten a un campo elctrico. La velocidad de migracin es proporcional a la
relacin entre las cargas de la protena y su masa. Cuanto mayor carga por unidad de
masa ms rpida ser la migracin. Empleando geles de slice o de acetato de celulosa y
aplicando las protenas en una zona estrecha en torno a los electrodos se pueden
determinar diferencias de carga neta (carga total/masa) entre protenas. Este mtodo se
denomina electroforesis zonal. La matriz de poliacrilamida no es un buen soporte para
este mtodo pues la migracin de las protenas en su seno no slo es proporcional a la
carga neta sino tambin al tamao y forma de las protenas. Una ventaja importante de
los geles de poliacrilamida es que son qumicamente inertes, transparentes y estables en
un amplio rango de pHs, temperatura y fuerza inica.
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No aplica
El instructor (a) expondr la clase sobre las bases tericas de la electroforesis de

protenas
Definiciones bsicas
Aspectos
Velocidad de movimiento
Movilidad electrofortica
Factores que afectan a la electroforesis
Campo elctrico
Temperatura
Caractersticas de la muestra
Propiedades del medio
Propiedades del soporte
Modalidad de electroforesis
Orientacin
Gel de poliacrilamida
Grupos de soportes
Funciones
Electroforesis de protenas
La carga neta de las protenas
Etapa de tincin
7. Bibliografa.
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1. Sesin 12: Electroforesis de protenas.
Ser competente para realizar, montar y correr el gel de las protenas y conocer los
principios bsicos de la tcnica de electroforesis, para que en la prctica mdica pueda
realizar un buen uso de diferente instrumental de laboratorio para investigacin o
diagnstico.
Cuestionario
Defina las propiedades de las protenas para separarse en una electroforesis?
Con que solucin se tie un gel para protenas?
Una tcnica especialmente poderosa utilizada para fraccionar protenas es la

electroforesis. Hay gran variedad de tcnicas para electroforesis, y todas dependen de la
capacidad de molculas con carga para desplazarse cuando se colocan en un campo
elctrico. La separacin de protenas se logra mediante electroforesis en gel de
poliacrilamida (EGPA), en la cual las protenas se mueven por accin de una corriente
elctrica aplicada a travs de un gel compuesto de una pequea molcula orgnica
(acrilamida) unida mediante enlaces transversos para formar un gel. El gel puede formarse
como una delgada capa entre dos capas de vidrio o como un cilindro dentro de un tubo de
cristal. Una vez polimerizado el gel, la placa (o tubo) se suspende entre dos
compartimientos que contienen solucin amortiguadora dentro del cual se sumergen
electrodos con carga opuesta. La muestra que contiene las protenas concentradas se
extiende en una placa de gel con surcos situados a lo largo de la parte superior del gel. La
muestra de protenas se prepara en solucin de sacarosa o glicerol cuya densidad evita
que la muestra se mezcle con el amortiguador en el compartimiento superior. Se aplica
entonces un voltaje entre los compartimientos de amortiguador y la corriente fluye a travs
de la placa causando que las protenas se desplacen hacia electrodos con carga opuesta.
Tpicamente, la separacin se efecta utilizando amortiguadores alcalinos que confieren
carga elctrica negativa a las protenas y las obligan a desplazarse hacia el nodo con
carga positiva en el extremo opuesto del gel.
El movimiento relativo de protenas a travs de un gel de poliacrilamida depende del

tamao, forma y densidad de carga (carga por unidad de masa) de las molculas. Cuanto
mayor la densidad de carga, la protena avanza con mayor fuerza a travs del gel y por lo
tanto su velocidad de migracin es ms rpida. Sin embargo, puesto que la poliacrilamida
forma una criba molecular con enlaces transversos, cuando mayor sea la protena ms se
enredar conforme avanza y por lo tanto menor ser la velocidad de movimiento. La
GC-FR-012 Rev. 3
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capacidad de una protena de determinado tamao para desplazarse a travs del gel
depende de la concentracin de la poliacrilamida empleada para constituir la criba. Cuanto
menor sea la concentracin (hasta un mnimo cercano a 2 %) de acrilamida, menor ser el
nmero de enlaces cruzados y determinada molcula de protena se desplazar con mayor
rapidez. La forma tambin es un factor, puesto que protenas globulares compactas se
mueven con mayor rapidez en comparacin con protenas fibrosas, alargadas, de peso
molecular comparable.
El avance de la electroforesis se puede seguir si se observa el desplazamiento de la huella

de un colorante con carga elctrica que se mueve justo delante de las protenas ms
rpidas. Luego de cierto tiempo se interrumpe la corriente y se elimina el gel del
contenedor. El gel se puede teir para investigar la localizacin de las protenas. Si las
protenas estn marcadas con istopo radioactivo se puede determinar su sitio presionando
el gel contra un fragmento de pelcula radiogrfica para producir una auto-radiografa.
Alternativamente, se puede seccionar el gel en porciones y aislar las protenas individuales,
o tambin presionar el gel contra un pedazo de papel filtro de nitrocelulosa y someter a
tratamiento adicional de electroforesis para desplazar las protenas fuera del gel y
absorberlas sobre la superficie de la nitrocelulosa. Este ltimo procedimiento, llamado
Western Blot, se puede emplear para identificar bandas individuales de protenas por su
interaccin con anticuerpos especficos.
EGP-DSS: De ordinario, la EGP se realiza en presencia del detergente dodecilsulfato

sdico, que posee carga negativa y se enlaza en gran cantidad a todo tipo de molculas de
protena. La repulsin electrosttica entre molculas DSS enlazadas causa que las
protenas se desdoblen en barras cilndricas semejantes, eliminando as la diferencia de
forma como factor que impida la separacin.
El nmero de molculas DSS enlazadas a la protena regularmente es proporcional al peso
molecular de la misma. Por consiguiente, una especie de protena cualquiera que sea su
tamao, siempre tiene la misma densidad de carga y ser impulsada a travs del gel con la
misma fuerza. Sin embargo, puesto que la poliacrilamida presenta abundantes enlaces
transversales, retiene las protenas de mayor tamao en mayor extensin comparadas con
las protenas ms pequeas. Como resultado, las protenas se separan segn una sola
propiedad: su peso molecular. Adems de separar las protenas de una mezcla, la EGP-
DSS se puede emplear para determinar el peso molecular de diferentes protenas
comparando la posicin de las bandas contra las producidas por protenas de tamao
conocido.
Equipo:
a) Cmara de electroforesis MiniProtean 3 (BioRad).
Material:
a) Buffer de carga para EGP-DSS.
b) Buffer 1.5 M Tris pH 8.8.
c) Pipetas desechables de 10 mL.
d) Pipetas de transferencia.
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e) Micropipetas de 1000, 100 y 10 L con puntillas desechables.

f) Puntillas desechables para protenas.
g) Buffer 1 M Tris pH 6.8.
Insumo:
a) Sodio-dodecilsulfato (SDS) al 10%.
b) Agua destilada.
c) TEMED.
d) Solucin de acrilamida al 30%
e) SDS-PAGE Running Buffer.
Para realizar la electroforesis utilizaremos el sistema MiniProtean 3 de la compaa

BioRad.
Sistema de Electroforesis para Protenas Mini Protean 3 de BioRad.
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Descripcin de los componentes del Sistema de Electroforesis para

Protenas Mini Protean 3 de BioRad.
Procedimiento
1) Limpie ambas caras de cada uno de los vidrios con alcohol etlico.
2) Coloque dos tiras de papel parafilm en el dispositivo de ensamblado de los vidrios
teniendo cuidado de no producir arrugas ni bordes.
3) Coloque el vidrio pequeo encima del vidrio grande de tal manera que el espaciador
quede en medio de los dos (4a).
4) Deslice ambos vidrios en el dispositivo de fijacin (4b).
5) Deslice hacia afuera ambas palancas de fijacin para asegurar los vidrios (4c).
6) Asegure la parte superior de los vidrios utilizando la manivela con resorte que est en la
parte superior del dispositivo de fijacin (4d).
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7) Llene el espacio formado por ambos vidrios con agua y verifique que no existan fugas.
Si existen fugas vuelva a ensamblar los vidrios en el dispositivo de fijacin.
8) Introduzca el cepillo en la parte superior de las placas de vidrio y trace una lnea
horizontal a aproximadamente un centmetro por debajo de los dientes del cepillo. Este
ser el lmite entre el gel de resolucin (resolving gel) y el gel de agrupamiento (stacking
gel). Retire el cepillo.
9) Tire el agua y asegure de secar la parte interna de las placas de vidrio utilizando un
papel absorbente que no libere partculas (Kim-wipe o similar).
10) Prepare el gel de resolucin de acuerdo a la siguiente tabla:
Agua Bidestilada: 1.9 mL.

Acrilamida al 30%: 1.7 mL.
Buffer 1.5 M Tris pH 8.8: 1.3 mL.
10% SDS: 0.05 mL.
10% Persulfato de amonio: 0.05 mL.
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11) Antes de agregar el agente polimerizante (TEMED) asegrese de contar con una
pipeta de transferencia pues una vez agregado el TEMED la polimerizacin ocurre
rpidamente.
12) Agregue el TEMED: 0.002 mL Cierre el tubo y mezcle con cuidado. Absorba la
solucin utilizando la pipeta de transferencia. Agregue el gel en medio de las placas de
vidrio hasta 2 mm por arriba de la marca que realiz en el paso 8. La solucin restante
regrsela al tubo, pues le servir de indicador para la polimerizacin. La polimerizacin
debe ocurrir en aproximadamente 20 minutos.
13) Agregue cuidadosamente agua bidestilada por encima del gel de resolucin.
14) Mientras se polimeriza el gel de resolucin, proceda a preparar las muestras a
analizar.
15) Marque con su plumn permanente la tapa de cada uno de los microtubos de
centrifugacin (1.6 mL.) con las leyendas de las protenas correspondientes. Prepare el
volumen requerido segn las instrucciones del profesor (a). Mantenga las muestras
originales en hielo.
16) Transfiera sus muestras a un flotador y desnaturalice las protenas en agua hirviendo
por 5 minutos. Verifique que cada uno de los tubos est completamente cerrado, pues
existe la posibilidad de que estos se abran durante el calentamiento.
17) Centrifugue por 5 segundos sus muestras. Colquelas en hielo.
Preparacin del gel de agrupamiento de acuerdo a la siguiente tabla:
Agua Bidestilada: 1.4 mL.

Acrilamida al 30%: 0.33 mL.
Buffer 1 M Tris pH 6.8: 0.25 mL.
10% SDS: 0.02 mL.
10% Persulfato de amonio: 0.02 mL.
18) Antes de agregar el agente polimerizante (TEMED) asegrese de contar con una
pipeta de transferencia, pues una vez agregado el TEMED la polimerizacin ocurre
rpidamente.
19) Agregue el TEMED: 0.002ml. Cierre el tubo y mezcle con cuidado. Absorba la solucin
utilizando la pipeta de transferencia. Agregue el gel de agrupamiento hasta unos 4 mm por
debajo del borde superior de los vidrios. Coloque cuidadosamente el cepillo en la parte
superior de las placas de vidrio, teniendo precaucin de no producir salpicaduras (el
alumno que realice esta operacin deber contar con lentes protectores, guantes y
GC-FR-012 Rev. 3
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mascarilla). La solucin restante regrsela al tubo, pues le servir de indicador para la

polimerizacin. La polimerizacin debe ocurrir en aproximadamente 10 minutos.
20) Una vez polimerizado el gel de agrupamiento, proceda a remover las placas de vidrio
del dispositivo de fijacin (5a).
21) Ponga las placas de vidrio en el ensamblador de electrodos con el vidrio pequeo
hacia adentro (5b).
22) Coloque el ensamblador de electrodos en el cuadro interno de fijacin (5c).
23) Presione hacia abajo el ensamblador de electrodos mientras cierra las palancas del
cuadro interno de fijacin (5d).
24) Coloque el cuadro interno de fijacin en el tanque acrlico (5e).
25) Llene la parte central del cuadro interno de fijacin con solucin SDS-Running Buffer
hasta unos 3 mm por arriba del borde superior de las placas de vidrio.
26) Vierta solucin SDS-Running Buffer en el tanque acrlico.
27) Retire cuidadosamente el cepillo. Limpie cuidadosamente cada una de las hendiduras
producidas por el cepillo con una pipeta de vidrio. Utilice una pipeta de vidrio para retirar las
burbujas de aire que se formen en la parte inferior de las placas de vidrio.
28) Aplique las muestras de protenas utilizando la gua para cargar muestras.
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29) Retire la gua para cargar muestras. Coloque la tapa superior del sistema verificando la
polaridad correcta de los electrodos.
30) Aplique 50V a la cmara de electroforesis utilizando la fuente de alimentacin.
Mantenga este voltaje hasta que la tinta azul alcance el lmite entre el gel de resolucin y el
de agrupamiento, cuando esto ocurra incremente el voltaje a 100 volts. Mantenga este
voltaje hasta que la tinta azul alcance el borde inferior de los vidrios.
31) Desensamble la cmara de electroforesis y coloque el gel en una tincin de azul de

Comassie durante 24 horas.
32) Destia el gel con solucin de metanol y acido actico, cambiando la solucin cada
hora por 3 ocasiones.
33) Coloque su gel en plstico protector y obtenga una imagen digital de la misma
utilizando un escner.
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7. Bibliografa.
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1. Sesin nm. 13: Transformacin de bacterias.
Comprender los principios de la transfeccin de bacterias con plsmidos, la regulacin

gentica y la expresin de la protena verde fluorescente (GFP), para que en la prctica
mdica pueda realizar un buen uso de las diferentes herramientas de biologa molecular
en investigacin o diagnstico.

Cuestionario:
*Qu utilidad tiene transformar una bacteria?
*Como se puede identificar que una bacteria esta transformada?
*Calidad de las notas de su cuaderno de prcticas.
*Los resultados deben de ser reportados e interpretados con responsabilidad y tica.
*Exposicin y discusin del artculo por los alumnos.
*Elaboracin de una conclusin sobre la competencia aprendida.

Esta prctica de laboratorio est diseada para comprender los principios de
transformacin bacteriana. Los estudiantes cultivarn una bacteria E. coli K12
transformada genticamente con el plsmido pGLO. Las bacterias transformadas
producirn protena verde fluorescente (GFP). La propiedad nica de la fluorescencia de la
GFP permite que se pueda comprobar la transfeccin de una lmpara UV. Una de las
herramientas bsicas de la biotecnologa moderna es el rompimiento del DNA, cortando
DNA y unindole otras molculas de DNA. El concepto bsico detrs del rompimiento del
DNA es el remover un fragmento funcional de DNA vamos a decir un gen de un
organismo y combinarlo con el DNA de otro organismo para crear la protena a la cual ese
gen codifica. Por ejemplo, a ciertas plantas se les pueden dar los genes para resistencia a
pesticidas o enfermedades, los genes funcionales se les pueden dar a personas con genes
no funcionales o mutados, como en la enfermedad gentica de la fibrosis cstica.
Los genes pueden ser adquiridos de humanos, animales, o DNA de plantas y colocados
dentro de la bacteria. Por ejemplo, un gen de un humano sano para la hormona insulina
puede ser colocado en una bacteria. Bajo las condiciones correctas, esta bacteria puede
crear insulina humana autntica. Cuando se les permite que se multipliquen en
fermentadores esta bacteria puede ser usada para produccin masiva de la protena
humana insulina. Esta insulina genticamente creada es purificada usando cromatografa
de protenas y puede ser usada para tratar pacientes con diabetes, donde los genes de la
insulina no funcionan normalmente. Un problema comn en la purificacin de protenas
genticamente diseadas de bacterias transformadoras es la contaminacin de protenas
bacterianas endgenas. La cromatografa es un mtodo poderoso usado en la
biotecnologa para separar y purificar protenas de inters de las protenas bacterianas. Las
protenas purificadas de esta manera, pueden ser usadas, por ejemplo, como medicinas
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para tratar enfermedades humanas, o agentes de casa como enzimas naturales para
realizar mejores detergentes. La clonacin y expresin del gen GFP es completamente
anlogo a los procesos usados en la industria de la biotecnologa para producir protenas
con valor comercial. La fuente real de la protena fluorescente verde es un gel de la alga
bioluminiscente Aequoria Victoria. En este ejercicio se podr sugerir un escenario
hipottico a los estudiantes en el cual la GFP tenga algn valor comercial especial y su gen
proviene de una fuente natural diferente, planta o animal. En cualquier caso, el principio es
exactamente el mismo, el gen codifica la protena fluorescente verde.
El DNA modificado por biotecnologa, es el material ms valorado en el mundo. Una

bacteria microscpica, muy pequea como para ser vista con el ojo humano, pero que
contiene el gen de una enzima para tratar el ataque cardiaco, la estreptoquinasa, o que
evita el dao a los cultivos, puede tener un valor de 5 billones de dlares en el mercado
actual.
Medio de Cultivo: El medio lquido y slido de agar son referidos como LB (por Luisa
Bertani) y estn hechos de extracto de levadura y una enzima digestiva de carne, ambos
productos proporcionan una mezcla de carbohidratos, aminocidos, nucletidos, sales y
vitaminas, los cuales son necesarios como nutrientes para el crecimiento bacteriano. El
agar, que es derivado de un alga, se derrite cuando se calienta, y fro forma un gel slido
(muy parecido a la gelatina), funciona para proveer un soporte slido en el cual cultivar
bacterias.
Seleccin del antibitico: El plsmido pGLO el cual contiene el gen GFP tambin contiene
el gen de la beta-lactaminasa, una protena que provee a la bacteria con una resistencia al
antibitico ampicilina. La protena beta-lactaminasa es producida y secretada por las
bacterias, las cuales contienen el plsmido. La beta-lactaminasa secretada inactiva la
ampicilina, permitiendo que solo las clulas transformadas crezcan en su presencia. Solo
las bacterias transformadas las cuales contienen el plsmido pGLO y producen beta-
lactaminasa pueden sobrevivir en la presencia de ampicilina.
Regulacin Gentica: La bacteria transformada con el plsmido pGLO ser sembrada en

platos de agar LB/amp y LB/amp/ara. La expresin del gen GFP est bajo el control
regulatorio del promotor arabinosa. As, cuando la bacteria es sembrada en el agar
conteniendo arabinosa (LB/amp/ara), la GFP se expresar y las colonias aparecern en un
color verde brillante. Inversamente, cuando las bacterias sean sembradas en agar LB que
no contenga arabinosa (LB/amp), el gen no funcionar y las colonias aparecern blancas.
5. Equipo, Instrumental, Material e insumos.
Equipo:
a) Estufa a 37C 1
Material:
a) Asas de inoculacin paquetes de 10 asas 2
b) Platos de cultivo 6
c) Marcadores 1
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Insumo:
a) Bacteria E. coli K12 transformada con el plsmido pGLO 1 cepa en tubo
a) Bacteria E. coli K12 sin transformar 1 cepa en tubo
1.- Tome la cepa en tubo cerrado (bacteria E. coli K12+pGLO y solo E. coli K12) y
proceda a realizar el procedimiento para un cultivo:
a) Abra el tubo que contiene la cepa de la bacteria E. coli K12+pGLO, cerca del
mechero.
b) Utilizando un asa estril recolecte una colonia de bacterias y depostela en el
plato
correspondiente.
c) Cierre el tubo.
d) Anote su nombre en el plato cerrado.
e) Utilizando un asa estril realice el mismo procedimiento en el tubo marcado
como
E. coli K12.
2.- Coloque los platos boca abajo en la incubadora a 37C hasta el da siguiente.
7. Bibliografa.
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1. Sesin 14: Resultados de la transformacin de bacterias con

plsmido pGLO que contiene el gen de la protena verde fluorescente
(GFP).
Ser capaz de analizar los resultados obtenidos mediante la transformacin gentica de la

bacteria E. coli para la expresin de la protena verde fluorescente, para que en la prctica
mdica pueda realizar un buen uso de las diferentes herramientas de biologa molecular en
investigacin o diagnstico.

Interpretar los resultados con calidad en el cuaderno de prcticas.

Un gen es un pedazo de cido desoxirribonucleico (ADN) el cual provee las instrucciones
para producir una protena especfica, la cual da a un organismo una caracterstica
particular. La transformacin gentica ocurre cuando una clula incorpora y expresa dentro
de ella un nuevo pedazo de material gentico (ADN). Esta nueva informacin gentica
muchas veces provee al organismo de una nueva caracterstica que se puede identificar
luego de ocurrida la transformacin. Las bacterias dems de poseer un cromosoma
grande, poseen pequeos pedazos circulares de ADN llamados plsmidos. ste es un
fenmeno que ocurre de forma natural en muchas bacterias, pero la eficacia del proceso
vara enormemente de unas especies a otras. Para que la transformacin tenga lugar, la
bacteria tiene que encontrarse en el llamado estado de competencia, que ocurre en
determinadas condiciones fisiolgicas; en este estado, la bacteria presenta alteraciones en
su pared y membrana celulares, que permiten la entrada de cidos nucleicos en la clula.
En el laboratorio se ha conseguido desarrollar tcnicas que inducen el estado de

competencia en bacterias que no lo presentan de forma natural, como es el caso de E. coli.
Estas tcnicas se basan en diversos tratamientos qumicos o fsicos que producen
microporos en la clula, lo que permite la introduccin del ADN exgeno (transformacin)
de modo bastante eficiente. Uno de los mtodos fsicos es el choque da calor, consistente
en inducir cambios bruscos de temperatura para inducir la apertura de poros en la
membrana de la bacteria hacindola permeable. Dicha competencia se puede inducir con
tratamientos qumicos utilizando compuestos como el cloruro clcico. Hay que tener en
cuenta sin embargo que tras estos tratamientos no todas las clulas del cultivo se hacen
competentes. La transformacin en el laboratorio es una tcnica rutinaria de enorme
utilidad, que nos permite introducir prcticamente cualquier plsmido en su forma circular o
superenrollada en casi cualquier tipo de bacteria. La investigacin que se describe a
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continuacin conjunta los conocimientos tericos y prcticos de la ingeniera gentica que

nos permiti llevar a cabo una transformacin bacteriana. El ADN del plsmido usualmente
contiene genes para una o ms caractersticas para la supervivencia de la bacteria. En esta
investigacin se introdujo el plsmido pGLO a la bacteria E. coli. El plsmido pGLO,
contiene adems un gen que codifica para una protena que le confiere resistencia al
antibitico ampicilina (beta-lactamasa) y un sistema especial de regulacin gentica que
puede ser usado para el control de la expresin de la protena verde fluorescente (GFP) en
clulas transformadas. El gen para la GFP puede ser activado o prendido en clulas
transformadas al aadir el azcar arabinosa al medio de cultivo donde crecen las clulas.
Se trabaj la seleccin de clones celulares con las caractersticas esperadas de la
expresin o ausencia de expresin de los genes marcadores presentes en un plsmido
recombinante y se estim la eficiencia de la transformacin.
Equipo:
a) Estufa a 37C 1
Material:
a) Asas de inoculacin paquetes de 10 asas 2
b) Platos de transformacin (LB, LB/amp y LB/amp/ara) 6
c) Lmpara UV de onda larga* 1
Insumo:
a) Ampicilina liofilizada 1 vial
b) Tableta de LB Broth (para hacer 50 mL) 1 tableta
c) Agua destilada
d) Cloro 10 ml
Los alumnos observaran las diferencias fenotpicas que presentan cada bacteria.
7. Bibliografa.
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1. Sesin15: Cultivos celulares.

Comprender las principales tcnicas utilizadas en cultivo celular y el impacto de la misma
en la medicina moderna, para que en la prctica mdica pueda entender el efecto que
tienen los cultivos celulares sobre diferentes patologas.

Cuestionario
Qu es un cultivo celular?
Cmo se clasifican los cultivos celulares?
Cules son los diferentes equipos que se utilizan para cultivos celulares?
El cultivo celular es el proceso mediante el que clulas, ya sean clulas procariotas,

eucariotas o vegetales, pueden cultivarse en condiciones controladas. En la prctica el
trmino "cultivo celular" se usa normalmente en referencia al cultivo de clulas aisladas de
eucariotas pluricelulares, especialmente clulas animales. El desarrollo histrico y
metodolgico del cultivo celular est ntimamente ligado a los pptidos cultivares del cultivo
de tejidos y el cultivo de rganos. El cultivo de clulas animales empez a ser una tcnica
rutinaria de laboratorio durante los aos 50, pero el concepto de mantener lneas de clulas
vivas separadas del tejido de origen fue descubierto en el siglo XIX.
Aislamiento de clulas
Las clulas pueden ser aisladas de los tejidos para cultivos in vitro de muchas maneras.
Las clulas pueden ser purificadas con facilidad de la sangre, sin embargo slo los
leucocitos son capaces de crecer en cultivo. Las clulas mononucleares se pueden liberar
de los tejidos blandos mediante hidrlisis enzimtica con enzimas como la colagenasa,
tripsina o pronasa, que degradan la matriz extracelular. Como alternativa se pueden
colocar trozos de tejido en medio de crecimiento, y las clulas que crecen son aptas para el
cultivo. Este mtodo es el conocido como cultivo de explantos. Las clulas que se cultivan
directamente desde un sujeto se conocen como clulas primarias. A excepcin de algunos
derivados de tumores, la mayora de los cultivos celulares primarios tienen un periodo de
vida limitado. Despus de un cierto nmero de divisiones las clulas entran en el proceso
de senescencia y dejan de dividirse, generalmente manteniendo la viabilidad.
Mantenimiento de clulas en cultivo

Las clulas se cultivan y mantienen a una apropiada temperatura y mezcla de gases
(habitualmente, 37C, 5% CO2 y 95% O2) en un incubadora de celular. Las condiciones de
cultivo varan ampliamente para cada tipo celular, y la variacin de las condiciones para un
tipo celular concreto, puede dar lugar a la expresin de diferentes fenotipos. Adems de la
temperatura y la mezcla de gases, el factor ms comnmente variado en los sistemas de
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cultivo es el medio de crecimiento. Las recetas para los medios de crecimiento pueden
variar en pH, concentracin de glucosa, factores de crecimiento y la presencia de otros
componentes nutritivos. Los factores de crecimiento usados para suplementar a los medios
derivan a menudo de sangre animal, como el suero bovino. Estos ingredientes derivados
de la sangre plantean una potencial contaminacin con virus o priones de los productos
farmacuticos derivados. En la actualidad se tiende a minimizar o eliminar el uso de estos
ingredientes cuando sea posible. Estrategias alternativas de abastecimiento involucran la
sangre de los animales procedentes de pases con un riesgo mnimo de encefalopata
espongiforme bovina, como Australia y Nueva Zelanda, y el uso de nutrientes concentrados
derivados de suero en lugar de suero animal entero para el cultivo de clulas. Las clulas
pueden crecer en suspensin o de manera adherente. Algunas clulas viven de forma
natural sin adherirse a una superficie, como las que existen en el torrente sanguneo. Otras
necesitan una superficie, como la mayora de clulas derivadas de tejidos slidos. A las
clulas que crecen sin unirse a una superficie se las llama cultivos en suspensin. Algunos
cultivos celulares adherentes pueden crecer en plstico para el cultivo de tejidos, que
puede estar recubierto con componentes de la matriz extracelular para aumentar sus
propiedades de adhesin y proporcionar otras seales necesarias para el crecimiento y
diferenciacin. Otro tipo de cultivo adherente es el cultivo organotpico que consiste en
cultivar las clulas en un ambiente tridimensional a diferencia de las placas de cultivo
bidimensionales. Este tipo de cultivo 3D es bioqumica y fisiolgicamente similar al tejido
vivo. Sin embargo presenta dificultades tcnicas debido a varios factores (por ejemplo:
difusin).
Equipo:
a) Estufa a 37C de CO2 1
b) Cabina de flujo laminar 1
c) Mao Mara 1
d) Refrigerador 1
Material:
a) Pipetas de plstico para cultivos de 5mL 10
b) Pipetas de plstico para cultivos de 10mL 10
c) Frasco de cultivo celular de 75 cm 5
d) Frasco de cultivo celular de 150 cm 5
e) Placas M6 para cultivo celula 5
f) Placas de 96 pocillos para dilucin 5
g) Placas de 96 pocillos para cultivar celulas 5
h) Placas de 96 pocillos para ELISA 5

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Insumo:
a) Trypsona bovina pncreas 1
b) Tripsina-EDTA 1X 500ML GIBCO 1
c) Medio DMEN 500ML GIBCO 1
d) L-Glutamine, 200 mM 1
e) MEDIA NON-ESS AA 100X 1
f) Lysozyme from chicken egg white 1
g) Colchicina 1/g 1
h) Fitohemaglutinina/ Gibco 1
i) Suero Fetal Bovino 500mL 1
j) RPMI L-Glutamina 500ML 1
k) DMEM Glu/Glu/HEPES 500ML 1
l) Agua destilada 500mL 1
m) Cloro 10 ml 1
El instructor (a) expondr la clase terica/practica sobre las tcnicas ms importantes en

cultivos celulares:
1.- Concepto de cultivo celular

2.- Aplicaciones del cultivo celular
3.- Tipos de lneas celulares establecidas, ejemplos de cultivos celulares
4.- Protocolo para cultivos celulares El laboratorio de cultivo celular
5.- Cabinas de flujo laminar
6.- Incubador de CO2
7.- Instrumentos pticos de observacin
8.- Congeladores e instalacin de criogenia (N2 lquido)
9.- Equipo de esterilizacin
10.- Equipo de filtracin
11.- Autoclave
12.- Mechero Bunsen
13.- Otros instrumentos
Pipeteadores
Centrfugas
Equipos de purificacin de agua
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Magdem (agitadores)
Contador electrnico de clulas
14.- reas de investigacin en las que son tiles los cultivos celulares
1.- Procedimiento para el pase de clulas.
Preparacin de los medios de cultivo.

Las clulas eucariotas se crecern en medio DMEM (Medio de Eagle modificado por
Dulbecco) y RPMI, suplementado con 2 mM de L- glutamina, 1% de aminocidos no
esenciales, 1% de penicilina/estreptomicina, 0.02% de Lysozyma, 0.02% de Colchicina,
0.02% de Fitohemaglutinina y suero de ternera fetal (STF) al 5-10%. Para despegar las
clulas adherentes de las superficies de cultivo se utiliz Tripsina-EDTA 1x con Trypsona
bovina. Para el crecimiento de clulas se emplearan frascos de plstico estril de distintos
tamaos (T25, T75 y T150) y placas de 6 (M6), 24 (M24) y 96 (M96) pocillos. De la misma
manera se utilizaran pipetas de plstico estril de diferentes tamaos (5 y 10mL).
Mantenimiento de lneas celulares.

Las lneas celulares se cultivaran en los medios DMEM y RPMI suplementado con
antibiticos, glutamina, aminocidos no esenciales, factores de crecimiento celular y 5%
STF. Para la lnea celular de mamfero se utilizara 10% STF. Los cultivos se incubaran a
37C en un ambiente con 98% de humedad y 5% de CO2, en placas o botellas de plstico.
Cuando las monocapas alcancen la confluencia, las clulas se despegaran por tratamiento
con tripsina y se subcultivaran en nuevas placas o botellas a la densidad celular deseada.
Las clulas se almacenaron congeladas en nitrgeno lquido en 90% STF y 10% DMSO.
7. Bibliografa.
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1. Sesin 16: Resultados del mantenimiento de cultivos celulares.
2.- Competencia a desarrollar en la sesin.
Ser capaz de analizar los resultados obtenidos mediante el mantenimiento de cultivos

celulares, para que en la prctica mdica pueda realizar un buen uso de las diferentes
herramientas de biologa molecular en investigacin, diagnstico y cultivo celular.
3.- Mecanismos de evaluacin y evidencia de desempeo.

Interpretar los resultados con calidad en el cuaderno de prcticas.
4.- Fundamento terico e informacin de apoyo.
Los cultivos celulares se han convertido hoy da en una herramienta de amplio uso en
investigacin bsica biomdica, para el diagnstico en salud humana as como en sus
aplicaciones para la elaboracin de productos biotecnolgicos y en la realizacin de
pruebas de control de calidad, impartiendo una formacin especializada en el campo de los
cultivos celulares utilizando tcnicas que estn a la vanguardia de la investigacin y los
recursos materiales para optimizar el proceso de enseanza-aprendizaje, impartiendo as
una enseanza de calidad.
5.- Equipo, instrumental, material e insumos.
Equipo:
a) Estufa a 37C de CO2 1
b) Cabina de flujo laminar 1
c) Mao Mara 1
d) Refrigerador 1
Material:
a) Pipetas de plstico para cultivos de 5mL 10
b) Pipetas de plstico para cultivos de 10mL 10
c) Frasco de cultivo celular de 75 cm 5
d) Frasco de cultivo celular de 150 cm 5
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e) Placas M6 para cultivo celula 5
f) Placas de 96 pocillos para dilucin 5
g) Placas de 96 pocillos para cultivar celulas 5
h) Placas de 96 pocillos para ELISA 5
Insumo:
a) Trypsona bovina pncreas 1
b) Tripsina-EDTA 1X 500ML GIBCO 1
c) Medio DMEN 500ML GIBCO 1
d) L-Glutamine, 200 mM 1
e) MEDIA NON-ESS AA 100X 1
f) Lysozyme from chicken egg white 1
g) Colchicina 1/g 1
h) Fitohemaglutinina/ Gibco 1
i) Suero Fetal Bovino 500mL 1
j) RPMI L-Glutamina 500ML 1
k) DMEM Glu/Glu/HEPES 500ML 1
l) Agua destilada 500mL 1
m) Cloro 10 ml 1
6.- Metodologa de la sesin.

Los alumnos observaran la confluencia de los cultivos celulares y las diferencias que
presentan cada lnea celular. Cuando el cultivo llegue a una confluencia superior al 80% se
puede repetir el procedimiento de la sesin numer 15.
7. Bibliografa.
GC-FR-012 Rev. 3
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V. ANEXOS
7. Bibliografa.
1. Exposure to Blood, What Healthcare Personnel Need to Know. Disease Control

and Prevention National Center for Infectious Diseases Divison of Healthcare Quality
Promotion and Division of Viral Hepatitis. Junio del 2003.
http://www.cdc.gov/ncidod/dhqp/pdf/bbp/Exp_to_Blood.pdf
2. NORMA Oficial Mexicana NOM-087-ECOL-SSA1-2002, Proteccin ambiental Salud
ambiental - Residuos peligrosos biolgico-infecciosos - Clasificacin y
especificaciones de manejo. Secretara de Medio Ambiente y Recursos Naturales [en
lnea]. [Fecha de acceso 20 de enero de 2003].
http://www.salud.gob.mx/unidades/cdi/nom/087ecolssa.html
3. La gua de cumplimiento de la Norma Oficial Mexicana NOM-087. Colaboracin
entre la Secretara de Medio Ambiente y Recursos Naturales, la Procuradura Federal
de Proteccin al Ambiente, la Secretara de Salud, y la Comisin Federal para la
Proteccin contra Riesgos Sanitarios. [Fecha de acceso martes 14 de abril del 2009].
http://www.cofepris.gob.mx/work/sites/cfp/resources/LocalContent/1909/5/GuiaNOM08
7.pdf
4. Norma Oficial Mexicana NOM-003-SSA2-1993, Para la disposicin de sangre
humana y sus componentes con fines teraputicos. Secretara de Salud. [Fecha de
acceso 18 de julio de 1994]. http://www.salud.gob.mx/unidades/cdi/nom/003ssa23.html
5. Norma Oficial Mexicana NOM-010-SSA2-1993, Para la prevencin y control de la
infeccin por Virus de la Inmunodeficiencia Humana. Secretara de Salud. [Fecha de
acceso 18 de julio de 1994]. http://www.salud.gob.mx/unidades/cdi/nom/010ssa23.html
6. Norma Oficial Mexicana NOM-013-SSA2-1994, Para la prevencin y control de las
enfermedades bucales. Secretara de Salud. [Fecha de acceso 11 de enero de 1999].
7. http://www.salud.gob.mx/unidades/cdi/nom/m013ssa24.html
8. NORMA Oficial Mexicana NOM-036-SSA2-2002, Prevencin y control de
enfermedades. Aplicacin de vacunas, toxoides, sueros, antitoxinas e
inmunoglobulinas en el humano. Secretara de Salud. [Fecha de acceso 17 de julio de
2003]. http://www.salud.gob.mx/unidades/cdi/nom/036ssa202.html
9. OMS. Manual de Bioseguridad en Laboratorios de Microbiologa y Biomedicina. CDC.
4a. Edicin. OMS-CD, 2006.
10. Alberts B, Bray D, Hopkin K, Johnson A, Lewis J, Raff M, Roberts K y Walter P (2005).
Introduccin a la Biologa Celular. Panamericana, Madrid, Espaa.
GC-FR-012 Rev. 3
Cdigo

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VI. TABLA DE CAMBIOS
Tabla de Cambios
Revisin Fecha Descripcin

1 17/01/11 Cambio de formato del manual
2 25/05/11 La sesin 16 de examen se cambio por resultados de cultivo celular
3 27/07/12 Se adecua al formato GC-FR-12 Rev. 3
GC-FR-012 Rev. 3

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Universidad Autnoma de Baja California L3-ML-001

Facultad de Medicina y Psicologa Revisin

Manual de Laboratorio de Biologa Celular

Clave de la materia: 11268

Plan de estudios 2010-1

Elabor Revis Autoriz

Dr. Horacio Almanza

Facultad de Medicina y Psicologa Revisin

Sesin Nombre de la sesin Pagina

1 Encuadre, clasificacin y separacin de Residuos Peligrosos Biolgico- 5

2 Uso del microscopio ptico y tcnicas avanzadas de microscopa 14

3 Preparacin de soluciones y manejo de bscula analtica y pHmetro 21

4 Fragilidad osmtica del eritrocito 23

5 Tecnologa del DNA recombinante (clase terica) 25

9 Electroforesis de ADN en gel de agarosa 42

10 Grfica de resultados de electroforesis 44

11 Bases tericas de la electroforesis de protenas (clase terica) 46

13 Transfeccin de bacterias con plsmido pGLO 57

14 Observacin de resultados de transfeccin 60

15 Cultivos celulares (clase terica/practica) 62

16 Resultados del mantenimiento de cultivos celulares (clase terica/practica) 66

Facultad de Medicina y Psicologa Revisin

II. Competencia general de la asignatura.

III. Reglamento de laboratorio de biologa celular.

Facultad de Medicina y Psicologa Revisin

le anotara inasistencia. Si reincide podr ser sujeto a suspensin temporal o

IV. Mecanismos de evaluacin y evidencia de desempeo en el

El laboratorio de Biologa celular se evaluara bajo el siguiente esquema:

Calidad del El alumno elaborara una conclusin sobre la competencia aprendida en

Facultad de Medicina y Psicologa Revisin

IV. PROGRAMACIN DE PRCTICAS

1. Sesin 1: Encuadre, clasificacin y separacin de Residuos

2. Competencia a desarrollar en la sesin.

3. Mecanismos de evaluacin y evidencia de desempeo.

Que el alumno identifique y disponga los residuos peligrosos biolgico-infecciosos (RPBI)

4. Fundamento terico e informacin de apoyo.

Facultad de Medicina y Psicologa Revisin

biolgicas infecciosas, conforme a la Norma Oficial Mexicana. Durante el envasado, los

Los generadores y prestadores de servicios, adems de cumplir con las disposiciones

a) Identificacin de los residuos.

b) Envasado de los residuos generados.

d) Recoleccin y transporte externo.

El laboratorio debe contar con sealamientos y letreros alusivos a la peligrosidad de los

Cultivos y cepas que se generan en diferentes prcticas se envasaran en bolsa de

Patolgicos en este laboratorio se pueden generar lquidos patolgicos, los que se

Facultad de Medicina y Psicologa Revisin

Los punzocortantes se envasan en contenedor rgido rojo como los portaobjetos,

TABLA No. 1: ENVASADO DE RPBI

Denominacin Estado fsico Envasado Descripcin

La sangre y sus componentes, slo en su forma

Solid Cultivos en caja y placas de Microescan

Guantes contaminados, medios de transporte, asas

Facultad de Medicina y Psicologa Revisin

Colorantes y lquido de enjuague de tinciones.

Patolgicos Slido/liquido Biopsias, rganos, animales, tejidos.

Bolsa Amarilla / Envase

Lancetas, agujas, agujas de bolsa de sangra,

El rea temporal de depsito se encuentra previamente sealada en el Laboratorio con el

Ejemplos de reas temporales (RPBI) previamente sealadas en el laboratorio

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De acuerdo a la NOM-087-SEMARNAT-SSA1-2002 el personal responsable del manejo de

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