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Revista de ingeniería bioquímica 80 (2013) 19–26

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Revista de ingeniería bioquímica

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Artículo regular

Influencia del coeficiente volumétrico de transferencia de oxígeno (kLa) en la producción

por lotes de xilanasas por Aspergillus niger van Tieghem en tanque agitado y
biorreactores de transporte aéreo de bucle interno

Michele Michelin a,B,∗, André Manuel de Oliveira Mota a, Maria de Lourdes

Teixeira de Moraes Polizeli B, Daniel Pereira da Silva a,C, António Augusto
Vicente a, José António Teixeira a
a IBB- Instituto de Biotecnología y Bioingeniería, Centro de Engenharia Biológica, Universidade do Minho, Campus Gualtar, Braga, Portugal
B Departamento de Biologia, Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, SP, Brasil
C Núcleo de Engenharia de Produção, Universidade Federal de Sergipe, Aracaju, SE, Brasil

información del artículo abstracto

Historia del artículo: La oxigenación es un parámetro importante involucrado en el diseño y operación de biorre-
Recibido el 7 de mayo de 2013 actores y se puede analizar mediante el coeficiente de transferencia de masa de oxígeno (kLa). En este estudio, las fermentaciones por
Recibido en forma revisada el 25 de agosto de 2013
lotes en el biorreactor de tanque agitado (STB) y el biorreactor de transporte aéreo (ALB) se operaron bajo
Aceptado el 3 de septiembre de 2013
un rango de kLa valores, en un intento de optimizar y comparar las actividades de la xilanasa extracelular y
Disponible en línea xxx
- xilosidasa sintetizada por el hongo Aspergillus niger van Tieghem, utilizando la mazorca de maíz como fuente inductora.
Los niveles más altos de xilanasa se observaron en STB (9000 U l−1; kLa = 30 h−1), mientras que la producción de
Palabras clave:
-xilosidasa fue similar en ambos biorreactores. Sin embargo, cuando se comparó la actividad enzimática para el
Biorreactores
kLa mismo kLa valor (12 h−1) en STB y ALB, las producciones de xilanasa y -xilosidasa fueron mayores en ALB (7000 U l−1
Xilanasa xilanasa; 2100 U l−1 -xilosidasa) que STB (4500 U l−1 xilanasa; 1800 U l−1 -xilosidasa).
- Xilosidasa © 2013 Publicado por Elsevier BV
Elote
Aspergilo

1. Introducción La creciente demanda industrial de enzimas xilanolíticas requiere el desarrollo

Las hemicelulasas microbianas, especialmente las xilanasas, tienen
importantes aplicaciones en varios sectores industriales debido a su enorme
potencial para modificar y transformar el material lignocelulósico, que ha sido
utilizado en una amplia variedad de procesos industriales. [1]. La principal
aplicación industrial actual de las xilanasas es el blanqueo de pulpa de celulosa
donde el pretratamiento de xilanasa reduce el uso de productos químicos a base
de cloro, reduciendo también la generación de compuestos orgánicos de cloro
contaminantes a partir de la degradación de la lignina, que son altamente tóxicos
y mutagénicos, requiriendo tratamiento de los efluentes.
[1-3]. La degradación del xilano involucra un sistema hemicelulítico que
incluye entre otras enzimas la endo-1,4- -xilanasa, que escinde los
enlaces internos en la cadena del xilano, y las -xilosidasas, que
escinden la xilobiosa y los xilooligosacáridos para producir xilosa.
[4].
∗ Autor para correspondencia en: Departamento de Biologia, Faculdade de Filosofia,
Ciências e Letras de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, SP, Brasil.
Tel .: +55 1636023701.
Dirección de correo electrónico: mimichelin.bio@gmail.com (M. Michelin).
de nuevos procesos para asegurar la viabilidad económica de la hidrólisis de
materiales que contienen xilano a escala comercial. Los biorreactores de tanque
agitado se utilizan ampliamente en procesos biotecnológicos que proporcionan
altos valores de calor y tasas de transferencia de masa (debido a una mezcla
eficiente). Uno de los desafíos más importantes en el diseño y operación de estos
biorreactores es la distribución no uniforme de la energía disipada dentro de los
caldos por mezcla, con consecuencias directas en la distribución de la eficiencia de
mezcla y la tasa de transferencia de masa / calor.[5]. Recientemente, las
configuraciones alternativas para biorreactores han comenzado a encontrar
aplicaciones en plantas a gran escala. Uno de los ejemplos son los biorreactores
de transporte aéreo, estos son biorreactores de columna de burbujas modificados
[6], simple de diseñar y construir, y proporciona una buena mezcla que facilita
altas tasas de transferencia de masa y calor con un bajo consumo de energía [7-9]
. La mezcla en biorreactores de transporte aéreo es inducida por burbujas de aire
suministradas a través de difusores en la parte inferior del reactor.[10]. Estos
biorreactores se utilizan normalmente en operaciones que involucran fluidos de
baja viscosidad que no requieren agitación mecánica y, por lo tanto, proporcionan
bajas fuerzas de cizallamiento.[11]. El estudio de parámetros como la agitación y /
o aireación en biorreactores son importantes por su relación con el aporte de
oxígeno a los microorganismos durante el proceso, influyendo en el consumo de
sustrato y posibilitando o inhibiendo la síntesis del producto.

1369-703X / $ - ver el documento preliminar © 2013 Publicado por Elsevier BV

http://dx.doi.org/10.1016/j.bej.2013.09.002
20 M. Michelin y col. / Revista de ingeniería bioquímica80 (2013) 19–26
[12]. El suministro de oxígeno en las fermentaciones aeróbicas constituye un
factor decisivo para el crecimiento de microorganismos y juega un papel
importante en la ampliación de bioprocesos. La eficiencia de la aireación depende
de la solubilización del oxígeno y la velocidad de difusión en el caldo, así como de
la capacidad del biorreactor para satisfacer las demandas de oxígeno de la
población microbiana.[13].
La transferencia de oxígeno se puede analizar y describir mediante
el coeficiente volumétrico de transferencia de oxígeno, kLa, siendo éste, el
parámetro más importante para el diseño y funcionamiento de mix-
Equipos de inyección / burbujeo para biorreactores aeróbicos. kLa Los valores se
ven afectados por muchos factores, como el diseño mecánico, la geometría
del distribuidor de aire y los impulsores, y las condiciones de funcionamiento, como la
velocidad de agitación y / o la tasa de aireación. Además, la composición media, la
concentración y morfología de microorganismos, así como las propiedades del
biocatalizador (por ejemplo, tamaño de partícula y porosidad) también son
factores que influyen kLa valores [5,13-15].
Pocos estudios relacionan la producción de enzimas xilanolíticas en biorre-
actores al coeficiente volumétrico de transferencia de oxígeno (kLa). En esto
contexto, el objetivo de este trabajo fue evaluar la influencia de kLa
en la producción por lotes de xilanasa y -xilosidasa de Aspergilo
Níger van Tieghem en biorreactores de tanque agitado y puente aéreo de circuito
interno, utilizando mazorcas de maíz como fuente inductora, con el fin de obtener una
alta producción enzimática utilizando un sustrato barato y ampliamente disponible.
2. Materiales y métodos
2.1. Condiciones de material, microorganismos y cultivo
La mazorca de maíz fue amablemente suministrada por un agricultor local (Caide,
Lousada, Portugal). Este material se secó a 40◦C durante 12 h, se cortan en trozos
pequeños (1-3 cm) y se muelen con un molinillo de cuchillos para pasar a través de un
Pantalla de 1,0 mm. Después de esto, se almacenó a temperatura ambiente hasta su uso.
El microorganismo utilizado en este trabajo, recolectado de materiales
de descomposición en la región de Ribeirão Preto (São Paulo, Brasil), fue
clasificado y depositado como A. niger van Tieghem por la Colección de
Cultivos de Micología URM de la Universidad Federal de Pernambuco, Brasil.
Los cultivos madre se propagaron en medio PDA (Difco Laboratories,
Becton, Dickinson and Co., Sparks, MD, EE. UU.), A 30ºC.◦C durante 1 semana
y almacenado a 4 ◦C.
El microorganismo se cultivó en medio SR (Segatto-Rizzatti) como
describen Rizzatti et al. [dieciséis], a pH 6,0, que contiene 1% (p / v) de
mazorca de maíz como fuente de carbono. La concentración de esporas en
la suspensión se determinó en una cámara de recuento Neubauer.
Alrededor de las 9× 109 esporas ml−1 se inocularon en matraces Erlenmeyer,
que contenían un volumen total medio del 10% (v / v) del volumen del
biorreactor, y se incubaron en un agitador rotatorio (100 rpm, 30 ◦C) durante
72 h. Luego, estos cultivos se utilizaron como inóculo vertiéndolos
directamente en los biorreactores (STB y ALB).
2.2. Configuración y condiciones de funcionamiento de los biorreactores
2.2.1. Biorreactor de tanque agitado
El biorreactor de tanque agitado (STB) era un Biostat R de 8 l, tipo A5 de
B. Braun Biotech International (Melsungen, Alemania) con un volumen de trabajo
de 5 l, equipado con unidades automáticas de monitorización y control de
temperatura, pH y velocidad de agitación. El recipiente del biorreactor estaba
equipado con dos turbinas Rushton de seis palas. La aireación se reguló mediante
un controlador de flujo másico de 100 SLPM (Alicat, Tucson, AZ, EE. UU.) Y la
temperatura se fijó en un punto de ajuste de 30ºC.◦C. Se utilizaron sondas de pH y
oxígeno disuelto (OD) de Mettler-Toledo para controlar el pH y el OD,
respectivamente. Un diagrama del STB se puede conferir enFigura 1A. Se
realizaron fermentaciones por lotes utilizando también medio SR, a pH 6.0, que
contenía 1% (p / v) de mazorca de maíz como fuente de carbón con las
velocidades de agitación establecidas en 300 o 400 rpm y flujos de aire.
ajustado a 0,2 vvm (1 l min−1) o 0,4 vvm (2 l min−1). Se utilizó un mililitro de
antiespumante 204 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU.) Al comienzo de la
fermentación. Las muestras se recolectaron cada 24 h durante 15 días, se
filtraron y se utilizaron para ensayos enzimáticos.
2.2.2. Biorreactor de transporte aéreo de bucle interno
Se utilizó un biorreactor aéreo de bucle interno (ALB) de 9,5 l con tubo
de tiro concéntrico diseñado y construido en el Departamento de Ingeniería
Biológica de la Universidad de Minho (UMINHO, Portugal). Estaba hecho de
Perspex (polimetilmetacrilato), equipado con instalaciones de monitoreo
automático de temperatura y pH, y la aireación se controló mediante un
controlador de flujo másico de 100 SLPM. El volumen de trabajo fue de 6 l.
Un diagrama del ALB se presenta enFigura 1B y otros detalles están
disponibles en Michelin et al. [17]. La composición del medio de cultivo fue
la misma que en el STR. El biorreactor estaba programado para funcionar a
30◦C en modo por lotes, siendo el distribuidor de aire una placa de agujas
en la parte inferior del biorreactor. El distribuidor estaba compuesto por
tres agujas con un diámetro interno de 0,5 mm. La tasa de flujo de aire
esterilizado osciló entre
0,2 vvm (1,2 l mínimo−1) y 0,5 vvm (3 l min−1) promoviendo una difusión de
aire eficiente en todo el biorreactor. El pH y el oxígeno disuelto se
controlaron con sondas Mettler-Toledo. También se utilizó antiespumante
204 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU.) Al comienzo de la fermentación.
Las muestras se recolectaron cada 24 h durante 15 días, se filtraron y se
utilizaron para ensayos enzimáticos.
2.3. Ensayos enzimáticos
La actividad xilanasa se determinó según lo descrito por Miller. [18]
utilizando 1% (p / v) de xilano de abedul (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO,
EE. UU.) como sustrato. La mezcla de reacción se realizó a 60ºC.◦C
durante 20 min, incubando 0,2 ml de sustrato en tampón McIlvaine, a
pH 5,5, y 0,2 ml del extracto enzimático. -La actividad de la xilosidasa se
determinó como se describe en Kersters-Hilderson et al.
[19] utilizando 0,25% (p / v) pag-nitrofenil- -D-xilopiranósido (PNPxyl;
Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU.) como sustrato. La mezcla de
reacción contenía 50 l de PNP-xyl suspendido en agua destilada, 150 l
de tampón McIlvaine, a pH 4,0 y 200 l del extracto enzimático. Las
muestras se incubaron a 70◦C durante 15 min.
Una unidad de actividad enzimática (U) se definió como la cantidad de
enzima que libera 1 mol de producto por minuto en las condiciones del
ensayo y las actividades se expresaron en U l−1. La productividad se definió
como la relación entre la actividad máxima de xilanasa y el tiempo de
fermentación correspondiente. Las muestras se analizaron por triplicado.
Los valores presentados en este trabajo corresponden a valores medios de
tres experimentos repetidos y tenían una desviación estándar por debajo
del 5%.
2.4. kLuna medida
El coeficiente volumétrico de transferencia de oxígeno (kLa) se midió a
los 30 ◦C en ambos biorreactores (STB y ALB) en medio libre de células por
el método dinámico de gasificación [20]. Este método se realizó rociando
nitrógeno hasta que la concentración de oxígeno disuelto caiga cerca de
cero y luego monitoreando la concentración de oxígeno disuelto después
del inicio de la inyección de aire humidificado en el biorreactor. En este
momento comienza el proceso de transferencia de oxígeno al medio y
continúa hasta que la concentración de oxígeno en el líquido alcanza la
saturación. Los valores de concentración de oxígeno disuelto (OD) fueron
medido en línea usando una O2 electrodo (CellOx 325, WTW), y se registra
directamente en una PC, a través de una placa de adquisición de datos. los
influencia del electrodo de oxígeno en kLa se consideró insignificante debido al
bajo tiempo de respuesta de la sonda (6 s), que fue significativamente menor
de 1 /kLa, correspondiente a un error experimental inferior al 6%.
 21

Figura 1. Diagrama de tanque agitado y biorreactores de transporte aéreo. STB: 1 - controlador de flujo másico; 2 - filtro de aire; 3 - distribuidor de gas; 4 - biorreactor de tanque agitado; 5 - punto de muestra; 6 - oxígeno
Investigacion; 7 - termopar; 8 - agitador; 9 - sonda de pH; 10 - unidad de monitorización con control de pH; 11 - controlador de temperatura; D4 - diámetro del reactor (16,0 cm); H4 - altura del reactor
(35,5 cm); DA - diámetro del agitador (6,5 cm); HAUTOMÓVIL CLUB BRITÁNICO - distancia entre los agitadores (8,0 cm); HA – b - distancia entre el agitador y el fondo del reactor (7,0 cm) (A). ALB: 1 - controlador de
flujo másico; 2 - filtro de aire; 3 - biorreactor de transporte aéreo; 4 - sonda de temperatura; 5 - sonda de oxígeno; 6 - sonda de pH; 7 - unidad de control de temperatura; 8 - unidades de lectura;
DC3 - diámetro de la columna (7,0 cm); DT3 - diámetro superior (19,0 cm); H3 - altura del reactor (95,5 cm); HC3 - altura de la columna (67,0 cm); HT3 - altura superior (19,5 cm); Dr - diámetro del elevador (3,0
cm); Hr - altura del contrahuella (64,0 cm); Dr-bt - distancia entre la parte inferior del tubo ascendente y el distribuidor de aire - 1,7 cm (B).

La variación de la concentración de oxígeno disuelto con el tiempo,
t, se obtuvo, y kLa calculado según la siguiente ecuación:
enC ∗ -C) = enC ∗ -C0) - kLa · t
dónde C* y C son, respectivamente, la concentración de saturación de oxígeno y
la concentración de oxígeno en el líquido. Suponiendo que el líquido
fase líquida como homogénea y siendo C0 la concentración de oxígeno en t
= 0, se determinó el coeficiente de transferencia de masa volumétrica
trazando ln (C * - C) contra el tiempo (t) utilizando MATLAB (MathWorks,
Natick, MA, EE. UU.), versión 7.2.0.232 (R2006a).
La OTR se calculó utilizando el kLa valores obtenidos previamente
(experimentos sin biomasa) y asumiendo que su valor se mantuvo
constante a través de cada fermentación individual y el disuelto
valores de oxígeno medidos a intervalos definidos, I, durante la
fermentación. Los valores de OTR se determinaron utilizando la
siguiente ecuación:
(1)
OTRI = kLC.A ∗ -CI) (2)
2.5. Medida de viscosidad
La viscosidad de cizallamiento se determinó al inicio y al final de las
fermentaciones en ambos biorreactores, utilizando un viscosímetro UK-
Model ELV-8 equipado con un husillo de cono TL6 a diferentes velocidades
de cizallamiento durante 10 min. Todas las mediciones de viscosidad se
repitieron tres veces y la temperatura se controló a 20ºC.◦C.
22 M. Michelin y col. / Revista de ingeniería bioquímica80 (2013) 19–26

35 (p / v) mazorca de maíz. Este es un parámetro importante para comparar biorreactores

aeróbicos, ya que estos biorreactores presentan diferentes configuraciones.
30 ciones y kLa se ve afectado por el diseño del biorreactor.
Se puede observar en Figura 2 ese kLa Los valores aumentaron con el aumento de la

25 tasa de aireación y también con la tasa de agitación en STB. Además, un

más alto kLa Se pueden observar valores para el STB que para el ALB, especialmente
principalmente para las tasas de aireación probadas a 400 rpm. Lo bajokLa en ALB está
20
relacionado con su diseño compuesto por una parte superior de desgasificación agrandada
(h-1)

zona. La función principal de la parte de desgasificación superior es facilitar

15
la liberación de gas. Sin embargo, también promueve la sedimentación, que
ka
L

es fundamental para mantener una alta cantidad de biomasa dentro del

10 biorreactor si se implementa un sistema continuo.[21]. Gaspar y col.[22]
estudiar la influencia de los factores que actúan sobre kLa valor durante Peni-
5 Cillium canescens cultivo para la producción de xilanasa verificó que kLa
aumenta con la velocidad de agitación y la tasa de flujo de aire, en varias turbinas
0 diseños, incluidas las turbinas de disco Rushton con 6 palas.
0,1 0,2 0,3 0.4 0,5 Algunos de estos kLa fueron seleccionados para fermentaciones en estudios
flujo de aire (vvm) de producción enzimática; sino también el efecto de agitación y aireación
fueron evaluados en la producción enzimática. loskLa selección
Figura 2. kLa en función del volumen de flujo de aire obtenido en el biorreactor de tanque agitado (STB)
se hizo considerando similar kLa valores en diferentes condiciones de
Biostat (R) tipo A5 de Braun Biotech International y el biorreactor de transporte aéreo diseñado
y construido en el Departamento de Ingeniería Biológica de la UMINHO, a 30 ◦C. agitación y aireación.
Símbolos: - - STB, 300 rpm; - - STB, 400 rpm; - - ALB. Un factor que influye en la transferencia de oxígeno y tiene gran
importancia en la productividad de un proceso de fermentación es la
3. Resultados y discusión viscosidad del caldo. Esto es una consecuencia de la concentración de
biomasa y la morfología celular, que provoca cambios en las características
3.1. kLun estudio en STB y ALB del caldo y afecta las propiedades hidrodinámicas del biorreactor, incluidas
las prestaciones de mezcla y transferencia de masa.[23,24].
En este trabajo, kLa se calculó para condiciones similares en STB y ALB, La viscosidad del caldo de cultivo se midió durante la fermentación,
utilizando medio libre de células de fermentación SR que contiene 1% detectándose un ligero aumento de la viscosidad.

Fig. 3. Evolución temporal de la actividad xilanasa (A), actividad -xilosidasa (B), oxígeno disuelto (C), velocidad de transferencia de oxígeno (inserto C) y pH (D) en el biorreactor de tanque agitado, para
diferentes kLuna. Símbolos: - - 12 h−1 (300 rpm; 0,2 vvm); - - 17 h−1 (300 rpm; 0,4 vvm); - - 25 h−1 (400 rpm; 0,2 vvm); -© - 30 h−1 (400 rpm; 0,4 vvm).
 M. Michelin y col. / Revista de ingeniería bioquímica80 (2013) 19–26
Figura 4. Evolución temporal de la actividad xilanasa (A), actividad -xilosidasa (B), oxígeno disuelto (C), velocidad de transferencia de oxígeno (inserto C) y pH (D) en el biorreactor de puente aéreo, para diferentes
kLuna. Símbolos: - - 5 h−1 (0,2 vvm); - - 6,5 horas−1 (0,3 vvm); - - 9 horas−1 (0,4 vvm); -© - 12 h−1 (0,5 vvm).
alrededor del quinto día (38 mPa / s) en relación con el medio de células libres (28
mPa / s); sin embargo, este aumento fue similar para ambos biorreactores
y por lo tanto los valores calculados de kLa para ambos biorreactores se consideraron
comparables. Además, para todas las fermentacionesA. niger camioneta
Tieghem creció en cultivo sumergido en forma de gránulos. Se sabe que la
formación de micelios filamentosos en un biorreactor puede aumentar la
viscosidad media, el crecimiento de hongos alrededor de los impulsores y una
reducción en la transferencia de masa, reduciendo así el crecimiento de hongos,
la productividad y el rendimiento del reactor. Por el contrario, el crecimiento de
hongos en forma de gránulos proporciona una buena transferencia de masa y
oxígeno, minimiza los efectos adversos sobre el rendimiento del reactor y no
aumenta la viscosidad del caldo de fermentación.[10,25,26]. Por tanto, en general,
el aumento de la viscosidad del medio se evidencia más en el crecimiento
filamentoso que en el crecimiento de pellets.[27,28].
3.2. Influencia de kLa sobre la producción de xilanasas en STB
En los bioprocesos aeróbicos, el oxígeno es un sustrato clave que se emplea
para el crecimiento, el mantenimiento y en otras rutas metabólicas, incluida la
síntesis de productos. Por lo tanto, se evaluó la influencia de la transferencia de
oxígeno en el biorreactor de tanque agitado y, de acuerdo conFig. 3
las actividades (U l−1) de xilanasa y -xilosidasa en filtrados de
El cultivo de mazorcas de maíz se vio afectado por kLuna. Las tasas más altas
de producción de xilanasa se obtuvieron para la mayor kLa valor (30 h−1
), con una actividad máxima de 9000 U l−1 obtenido después
3 días de cultivo (Fig. 3A). Es importante resaltar que
23
La aireación afectó notablemente la productividad de la xilanasa (U l−1
día−1), independientemente de la agitación: 300 o 400 rpm. Después de
3 días de cultivo, la producción de xilanasa fue casi dos veces más
rápida a 0.4 vvm (2445 U l−1 día−1 para 300 rpm y 3000 U l−1 día−1 a 400
rpm) que a 0,2 vvm (1255 U l−1 día−1 para 300 rpm y 1645 U l−1 día−1
a 400 rpm). También se puede ver que la productividad de xilanasa es mayor para
todos los casos cuando se usa una agitación de 400 rpm.
Siedenberg y col. [29] observó que la producción de niveles de xilanasa a
partir de Aspergillus awamori fueron más altos a 300 rpm, disminuyendo al
aumentar la velocidad del agitador (500 y 750 rpm), donde probablemente el
kLa los valores son más altos. Esto ocurre porque en cultivos sumergidos la producción
de xilanasa por hongos filamentosos también se ve afectada por cizallamiento.
estrés, que está relacionado con la tasa de agitación. Se ha informado que el
efecto nocivo de las fuerzas de cizallamiento como resultado de la intensidad de
la agitación provoca una disminución de la producción de enzimas en algunos
hongos filamentosos.[30,31]. Considerando esto, parece que la relación entre
esfuerzo cortante y kLa es un factor decisivo para lograr buenos niveles
de xilanasa en STB, donde una agitación de 400 rpm y una
ación de 0,4 vvm son condiciones que permiten la producción de los niveles
más altos de xilanasa.
- La producción de xilosidasa fue buena en las condiciones más probadas
diciones, siendo la mayor producción obtenida (alrededor de 2000 U l−1)
por kLa de 25 h−1, después de 7 días de fermentación (Fig. 3B). -xilosidasa
obtenida porA. niger fue superior al obtenido en otros trabajos
por algunas cepas de Thermomyces lanuginosus usando xilano como
fuente de carbono [31–33]. Esta diferencia puede deberse al hecho de que
24 M. Michelin y col. / Revista de ingeniería bioquímica80 (2013) 19–26

- Las xilosidasas son a menudo intracelulares o asociadas a las membranas celulares.

brana y pocos microorganismos secretan esta enzima al medio de
cultivo [34].
Fig. 3C muestra que la concentración de OD se mantuvo por encima del 20%
durante todas las fermentaciones, excepto kLa de 12 h−1, en cuyo caso
el OD cayó a un valor cercano a cero (5%), al final del primer día de
fermentación. La caída en la concentración de OD generalmente se atribuye
a un aumento en el consumo de oxígeno debido al rápido aumento de la
concentración celular en las primeras horas de fermentación (fase
exponencial).[11]. En esta fase el oxígeno consumido por hora es igual
o superior a la tasa de transferencia de oxígeno (kLa) y el OD en el
medio disminuye. El bajo valor de OD observado al inicio
de fermentación para el kLa de 12 h−1 puede haber sido limitante para la
producción de xilanasa, donde los niveles de producción enzimática
eran menores que todas las demás condiciones (Fig. 3A). Estos resultados
muestran que las fermentaciones que utilizan valores bajos de kLa o la agitación y la
aireación no son suficientes para suministrar el oxígeno necesario para los hongos
crecimiento. El inserto deFig. 3C muestra la tasa de transferencia de oxígeno durante el
proceso de fermentación.
Amaral y col. [14] presenta la aireación como un factor crítico en la ampliación
de los procesos fermentativos aeróbicos, ya que el crecimiento y la producción
pueden verse limitados por la concentración de OD. En muchos procesos de
biosíntesis, el suministro de oxígeno al cultivo no es suficiente para satisfacer la
demanda de los microorganismos y, por lo tanto, es uno de los factores más
limitantes para el funcionamiento exitoso de esas fermentaciones.
Después del segundo día también se observó una caída en los valores de pH (
Fig. 3D), que está relacionado con la liberación de subproductos ácidos en el
medio. [35]. Esto puede ser importante en el control de la contaminación
bacteriana. Otra consideración importante es la estabilidad de las enzimas en pH
ácido durante mucho tiempo, ya que después de 15 días de cultivo a 30◦C las
enzimas permanecieron activas.
Figura 5. Producciones de xilanasa y -xilosidasa en STB (A) y ALB (B) en función de kLuna.
Símbolos: - - xilanasa; - - -xilosidasa.
3.3. Influencia de kLa sobre producciones de xilanasas en ALB

Actividades (U l−1) de xilanasa y -xilosidasa en filtrados de

Los cultivos de mazorcas de maíz se analizaron en el ALB y, al igual que en el STR,
las producciones de xilanasa y -xilosidasa se vieron marcadamente influenciadas
por kLuna. En estas condiciones, la síntesis máxima de xilanasa fue
obtenido para los valores más altos de kLa (12 h−1), con una producción
de 7000 U l−1 entre el día 5 y el 11 de fermentación
(Figura 4A). -La producción de xilosidasa también fue mayor para los
kLa (2100 U l−1 en el período de 4 a 6 días) (Figura 4B).
Estos resultados pueden explicarse por la concentración de OD durante
el proceso de fermentación. ParakLa de 12 h−1 (Figura 4C), la concentración de OD se
mantuvo por encima del 20% durante todas las fermentaciones, lo que explica
el mayor nivel de producción enzimática. Para las fermentaciones
donde otros valores de kLa fueron considerados (menos de 12 h−1), El OD
cayó a valores cercanos a cero (3-8%) al comienzo de la fermentación.
mentación, siendo también los valores OTR más bajos en este período (insertar
Figura 4C). Dada la baja concentración de OD en el caldo, el oxígeno se convierte
en un nutriente limitante, lo que sugiere la necesidad de un mayor aporte de
oxígeno para el crecimiento y la producción enzimática. Pellizcos y Pallent
[36] describió la caída de la concentración de OD en los caldos debido a la
alta demanda durante el crecimiento rápido, luego el microorganismo
alcanza la fase estacionaria y la concentración de OD aumenta, porque la
demanda se reduce [37].
El valor de pH para kLa de 12 h−1 cayó a valores cercanos a 2.0-2.5
después del primer día de fermentación, y como ocurrió en STB, esta caída
no ha causado inactivación de enzimas, y fue menos pronunciada
para menor kLa valores (Figura 4D). Fontana y col.[38] sugirió que la
producción de estas hidrolasas se ve favorecida en condiciones de estrés,
terricola hongo en el mismo ALB, utilizando salvado de trigo como fuente de
carbono. Esto está de acuerdo con estudios previos que revelaron queA.
terricola no es un buen productor de -xilosidasa extracelular (datos no
mostrados).
3.4. Relación entre kLay producción de enzimas xilanolíticas en STB
y ALB
El suministro de oxígeno, representado por el kLa valores, demostró ser
un factor importante que afecta la producción de xilanolítico
enzimas por A. niger van Tieghem. Figura 5 muestra la relación entre
producción enzimática y kLa, considerando las actividades más altas
obtenido durante el período de cultivo para cada kLuna.
El STB muestra la mayor producción de xilanasa (9018 U l−1)
para kLa de 30 h−1; esta producción fue casi dos veces mayor que la
obtenida para unkLa de 12 h−1. Para -xilosidasa un valor de 2080 U l−1
fue obtenido por un kLa de 25 h−1; este valor fue un 13,5% superior al
obtenido para unkLa de 12 h−1 y un 6% superior a
que obtuvo por un kLa de 30 h−1 (Figura 5A).
En relación con las producciones de xilanasa y -xilosidasa en ALB,
Se verificó que la producción de enzimas aumentó para mayor kLa valores (Figura
5B). Esta diferencia de comportamiento en los dos biorreactores puede
ser explicado por la alta velocidad de agitación en STB, que promueve un esfuerzo

ya que mientras estudiaba la producción de poligalacturonasa por Aspergillus cortante excesivo que resulta en una disminución en la concentración de biomasa

oryzae se verificó una mayor producción enzimática en medios con valores de pH tración y, en consecuencia, en la producción de enzimas, incluso a altas kLa
inferiores a 3.0. valores. Burkert y col.[35] observó que el crecimiento de la biomasa y
- Producción de xilosidasa por A. niger fue significativamente mayor la producción de enzima fue menor con una alta velocidad de agitación (500 rpm),

que el obtenido por Michelin et al. [17], con el Aspergilo probablemente debido a la velocidad de cizallamiento.
 M. Michelin y col. / Revista de ingeniería bioquímica80 (2013) 19–26 25

8000 8000
A 100
7000 7000

Productividad de xilanasa (U l-1 día-1)

6000 6000
80
Actividad xilanasa (U l-1)

5000 5000

4000 4000 60

HACER (%)
3000 3000

40
2000 2000

1000 1000
20
0 0
0 2 4 6 8 10 12 14 16

tiempo de cultivo (días) 0

0 2 4 6 8 10 12 14 dieciséis

2400 2400
tiempo de cultivo (días)
2200 B 2200

2000 2000 Figura 7. Evolución temporal de la concentración de oxígeno disuelto y la tasa de transferencia de oxígeno

Productividad de β-xilosidasa (U l-1 día-1)

(inserto) en biorreactores de tanque agitado (- -) y de transporte aéreo (- -), para el mismo kLa (12 h−1).
1800 1800

1600 1600
Actividad de β-xilosidasa (U l-1)

1400 1400 se observó máxima productividad en ALB (0.57 U cm−3 h−1) que
1200 1200 STB (0,39 U cm−3 h−1) al mismo kLuna.
1000 1000 Las diferencias en la producción enzimática entre STB y ALB
800 800
observado por el mismo kLa El valor se puede relacionar con la concentración de
OD. A pesar de la OTR más alta en STB que ALB (insertarFigura 7),
600 600
la concentración de DO en STB fue limitante, ya que se observó un valor
400 400
cercano a cero al final del primer día de cultivo, mientras que en el ALB la
200 200
concentración de DO se mantuvo superior al 20% (Figura 7). Allí-
0 0
Por lo tanto, incluso usando un mismo kLa valor, el comportamiento en los dos
0 2 4 6 8 10 12 14 dieciséis

reactores fue diferente, ya que el consumo de oxígeno fue mayor en STB.

tiempo de cultivo (días)
Un factor que puede estar influyendo en el crecimiento y la producción enzimática
Figura 6. Transcurso del tiempo para la actividad xilanasa (símbolos cerrados) y productividad (símbolos es el impacto negativo del esfuerzo cortante causado por la turbina STB en el
abiertos) (A) y la actividad -xilosidasa (símbolos cerrados) y productividad (símbolos abiertos) (B) en tanque micelio; como consecuencia, en este caso se requiere una mayor demanda de
agitado (cuadrado) y biorreactores de transporte aéreo (círculo), para el mismo oxígeno para alcanzar valores de producción enzimática similares a los
kLa (12 h−1).
observados en el ALB. Otra posibilidad podría ser un mayor crecimiento de
microorganismos en STB que conduzca a un mayor consumo de oxígeno. La
validación de esta posibilidad requiere la determinación de la concentración de

3.5. Comparación de la producción enzimática en STB y ALB para el biomasa; sin embargo, esto no fue posible debido a su unión a las mazorcas de

mismo kLun valor maíz (el hongo y la mazorca se mezclan y eran imposibles de separar para medir
con precisión la cantidad de mazorca de maíz consumida y el crecimiento de

Los biorreactores de tanque agitado (STB) y los biorreactores de transporte biomasa).

aéreo (ALB) se utilizan ampliamente en fermentaciones, y varios estudios evalúan Otros autores también observaron que la producción de xilanasa fue mayor

y comparan su comportamiento en procesos biotecnológicos similares. Para este en ALB que en STB [17,29,39]. En todos los casos, la explicación proporcionada fue

estudio, y con el objetivo de comparar estos dos biorreactores en que los biorreactores de transporte aéreo se han utilizado ampliamente en la

la producción de enzimas, la misma kLa valores (12 h−1) (300 rpm y 0,2 fermentación con hongos filamentosos debido a un entorno de bajo cizallamiento

vvm en el STB y 0,5 vvm en el ALB) para el y una buena transferencia de masa. Sin embargo, los resultados presentados en

producción de xilanasa y -xilosidasa durante el proceso de este trabajo indican que las ventajas mencionadas anteriormente deben tener en

fermentación. cuenta los efectos de la agitación mecánica en STR que, por un lado, contribuyen

A pesar de valores similares de kLa en ambos biorreactores, el efecto oculto a una mejora significativa en la transferencia de oxígeno, como se observa para

de la intensidad de la mezcla podría jugar un papel importante y enmascarar tasas de aireación similares y, en el otro lado, a un aumento en la oxi-

Los resultados. Sin embargo, los resultados previos (datos no mostrados) de la intensidad de la
consumo de gen como se ve para similares kLa valores, siendo estos efectos
mezcla mostraron que en condiciones de funcionamiento de STB (300 rpm y
negativos en el caso de producciones de xilanasas y -xilosidasa.
0,2 vvm) y ALB (0,5 vvm) el tiempo de mezcla es similar, entre 10 y 15 s.
4. Conclusiones
Figura 6A y B mostraron que la mayor producción enzimática
ocurrió en el ALB - 7000 U l−1 xilanasa; 2100 U l−1 -xilosidasa La transferencia de oxígeno a las células microbianas en bioprocesos aeróbicos
- en comparación con el STB - 4500 U l−1 xilanasa; 1800 U l−1 - afecta fuertemente la formación del producto al influir en las vías metabólicas y cambiar
xilosidasa. El mismo comportamiento se observa en términos de productividad los flujos metabólicos. Estos biorreactores presentan diferentes configuraciones: en STB
donde los valores también fueron mayores para ALB. hay dos factores principales (aireación y agitación) que influyen en la tasa de
Burkert y col. [35] también comparó la producción de lipasa en STB transferencia de oxígeno, mientras que en ALB solo la aireación juega un papel
y ALB mostrando que las actividades máximas de lipasa fueron importante. Por tanto, era importante considerar
similares en ambos biorreactores, llegando a 21 U cm−3 en el revuelto un mismo parámetro, como kLa, en estudios que comparan bioprocesos en
biorreactor a 300 rpm y 1 vvm (kLa, 21 h−1) y aproximadamente 20 U cm−3 diferentes biorreactores. Los resultados muestran que la producción de xilanasa
en el biorreactor del puente aéreo a 2 vvm (kLa, 21 h−1). Sin embargo, ción, en dos tipos de biorreactores evaluados, está influenciada por el oxígeno
26 M. Michelin y col. / Revista de ingeniería bioquímica80 (2013) 19–26
tasa de transferencia, siendo la mayor producción de xilanasas ocurrida en
el biorreactor que presentó mayor tasa de transferencia de oxígeno (9000 U
l−1, 30 h−1 - STB; y 7000 U l−1, 12 h−1 - ALB).
Sin embargo, cuando se evaluó la producción enzimática para
mismos valores de kLa (12 h−1), las producciones de xilanasa y -xilosidasa
fueron 35% y 16% superiores, respectivamente, en el ALB. Esta
porque la transferencia de oxígeno en un caldo de hongos filamentosos en estos
biorreactores resultó en fenómenos de interacciones complejas, donde varios otros
factores influyeron en la transferencia de oxígeno, como el diseño del biorreactor y el
esfuerzo cortante (en STB).
Expresiones de gratitud
Este trabajo fue apoyado por Coordenação de Aperfeiçoamento de
Pessoal de Nível Superior (1162 / 10-1 CAPES / Brasil) y Fundação para
a Ciência ea Tecnologia (SFRH / BD / 37082/2007 FCT / Portugal).
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