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Instituto Politcnico Nacional

Unidad Profesional Interdisciplinaria de Biotecnologa


Departamento de Bioingeniera
Academia de Ingeniera de Bioconversiones.

Manual de Prcticas
del
Laboratorio de Ingeniera de Reactores y
Biorreactores

Unidad de aprendizaje: Ingeniera de Reactores y Biorreactores


Carrera: Ingeniera Ambiental
Nivel: VI

Carlos Orozco lvarez


Leobardo Ordaz Contreras
Sergio Garca Salas

Agosto 2017
Manual del Laboratorio de Ingeniera de Reactores y Biorreactores

ndice
Prctica 1. Diseo mecnico e instrumentacin de un biorreactor ......................................... 3

Prctica 2. Agitacin, aireacin y mezclado......................................................................... 16

Prctica 3. Determinacin de la VTO (velocidad de transferencia de oxgeno) .................. 22

Prctica 4. Axenia y operacin axnica de biorreactores ..................................................... 30

Prctica 5. Implementacin tecnolgica de sistemas fermentativos: cultivos en lote, cultivos

en lote alimentado y cultivos continuos. .............................................................................. 34

Prctica 6. Limpieza y esterilizacin de recipientes, tuberas, aire y medios de cultivo. ..... 48

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PRCTICA 1

Prctica 1. Diseo mecnico e instrumentacin de un biorreactor

Diseo mecnico e instrumentacin


de un biorreactor

1. INTRODUCCIN

Un biorreactor puede ser definido como todo aquel recipiente o contenedor en el que,
mediante un biocatalizador, ciertas materias primas son transformadas a productos. Es
semejante a un reactor utilizado en la industria qumica en el que los reactantes, al ponerse
en contacto entre ellos, reaccionan con ayuda de un catalizador de naturaleza qumica para
formar productos.

La elaboracin de bebidas alcohlicas, la produccin de productos lcteos fermentados, la


produccin de insulina humana con tecnologa del DNA recombinante, son ejemplos de
procesos en los que se emplean biorreactores. A la transformacin de una materia en un
producto de inters comercial por accin de un biocatalizador, se denomina bioproceso.

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A partir de la segunda guerra mundial los biorreactores han sido ampliamente usados en la
industria de fermentaciones o en la productora de biolgicos y farmoqumicos, para elaborar
los tipos de productos arriba mencionados.

Entre las caractersticas que debe reunir un biorreactor se encuentran las siguientes:

Calidad de mezclado; incluyendo tiempo de mezcla y patrones de flujo que favorezcan


tanto la distribucin de la materia prima en el biorreactor como su conversin a producto.
Altas velocidades de transferencia de masa, momento y calor, a bajo costo o con
economa aceptable.
Factibilidad tcnica y econmica en la construccin de unidades de gran volumen.
Bajos costos de operacin y mantenimiento.
En la gran mayora de los casos debe garantizar una operacin asptica (exceptuando los
ambientales).

Independientemente del tamao y forma de operacin de los biorreactores, una forma de


clasificarlos es la que se muestra a continuacin:

Agitados mecnicamente

Biorreactores Columna
Propelas
Circulacin Airlift
Jet

Cada configuracin tiene sus caractersticas propias, mismas que sern descritas brevemente.

1.1 Biorreactores agitados mecnicamente.


Este tipo de biorreactores es muy empleado, en todas las escalas de produccin, en
laboratorios de investigacin o en la industria de fermentaciones, pueden utilizarse incluso
para fermentaciones de reologa compleja y en procesos en los que se exigen altas
velocidades de transferencia de masa y de calor. Consisten de un cuerpo cilndrico con tapas
elipsoidales, semiesfricas o toriesfricas. Generalmente su relacin altura/dimetro es
menor a 3 y ms comnmente menor a 2. Cuentan con un motor al que se acopla la flecha de
transmisin que contiene a su vez los impulsores que agitarn el lquido. Dependiendo del
tamao del reactor, el motor puede colocarse en la tapa superior o en la inferior, pero
invariablemente se requiere de sellos mecnicos para garantizar el trabajo asptico.
Generalmente la aireacin se realiza a travs de tubos (o placas) perforados, efectundose
la dispersin del aire en las zonas cercanas a los impulsores.

A pesar de su versatilidad, sus costos de construccin, operacin y mantenimiento son muy


onerosos. Por limitaciones tcnicas referentes a la transmisin de potencia y a los problemas

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de sostenimiento del conjunto flecha de transmisin impulsores, no es posible construir


unidades mayores a los 300 m3.

1.2 Biorreactores de columna.


Este tipo de biorreactores carece de sistema de transmisin mecnica para mezclar el caldo
de cultivo. El mezclado se realiza por la inyeccin de aire en el lquido desde el fondo del
recipiente, al dispersarse el aire en burbujas y al ascender causan la turbulencia del lquido.
Generalmente la relacin altura/dimetro es mayor a 3. Si las columnas son grandes se
pueden emplear platos perforados colocados en posiciones intermedias de las mismas para
redispersar las burbujas de gas.

Al carecer de partes mviles tanto la construccin, operacin y mantenimiento de este tipo


de biorreactores son ms econmicos que cualquier otro tipo. Quiz el mayor gasto de
operacin sea el de compresin de aire, en razn de los altos flujos requeridos. Generalmente
se emplean para fermentaciones de baja viscosidad.

1.3 Biorreactores de circulacin.


La denominacin de estos tipos de reactores se debe al patrn definido de circulacin del
lquido en el reactor. Se clasifican en dos grandes grupos: de circulacin externa o interna.
Externa si el flujo del lquido es inducido a circular por un brazo lateral conectado al cuerpo
principal del biorreactor en su parte inferior y superior (figura 1d), mientras que es interna si
el lquido circula en forma definida sin salir del cuerpo principal del reactor (figura 1c). Los
primeros solo se han empleado a nivel experimental, mientras que los segundos se han
llegado a utilizar a nivel industrial, generalmente en el tratamiento de aguas residuales,
alcanzando volmenes de hasta 13,600 m3. En la figura 1 se presentan algunos tipos de
biorreactores.

A partir de que el ser humano toma conciencia de que los altos ndices de contaminacin de
las aguas, del suelo y del aire afectan negativamente su salud y la del medio ambiente en la
que vive, los biorreactores han sido exitosamente empleados en el rea ambiental para
disminuir, en buena medida, los ndices de contaminacin.

Existen varias diferencias entre los biorreactores empleados en los procesos biotecnolgicos
con aquellos utilizados en el rea ambiental, como puede constatarse en la Tabla 1. Respecto
al bioproceso, la diferencia principal radica en que en los primeros se produce un producto
de naturaleza muy distinta a las materias primas empleadas (teniendo el producto un valor
agregado mayor -y hasta mucho mayor- que las materias primas empleadas), mientras que
en los segundos el producto resulta ser la misma materia prima empleada pero sin rastros
de contaminantes, como en los casos de tratamientos de aguas, aire y suelos.

De la definicin de biorreactor mostrada anteriormente, pueden verse 4 aspectos principales


relativos a ellos que son: a) la naturaleza del biocatalizador; b) la naturaleza y concentracin
de los reactantes (sustratos) y productos; c) las condiciones fisicoqumicas y operacionales

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que prevalecern en el biorreactor; d) el material, forma, tamao y modo de operacin del


biorreactor.

Aire Aire

Dt = 45
Tubo de
arrastre

Aire
Aire

Bafle

Aire Aire

Airlift Columna de burbujeo Tanque agitado mecnicamente

Figura 1. Esquemas de algunos tipos de biorreactores.

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Tabla 1.- Diferencias entre los biorreactores empleados en los procesos biotecnolgicos con
aquellos utilizados en el rea ambiental
Del rea biotecnolgica Del rea ambiental
Catalizador Se emplean tanto microorganismos, Por lo general, se emplea
clulas animales o vegetales o partes como biocatalizador a una
biolgicamente activas de ellas (enzimas gran asociacin de
generalmente), generalmente en estado microorganismos
puro, evitando la presencia de otros heterogneos cuyas
entes biolgicamente activos. Slo en poblaciones van cambiando
muy pocos casos se emplean conforme se desarrolla el
asociaciones de microorganismos bioproceso.
(cultivos mixtos) que no suelen sobrepasar
ms de 3 tipos distintos.
Sustratos Generalmente con un grado de pureza Con una extraordinaria
empleados elevado, de composicin constante, no variacin en su composicin
txicos. Poco margen de sustratos y con niveles de toxicidad
muy altos. Las composiciones
de los influentes llegan a
variar con el tiempo.
Condiciones de La gran mayora son sistemas aerbicos, Existen tanto procesos
aerobiosis con muy pocos casos de anaerobiosis. aerbicos como anaerbicos.
En los aerbicos, la velocidad de
transferencia de oxgeno es un factor
crtico
Condiciones de Generalmente aspticos No aspticos, sin embargo,
Asepsia deben existir medidas de
seguridad en el manejo de los
biorreactores para que el
personal no resulte afectado
microbiolgicamente.
Velocidades de Debe asegurarse que los valores ptimos Debido a los grandes
transferencia de de la temperatura, de la presin y del pH, volmenes empleados,
masa, calor y se mantengan constantes durante la pueden permitirse variaciones
momento biorreaccin ms amplias en sus valores.
alcanzadas
Tiempos de Generalmente comprendida en el intervalo Normalmente en das
duplicacin de de minutos hasta horas.
la biomasa
empleada
Dimensiones Varan de acuerdo a la clasificacin del Generalmente de grandes
producto a producir (de alto volumen de volmenes. Se han llegado a
produccin y bajo valor agregado o de construir unidades de hasta
bajo volumen de produccin y alto valor 1500 m3.
3
agregado), desde 0.050 hasta 300 m .

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Materiales de Se utilizan principalmente materiales Materiales no convencionales


construccin inertes tales como aceros inoxidables, pero inertes, tales como
vidrio, plsticos de uso farmacutico, etc. plsticos de uso rudo (PVC,
acrlicos, lucita, etc.) hasta
concreto.
Modos de En su gran mayora cerrados (en lote), le Generalmente continuos
operacin siguen los semicontinuos y por ltimo los
continuos.

Mezclado La intensidad de mezclado a manejar est En reactores anaerobios la


en funcin de la capacidad con que el intensidad del mezclado no
biocatalizador soporte los esfuerzos de representa un factor crtico
corte generados por el sistema de
agitacin mezclado: Las levaduras y
bacterias soportan altos esfuerzos de
corte; hongos, clulas animales y
vegetales no soportan altos esfuerzos de
corte.
Costos de Muy altos por unidad de volumen Bajos por unidad de volumen
construccin
Costos de Muy altos De bajos a moderados
operacin
Costos de Muy altos De bajos a moderados
mantenimiento
Tiempo de En el orden de minutos a horas Generalmente en el orden de
residencia das
hidrulico
pH Normalmente entre 4 y 8 Normalmente entre 5 y 8
Medicin y Existe la necesidad de controlar de Normalmente la medicin de
control de manera precisa variables tales como pH, las variables de la
variables de temperatura, concentracin de oxgeno biorreaccin (pH,
operacin y de disuelto, intensidad de agitacin, flujo de concentracin de materia
proceso aire, etc., a valores que se saben ptimos orgnica, concentracin de
para la biorreaccin. La medicin de lodos, etc.) se realizan fuera
variables generalmente se realiza in situ de lnea. De esta manera
o en lnea mediante sensores que deben resulta ms difcil el
soportar las condiciones en las que se mantenimiento preciso e
efecta la biorreaccin y las que soporte el instantneo de las variables
biorreactor en todas sus etapas (incluida la de proceso.
esterilizacin). As, el mantenimiento
preventivo y correctivo de los sensores
resulta fundamental y la instrumentacin
es costosa.

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Estos 4 aspectos se describen en forma breve:

a) NATURALEZA DE LOS BIOCATALIZADORES


Como biocatalizadores se han empleado microorganismos, clulas animales o
vegetales o partes biolgicamente activas de ellas (enzimas generalmente). Pueden
emplearse en estado puro como en la industria de fermentaciones o como mezclas
de distintas especies biolgicas (cuando se emplean microorganismos se dice que
existe una mezcla de cultivos microbianos) como en el tratamiento de aguas residuales
domsticas o industriales.

Los organismos biolgicamente activos ms comnmente empleados en la industria


biotecnolgica o en el tratamiento de aguas son aquellos clasificados como
hetertrofos aerobios o anaerobios. En trminos generales, los hetertrofos necesitan
carbono, nitrgeno, fsforo y trazas de metales y otros elementos contenidos en ciertas
sustancias orgnicas e inorgnicas, comnmente denominadas, fuentes, para llevar
a cabo sus reacciones metablicas y reproducirse. Dependiendo del gnero y especie
del microorganismo, sus necesidades ambientales y nutricionales sern distintas.

b) NATURALEZA Y CONCENTRACIN DE SUSTRATOS


En la industria de fermentaciones se han empleado una gran variedad de fuentes de
carbono, de nitrgeno, de fsforo y de los otros elementos, con los cuales se prepara
un caldo de cultivo de donde el microorganismo tomar los necesarios para crecer y
para producir el producto de inters. En los procesos de tratamiento (de agua, aire o
suelo), los caldos de cultivo resultan ser nuestras fuentes naturales de agua, aire o
suelo, que han sido contaminadas con sustancias orgnicas e inorgnicas extraas a
ellas que provienen de las actividades propias del ser humano.

El problema de la contaminacin de nuestras fuentes naturales es de tal magnitud que


se hace necesario un esfuerzo conjunto entre sociedades y gobiernos para su solucin
a corto y mediano plazo.

La naturaleza de los elementos contaminantes de las fuentes naturales depende tanto


de la actividad humana (o industrial), como de la fuente misma. Los elementos
contaminantes del aire son predominantemente gaseosos, aunque tambin los hay
slidos de tamaos muy pequeos o finos como residuos de combustibles fsiles mal
quemados y polvos de distinta ndole (esporas de microorganismos, materia fecal,
etc.). Los contaminantes de las aguas pueden ser lquidos, slidos y en menor
proporcin los gases. Los lquidos y slidos pueden ser miscibles y solubles o
inmiscibles o insolubles.

En el caso del tratamiento de aguas (por ejemplo), los materiales orgnicos solubles,
insolubles o en estado coloidal que contaminan las aguas a tratar, pueden ser utilizados
como fuentes de carbono por parte de los microorganismos, quienes los mineralizarn,
degradarn y transformarn en otros compuestos ms sencillos y de ms fcil
eliminacin (ej.: CO2, CH4) o bien los incorporarn al proceso de sntesis de nuevo

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material celular y, por lo tanto, concentrados en la biomasa misma. Esta ltima puede
entonces ser eliminada con ms facilidad por procesos de separacin slido-lquido,
resultando en una disminucin de la contaminacin del agua tratada.

c) CONDICIONES FISICO-QUMICAS Y OPERACIONALES DE LOS


BIORREACTORES
Entre las condiciones fsicas, qumicas y operacionales a tener en consideracin
cuando se trabaja un bioproceso en un biorreactor estn: dentro de las fsicas estn la
temperatura, la presin, las velocidades de transferencias de masa, calor y momento;
dentro de las qumicas se pueden mencionar el pH, las concentraciones de los
biocatalizadores, de los sustratos y de los productos; por parte de las operacionales se
encuentran la intensidad de agitacin de la mezcla de reaccin, los flujos de entradas
y salidas de aire o de sustratos y productos (si existen); etc.

Los valores a manejar de estas condiciones estn supeditados a la naturaleza propia del
biocatalizador. Los distintos agentes biolgicos (microorganismos o enzimas) tienen
sus requerimientos fsicos y qumicos para trabajar de manera ptima y realizar
eficientemente la transformacin de las materias primas a productos, por lo que ser
necesario establecer dichas condiciones en el biorreactor. Mientras que en los
bioprocesos de elaboracin de biolgicos resulta fundamental mantener constantes los
valores ptimos de pH, temperatura y presin mediante finos y precisos sistemas de
control, as como mantener la pureza del cultivo, en los procesos de tratamiento de
aguas, aire o suelos, los valores pueden llegar a variar sustancialmente, incluyendo las
poblaciones microbianas. Se sabe que en un proceso de tratamiento de aguas, las
poblaciones microbianas responsables de la degradacin de la materia orgnica,
fluctan sustancialmente de un biorreactor a otro e incluso en un mismo biorreactor.

d) MATERIAL, FORMA, TAMAO Y MODO DE OPERACIN DEL


BIORREACTOR
Existe una gran variedad de materiales, formas, tamaos y modos de operacin de los
biorreactores que resultara inagotable su tratamiento en esta prctica. Respecto a los
materiales se han usado vidrio, aceros (generalmente inoxidables), plsticos, maderas,
etc. Independientemente del uso del biorreactor, entre los aspectos principales a tomar
en cuenta para la seleccin del material de construccin estn: i) que sean inertes a la
biorreaccin, ii) el costo, iii) la facilidad de manejo y de construccin de unidades
pequeas y de grandes volmenes. En cuanto a formas van desde los cilndricos hasta
los cbicos con dimensiones variables.

A pesar de que existen varias formas de clasificar los modos de operacin de los
biorreactores, una de ellas y quiz la ms generalizada es la siguiente: i) en lote o
discontinuo, ii) semicontinuos, iii) continuos. Cada uno de estos modos o formas de
operacin tienen sus ventajas y desventajas cuando se relacionan a 2 aspectos
principales que son la productividad y la seguridad tanto de la operacin del biorreactor
como de la del producto final. A pesar de que los procesos continuos poseen mayor

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productividad que los procesos en lote, estos son ms ampliamente utilizados en


procesos en gran escala por la seguridad y economa que representa el manejo del
biorreactor y la seguridad del producto final. La mayor productividad de los sistemas
continuos y semicontinuos respecto del lote es la disminucin en gran medida de los
tiempos muertos. La operacin continua es, en teora, indefinida, mientras que en el
lote tiene un tiempo finito caracterstico de las condiciones de la biorreaccin. En los
sistemas continuos existe una variable caracterstica muy importante que es el tiempo
de residencia (tr) o la velocidad de dilucin (D), la cual se tiene que establecer para el
sistema de biorreaccin en particular.

Otra forma de clasificar los modos de operacin de los biorreactores es en cerrados y


abiertos. El modo de operacin en lote se considera un sistema cerrado, mientras que
el semicontinuo y el continuo se consideran abiertos al existir corrientes de entrada
y salida en el biorreactor. Estas 2 ltimas clasificaciones pueden trabajar en forma
asptica o no.

En el caso de los biorreactores utilizados en los sistemas de tratamientos de agua y


aire, por los grandes volmenes a tratar, es comn que trabajen en forma continua y no
asptica.

1.4 INSTRUMENTACIN PARA EL SEGUIMIENTO Y CONTROL DE LA


BIORREACCIN

Los biorreactores estn equipados con distintos instrumentos que se utilizan para facilitar el
registro, anlisis y control de variables de operacin y de parmetros especficos, con fines
de maximizar la productividad y garantizar el xito de la biorreaccin. La instrumentacin,
definida como una ventana al proceso, tiene como objetivo mantener al mnimo la
diferencia entre el valor medido y un valor deseado. El control de un parmetro particular se
lleva a cabo a travs de un sistema que consta de un sensor (o electrodo), un medidor y un
controlador: el sensor es un dispositivo que transforma una magnitud de una propiedad que
se quiere medir, en otra que facilita su medida. El medidor recibe la medida del valor de la
propiedad que emite el sensor. El controlador compara dicha medida con un valor fijo. Del
resultado de la comparacin, el controlador toma una decisin enviando una seal
(generalmente elctrica) a algn dispositivo que ajustar el valor medido de la propiedad
hasta el valor predeterminado o de control (set point). La seal implica usualmente la
modificacin del estado de una vlvula, el encendido o apagado de una bomba dosificadora,
la modificacin de la velocidad de giro de un motor de algn equipo, etc. Si, por ejemplo, se
hace necesario el uso de una determinada fuerza para modificar el estado de una vlvula, se
requerir de un transductor y de un actuador. El transductor es un dispositivo que
convierte un tipo de energa en otro tipo de energa, mientras que los actuadores son
dispositivos capaces de generar una fuerza a partir de energa elctrica, gaseosa o lquida.

Los sensores pueden estar conectados directamente al biorreactor (en contacto directo con la
masa lquida o slida de fermentacin), en cuyo caso se dice que estn en lnea, si no estn
conectados directamente al biorreactor entonces se dice que estn fuera de lnea.

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Debido a la naturaleza de la biorreaccin, se requiere que la gran mayora de los sensores


en lnea renan, entre otros, los siguientes requisitos: i) que sean capaces de resistir el
proceso trmico al que se somete el caldo de cultivo en el biorreactor (esterilizacin con calor
hmedo); ii) que sean capaces de resistir las presiones de operacin; iii) que sean de fcil
calibracin; iv) que muestren valores estables; v) que su mantenimiento sea fcil y econmico
y vi) que tengan una adecuada vida media til. Estos sensores (en lnea), se utilizan,
bsicamente, para medir propiedades fsicas o variables de operacin tales como temperatura,
presin, intensidad de agitacin o velocidad de giro de los impulsores, velocidades de flujo
de lquidos y gases, y para medir ciertas propiedades qumicas como pH, concentracin de
oxgeno disuelto y gaseoso, concentracin de dixido de carbono disuelto en el lquido y en
el gas, concentracin de azcares disueltos, concentracin de algunos productos celulares,
etc.

Para conocer el estado de una variable de operacin o de un parmetro especfico con


sensores fuera de lnea, se deber tomar una muestra del biorreactor (en forma asptica o
no) para que en ella se mida la propiedad.

Entre las propiedades ms comunes que se miden en un biorreactor estn las siguientes:

Temperatura
pH
Flujo de aire
Flujos de influentes y efluentes
Presin
Intensidad de agitacin
Volumen de operacin del biorreactor
Espuma
Concentracin de oxgeno disuelto
Concentracin celular o de lodos (biomasa)
Concentracin de sustratos (materia orgnica)
Concentracin de productos

1.5 DISEO DEL BIORREACTOR

Cuando se disea un biorreactor se deben tomar en cuenta ciertos factores, entre los que
destacan los siguientes:
Volumen
Capacidad de produccin
Material de construccin
Geometra del biorreactor
Tipo de biocatalizador (microorganismo, por ejemplo)
Variables de operacin (temperatura, presin, forma de mezclado, pH, etc.)
Modo de operacin

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Medicin y control de variables de operacin


Trabajo asptico
Concentraciones de sustrato, clulas y producto

El volumen del reactor, el tiempo de operacin y el tiempo de residencia o velocidad de


dilucin requeridos para completar la transformacin biolgica de los sustratos a productos,
se estiman a partir de un balance de masa, de la cintica del proceso y de las consideraciones
anteriores.

Actualmente, los tratamientos biolgicos han cobrado un gran inters en los procesos de
depuracin de aguas residuales. Su utilizacin se fundamenta en el aprovechamiento de la
capacidad de los microorganismos para degradar, acumular, adsorber, precipitar o volatilizar
una gran variedad de contaminantes presentes en aguas o efluentes. Una etapa que juega un
importante rol en el desarrollo de estos procesos, es el diseo de los biorreactores o reactores
biolgicos.

A diferencia de lo que ocurre con equipos para procesos de transferencia de masa o de calor,
no existe una metodologa para el diseo de equipos, dentro de los cuales se desarrolle una
reaccin o conversin bioqumica, debido principalmente a que el diseo del biorreactor
estar regido por el sistema de reaccin especfico y el tipo de microorganismos que se
emplee.

As, en el diseo de este tipo de biorreactores (tratamiento de aguas), se deben tener en


cuenta, adems del tipo de proceso microbiolgico, el efecto de los flujos de entrada, los
tiempos de residencia, el pH, la temperatura, la biomasa, la concentracin de nutrientes y la
velocidad de agitacin para que se desarrolle en forma ptima la conversin de los
contaminantes orgnicos en materiales ms fciles de separar de las aguas tratadas.

Un caso tpico en el diseo de un biorreactor para el tratamiento de aguas es el siguiente:


En su diseo y operacin deben ser considerados los factores que condicionan la
obtencin de un lodo con las caractersticas requeridas para el acoplamiento con la fase
siguiente del tratamiento y que rena las condiciones permitidas para su disposicin
final y de un agua recuperada que pueda ser reincorporada al proceso de potabilizacin.

Los factores que pueden afectar los resultados del proceso son:
Las caractersticas del efluente que se alimenta (porcentaje de slidos, presencia
de cloro, etc.).
La cintica de crecimiento bacteriano y de transformacin de los lodos.
La composicin de la poblacin bacteriana en el biorreactor.
La calidad de la materia orgnica que se aade al proceso.

El funcionamiento estable del reactor depender de los siguientes factores:


Estabilidad en la composicin de los influentes (concentracin de los compuestos
necesarios para el crecimiento y actividad bacterianas -nutrientes y sustratos-).

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Mantenimiento de los parmetros fsico-qumicos en el biorreactor tales como


temperatura, pH, concentraciones de nutrientes y sustratos, etc., en intervalos
relativamente pequeos para que la actividad de los microorganismos sea ptima.
Diseo del sistema para que sea capaz de resistir variaciones de las condiciones
normales de operacin.
Agitacin que impida: a) La formacin de zonas de lodos sin tratar y b) Que no
disminuya significativamente el tamao de los flculos.

Dado que uno de los aspectos formativos de los alumnos de la carrera de Ingeniera
Ambiental se relaciona con el diseo, construccin, implementacin, operacin y
mantenimiento de biorreactores, en la presente prctica se proponen los siguientes objetivos.

2. OBJETIVOS

El alumno describir los diferentes tipos de biorreactores y sus partes, al igual que la forma
como se operan, controlan, esterilizan, cargan y descargan.

El alumno manejar los sistemas de medicin y control de variables de operacin de


biorreactores, tales como temperatura, pH, oxgeno disuelto y espuma.

3. EQUIPO, MATERIALES Y MTODOS

Biorreactores de laboratorio y planta piloto. Instrumentacin para medicin y control de pH.


OD, temperatura y espuma.

3-1 DESARROLLO EXPERIMENTAL

En principio para la sesin de introduccin de esta prctica el alumno deber haber


consultado en las fuentes disponibles el tipo de biorreactores que se emplean a nivel
laboratorio, planta piloto e industrial, tras lo que se le mostrar los diversos tipos de
biorreactores de nivel laboratorio y planta piloto de la unidad para el estudio de sus
componentes.

Los alumnos debern desarrollar la prctica, bajo la gua del profesor, conforme a los
siguientes puntos:
Especificacin terica de la configuracin geomtrica del biorreactor
Especificacin del volumen del biorreactor
Especificacin del material de construccin del biorreactor
Armado del biorreactor
Pruebas hidrulicas en el biorreactor para verificacin de fugas, establecimiento de
tiempos de mezcla, tiempos de retencin, etc.
Especificacin de las condiciones de la biorreaccin (Concentracin de la materia
orgnica en el influente, temperatura, flujo de aire, pH, nivel de oxigenacin, etc.)

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Manual del Laboratorio de Ingeniera de Reactores y Biorreactores

Especificacin de las necesidades de instrumentacin y control en el biorreactor


Medicin de variables en el biorreactor

4, RESULTADOS Y DISCUSIN

El alumno realizar un informe detallado de los biorreactores presentados donde deber


reportar los siguientes puntos:

Tipo de biorreactor.
Capacidad.
Caractersticas geomtricas (incluyendo el esquema del biorreactor).
Sistema de carga y descarga.
Sistema de agitacin del lquido de reaccin.
Patrones de flujo. Sistema de aireacin.
Sistemas de control (incluyendo el sistema de enfriamiento).
Mtodo o forma de esterilizacin de los medios de cultivo, reactor (incluyendo su
limpieza), aire, aditivos de fermentacin (cidos, lcalis, antiespumante, etctera).
Mtodos de Cultivo (lote, lote alimentado o cultivo continuo) que se lleva a cabo en
el biorreactor.
Produccin.
Dispositivo de toma de muestra y de inoculacin.

5. BIBLIOGRAFA

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Adv. Biotech. Process. 1: 1-30.

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610.
3. Schuegerl, K. 1985. Nonmechanical Agitated Biorreactor Systems. En: Comprehensive
Biotechnology, 2: 99-118. Ed. M. Moo-Young, Pergamon Press.

4. Sitting, W. 1983. Fermentation Reactors. Chem. Tech. 13: 606-613.

5. Tapobrata Panda. 2011. Bioreactors. Analyses and Design. McGraw_Hill. New Delhi.

6. Zaror, Z. C. 2000. Introduccin a la Ingeniera Ambiental para la Industria de Procesos.


Ed. Universidad de Concepcin, Chile. 500 p.

7. Zlokarnik, M. 1985. Tower-Shaped Reactors for Aerobic Biological Waste Water


Treatment. En: Biotechnology. 2: 537-569. Edited by Rehm, H. J. y G. Reed.

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Manual del Laboratorio de Ingeniera de Reactores y Biorreactores

PRCTICA 2

Prctica 2. Agitacin, aireacin y mezclado

Agitacin, aireacin
y mezclado

1. INTRODUCCIN

La agitacin y aireacin en un biorreactor se realiza para alcanzar los siguientes propsitos:


a).- Suministrar el oxgeno necesario a los microorganismos para que se realicen
apropiadamente sus actividades metablicas.
b).- Mantener en suspensin a los microrganismos.

1.1 Tanque agitado

En los biorreactores de tanque agitado, la agitacin se lleva a cabo mediante las dos formas
siguientes:
a).- Por el movimiento de dispositivos mecnicos tales como impulsores de tipo turbina o de
propelas u otros.
b).- Por el movimiento ascendente de burbujas de aire en el caso de aquellos procesos que
requieran suministro de oxgeno.
Por lo tanto, la intensidad de agitacin depende de la velocidad de movimiento de los
impulsores y de la velocidad de aireacin.

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Manual del Laboratorio de Ingeniera de Reactores y Biorreactores

La agitacin puede describirse mediante el tiempo de mezclado, el cual se define como el


tiempo que transcurre despus de la adicin de un trazador para alcanzar un 100 % de
homogeneidad. En ocasiones, el porcentaje de homogeneidad es de 95%.

Un mezclado insuficiente puede causar regiones en las que haya altas concentraciones de
inhibidores de crecimiento, deficiencia de oxgeno o de algn otro nutriente, gradientes
importantes de temperatura y pH, que se pueden reflejar en la obtencin de bajas
productividades y bajos rendimientos. Por ello, es importante estudiar el efecto de las
variables de operacin sobre el grado de mezclado que se pueda alcanzar en el biorreactor.

1.2 Columna

En los biorreactores de columna la agitacin se lleva a cabo mediante el movimiento


ascendente de las burbujas de aire. El nmero y tamao de las burbujas de aire dependen de
la velocidad de aireacin, de las propiedades fsicas del caldo de cultivo, del tipo de dispersor,
de la altura de la columna y de la presencia de dispersores colocados a lo largo de la columna.
Un aumento en la velocidad de aireacin, aumentar la fraccin de gas retenido y las
velocidades locales del lquido. Junto con esto, se hacen ms pronunciados los perfiles
parablicos de la fraccin de gas retenido a travs de la seccin transversal de la columna
con su mximo en el centro.

El elemento estructural a travs del cual tiene lugar la dispersin del gas se llama dispositivo
de dispersin primaria. El gas dispersado inicialmente puede ser redispersado, esto se lleva
a cabo por dispositivos de dispersin secundaria. En las columnas de burbujas de una etapa
y en las columnas de burbujas multietapa, el aire se introduce a travs de dispositivo de
dispersin primaria, tal como un tubo perforado, un plato perforado o un plato sinterizado,
en donde es dispersado finamente. Tambin, las burbujas de aire que aumentan de tamao
debido a la coalescencia pueden ser redispersadas al pasar a travs de dispositivos de
dispersin secundaria, tales como mallas o bandejas perforadas colocados a lo largo de la
columna. En los biorreactores de columna de burbujas multietapa, la dispersin de aire se
lleva a cabo predominantemente en los dispositivos de dispersin primaria

1.3 Airlift

Los biorreactores airlift tienen forma de columna o torre, en su interior tienen al menos dos
zonas, una de flujo ascendente y otra de flujo descendente. El movimiento del lquido se debe
a que en dichas zonas la densidad de la dispersin gas-lquido es diferente porque hay mayor
cantidad de aire en la zona de flujo ascendente que en la de flujo descendente. La diferencia
de las fracciones de gas retenido, es una medida de la diferencia de densidades entre las
dispersiones gas-lquido en dichas zonas, la cual es la fuerza motriz para la circulacin del
lquido en el biorreactor.

Debido al movimiento del lquido, las burbujas de gas en la zona de flujo ascendente subirn
ms rpido, disminuyendo la fraccin de gas retenido y la diferencia de presin hidrosttica.

17
Manual del Laboratorio de Ingeniera de Reactores y Biorreactores

En contraste a las condiciones de una columna de burbujas, los biorreactores airlift se


caracterizan por tener fracciones de gas retenido menores y por una distribucin ms
uniforme de la fase gaseosa a travs de la seccin transversal de la zona de flujo ascendente,
con un mximo de la fraccin de gas retenido local cerca de la pared de la zona de flujo
ascendente. Tambin, en contraste con las columnas de burbujas, los airlift muestran
velocidades de lquido mucho ms altas. La velocidad del lquido afecta decisivamente todos
los parmetros que caracterizan el desempeo del biorreactor, tales como la fraccin de gas
retenido, el tiempo de mezclado y el desempeo en cuanto a transferencia de masa y calor.
En general, la velocidad del lquido en los biorreactores airlift se determina por la velocidad
de aireacin, la geometra del biorreactor y las propiedades fsicas de la fase lquida.

El mezclado del lquido es predominantemente producido por la circulacin del lquido y en


menor grado por la dispersin axial debida al ascenso de las burbujas de aire. El mezclado
ocurre predominantemente en las zonas de deflexin superior e inferior, debido a las
diferencias de velocidad del lquido ah existentes. Para una geometra definida, la rapidez
del mezclado puede expresarse en trminos del tiempo de circulacin, el cual se define como
el tiempo en el que el lquido recorre una vuelta completa dentro del biorreactor. Por ello, el
conocimiento del tiempo de circulacin y de los factores que lo afectan es necesario para el
diseo, modelado y operacin de un biorreactor airlift.

En la sesin de introduccin, los alumnos presentarn las ecuaciones para calcular la potencia
de agitacin sin aireacin, la potencia de agitacin con aireacin y la potencia de aireacin.

2. OBJETIVO

2.1 Tanque agitado


Determinar el tiempo de mezclado en un biorreactor de tanque agitado bajo diferentes
condiciones de aireacin y agitacin.

2.2 Columna
Determinar el tiempo de mezclado y la fraccin de gas retenido global en un biorreactor de
columna de burbujas, bajo diferentes condiciones de aireacin.

2.3 Airlift
Determinar el tiempo de circulacin, el tiempo de mezclado y las fracciones de gas retenido
global bajo diferentes condiciones de aireacin.

3. EQUIPO, MATERIALES Y MTODOS

3.1 Biorreactores
Biorreactor de tanque agitado.

18
Manual del Laboratorio de Ingeniera de Reactores y Biorreactores

Biorreactor de columna
Biorreactor airlift

3.2 Instrumentacion
Cronmetros.
Rotmetros.
Medidor de pH con adquisicin de datos en lnea.
Computadora y software para la adquisicin de datos en lnea.

3.3 Reactivos
Solucin de NaOH 6N.
Solucin de HCl 6N.
Soluciones reguladoras de pH, de 4 y 9.

3.4 Determinacin del tiempo de mezclado en los biorreactores de tanque agitado, columna
de burbujeo y airlift.

Por el mtodo de adicin de trazadores, tales como cidos y bases.

3.5 Determinacin de la fraccin de gas retenido global en los biorreactores de tanque


agitado, columna de burbujeo y airlift.

Por el mtodo de expansin, midiendo el volumen del lquido aireado y el volumen del
lquido sin airear.

4. DESARROLLO EXPERIMENTAL

4.1 Actividades previas


a.- Medir las dimensiones de todas las partes del biorreactor.
b.- Llenar el biorreactor con agua de la llave.
c.- Agregar al biorreactor 0.2 ml de la solucin de indicador.

4.2 Condiciones de operacin


Tanque agitado
a.- Las velocidades de agitacin sern: 300 y 600 rpm.
b.- Para cada velocidad de agitacin, se probarn las siguientes velocidades de
aireacin: 0.3, 0.6, 1.0, 1.3, 1.6 vvm.

Columna de burbujeo
a.- Velocidades de aireacin: 0.3, 0.6, 1.0, 1.3, 1.6 vvm.
Airlift
a.- Velocidades de aireacin: 0.3, 0.6, 1.0, 1.3, 1.6 vvm.

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Manual del Laboratorio de Ingeniera de Reactores y Biorreactores

4.3 Medicin del tiempo de mezclado.


Mtodo de adicin de pulsos.
a.- El punto de adicin de pulsos de HCl se realizar lo ms alejado del electrodo de pH. El
volumen a agregar depende del volumen de lquido en el biorreactor.
b.- Reajustar el pH a un valor entre 8.5 y 9.0 adicionando NaOH
c.- Medir el nivel del lquido aireado; y medir nuevamente el nivel pero ahora sin airear.
d.- Cambiar las condiciones de operacin y repetir los pasos anteriores.

5. RESULTADOS Y DISCUSIN

5.1 Tanque Agitado


a.- Calcule el tiempo de mezclado
b.- Construya grficas del tiempo de mezclado en funcin de la velocidad de aireacin
(expresada como vvm y vs).
c.- Calcule la potencia de agitacin sin aireacin y con aireacin.
d.- Calcule la potencia de aireacin (mida el flujo de aire y la presin de entrada del aire al
reactor).
e.- Obtenga las correlaciones matemticas de las relaciones del tiempo de mezclado con las
variables de operacin empleadas.

5.2 Columna
a.- Calcule el tiempo de mezclado.
b.- Construya grficas del tiempo de mezclado en funcin de la velocidad de aireacin
(expresada como vvm y vs).
c.- Calcule la potencia de aireacin.
d.- Obtenga las correlaciones matemticas de las relaciones del tiempo de mezclado con la
velocidad de aireacin (expresada como vvm y vs).

5.3 Airlift
a.- Elabore grficas de pH en funcin del tiempo.
b.- Calcule el tiempo de circulacin (diferencia de tiempo entre cada cresta valle) y el
tiempo de mezclado (tiempo de estabilizacin de la lectura de pH)
c.- Construya grficas del tiempo de circulacin en funcin de la velocidad de aireacin
(expresada como vvm y vs).
d.- Construya grficas del tiempo de mezclado en funcin de la velocidad de aireacin
(expresada como vvm y vs).
e.- Calcule la fraccin de gas retenido global.
f.- Calcule la potencia de aireacin.
g.- Obtenga las correlaciones matemticas de las relaciones del tiempo de mezclado con la
velocidad de aireacin (expresada como vvm y vs).

La discusin deber incluir al menos lo siguiente:


A.- Comparacin de los tiempos de mezclado obtenidos en cada condicin de operacin.
B.- Compare las potencias de aireacin y de agitacin.

20
Manual del Laboratorio de Ingeniera de Reactores y Biorreactores

C.- Comparacin de las fracciones de gas retenido.

6. BIBLIOGRAFA
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9. Weiland, P. y V. Onken. 1981. Differences in the behaviour of bubble columns and airlift
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Manual del Laboratorio de Ingeniera de Reactores y Biorreactores

PRCTICA 3

Prctica 3. Determinacin de la VTO (velocidad de transferencia de oxgeno)

Determinacin de la
VTO (velocidad de transferencia de
oxgeno)

1. INTRODUCCIN

Las conversiones microbianas aerbicas son reacciones de oxidacin que requieren oxgeno
molecular disuelto. Una gran diferencia del oxgeno con respecto a otros nutrientes, es su
extremadamente baja solubilidad en agua. Consecuentemente, la transferencia de oxgeno
puede llegar a ser uno de los principales factores limitantes de la productividad celular y/o
de metabolitos, debido a la influencia de la concentracin del oxgeno disuelto sobre las
actividades metablicas de las clulas. La velocidad de transferencia de oxgeno de un
biorreactor depende de las condiciones de operacin (aireacin y/o agitacin) y de las
propiedades fsicas del lquido. La ecuacin que describe la velocidad de transferencia de
oxgeno (VTO) es:

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Manual del Laboratorio de Ingeniera de Reactores y Biorreactores

VTO = kLa (C* - C) (1)

donde:
kLa : coeficiente volumtrico de transferencia de oxgeno (h-1).
C*: concentracin de oxgeno disuelto en equilibrio con la fase gaseosa (g/L).
C: concentracin de oxgeno disuelto (g/L).

El kLa es un parmetro que sirve para tener una idea de la rapidez con la que se transfiere
oxgeno del aire al lquido contenido en un biorreactor. Existen diferentes mtodos para
determinar la velocidad de transferencia de oxgeno. Dos de ellos son el mtodo del sulfito y
el mtodo dinmico.

Otro parmetro importante que determina la velocidad de transferencia de oxgeno de un


biorreactor es la fraccin de gas retenido () o "gas holdup", definido como la fraccin de
volumen de la dispersin gas-lquido que es ocupada por la fase gaseosa. Cuando el tamao
promedio de las burbujas es constante, una mayor fraccin de gas retenido, implica una
mayor rea interfacial gas-lquido y en consecuencia una mayor transferencia de oxgeno.

La velocidad de transferencia de oxgeno es determinada de manera importante por el rea


superficial de las burbujas de aire, de aqu que el aire se disperse en forma de burbujas
pequeas para proveer una gran rea de contacto entre las fases lquida y gaseosa. Sin
embargo, en algunos lquidos, las burbujas pequeas tienden a unirse formando burbujas ms
grandes. As con una dispersin primaria muy fina y dependiendo de las propiedades fsicas
del lquido y de la intensidad de la turbulencia dentro del biorreactor, las burbujas pueden
crecer hasta aproximadamente 6 mm de dimetro despus de dejar la zona de dispersin. Este
fenmeno conocido como coalescencia de las burbujas, es causado por el hecho de que una
pelcula lquida entre dos burbujas de aire adyacentes se hace cada vez ms delgada hasta
que eventualmente se rompe.

En una dispersin gas-lquido donde el lquido es un lquido puro se presenta un


comportamiento 100% coalescente,. Al ir aumentando la concentracin de electrolitos
disueltos en dicho lquido, se va inhibiendo la coalescencia de las burbujas. Tambin la
presencia de protenas, alcoholes y substancias surfactantes, afecta el grado de coalescencia
de las burbujas. La coalescencia de las burbujas afecta entonces el dimetro de las burbujas.
ste, junto con la fraccin de gas retenido, determina el rea superficial de contacto entre las
fases lquida y gaseosa.

Si el oxgeno molecular no fuera continuamente transferido del aire al lquido donde se


desarrollan los microorganismos, el oxgeno disuelto sera consumido en pocos segundos
bajo condiciones normales de operacin, debido a la baja solubilidad del oxgeno en agua. El
suministro del oxgeno es por lo tanto un aspecto muy importante en el diseo de
biorreactores para procesos aerbicos.

El kLa es un parmetro que depende del grado de coalescencia del lquido. Por ejemplo, el
kLa empleando una solucin acuosa con una fuerza inica de I=0.4, es ms grande, por un
factor de seis, que el obtenido con agua. Esto es debido a un aumento del rea interfacial.

23
Manual del Laboratorio de Ingeniera de Reactores y Biorreactores

En general, en los biorreactores de columna de burbujas se obtienen fracciones de gas


retenido ms grandes, mientras que el los biorreactores airlift, la fraccin de gas retenido
disminuye al aumentar la velocidad de circulacin del lquido. La velocidad del lquido
representa por lo tanto, un parmetro muy importante para adaptar la fraccin de gas retenido
y el tiempo de residencia promedio de las burbujas a los requerimientos de proceso.

En los biorreactores airlift, la velocidad de transferencia de masa cambia a lo largo de la ruta


de flujo de una manera complicada, debido a que el rea interfacial y la diferencia de
concentracin de oxgeno cambian de una altura a otra debido a la expansin o compresin,
al consumo de oxgeno y a cambios en la presin hidrosttica.

2. OBJETIVO

Determinar la velocidad de transferencia de oxgeno (VTO), el coeficiente volumtrico de


transferencia de oxgeno (kLa) y la fraccin de gas retenido global () en diferentes tipos de
biorreactores.

3- EQUIPO, MATERIALES Y MTODOS

3.1 Biorreactores
Biorreactor de tanque agitado.
Biorreactor de columna de burbujeo.
Biorreactor airlift.
Electrodo y medidor de oxgeno disuelto.

3.2 Reactivos
Sulfito de sodio
Sulfato de cobre pentahidratado
Solucin de Yodo 0.1 N.
Solucin de Tiosulfato de sodio 0.1 N.
Solucin de almidn soluble al 1%.

3.3 Mtodo del sulfito para la determinacin de VTO y kLa.


En el mtodo de oxidacin del sulfito, la oxidacin del in sulfito a in sulfato es casi
instantnea y la velocidad es independiente de las concentraciones de sulfito y de oxgeno
disuelto. Puesto que la velocidad de reaccin es mucho ms rpida que la velocidad de
transferencia, la velocidad de oxidacin es controlada por la velocidad de transferencia de
oxgeno a la solucin, donde la C es prcticamente de cero. Para determinar el kLa por este
mtodo, se usa una solucin de NaSO3 que contiene Cu+2 como catalizador, despus de un

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Manual del Laboratorio de Ingeniera de Reactores y Biorreactores

tiempo de operacin, se toma una muestra para determinar la concentracin de in sulfito


que no reaccion mediante la titulacin con una solucin de Yodo. El Yodo que no reaccion
se cuantifica titulndolo con Tiosulfato de sodio.

Las reacciones que se llevan a cabo en este mtodo son:

2 Na2SO3 + O2 2 Na2SO4

2 Na2SO3 + 2 I2 + 2 H2O 2 Na2SO4 + 4 HI

2 I2 + 4 Na2S2O3 4 NaI + 4 Na2S4O6

3.4 Preparacin de soluciones


Solucin de Sulfito de sodio 0.6 N.
Esta solucin se prepara justo antes de ser empleada. El volumen a preparar depende del
volumen de operacin del biorreactor que empleen.

Solucin de Sulfato de cobre.


La solucin a preparar deber tener una concentracin tal que al agregarla al biorreactor
resulte en una concentracin de 0.003 M.

3.5 Determinacin del kLa por el mtodo dinmico.

Este mtodo se basa en un balance dinmico de oxgeno bajo condiciones no estacionarias.


Cuando se aplica este mtodo en un biorreactor que no contiene microorganismos se usa la
ecuacin (2); es igual que la ecuacin (1) pero sustituyendo VTO por el cambio de la
concentracin de oxgeno con respecto al tiempo (dC/dt).

dC
k L a (C * C ) (2)
dt

En este mtodo el suministro de aire se reemplaza por un suministro de nitrgeno, que


desplaza al oxgeno presente en el seno del lquido, disminuyendo C. Despus se inicia la
aireacin a una velocidad constante y se mide el aumento de C. En esta etapa, el balance de
oxgeno se describe por la ecuacin (2), que al integrarla entre los lmites C1 y C2 obtenemos
la ecuacin (3). Una grfica de ln[(C*- C2)/(C* - C1)] vs tiempo produce una lnea recta con
una pendiente que es igual a kLa. La figura (1a) muestra el cambio de C y la figura (1b)
muestra la lnea obtenida con la ecuacin (3).

25
Manual del Laboratorio de Ingeniera de Reactores y Biorreactores

C * C2
ln k L a t 2 t1 (3)
C * C1

Eliminacin
C * C2
de oxgeno ln
Inicio de C * C1
C
aireacin

Tiempo
Tiempo
(a) (b)

Figura 1. Determinacin de kLa usando el mtodo dinmico.

3.6 Determinacin de la fraccin de gas retenido global por el mtodo de expansin


Medir el volumen del lquido aireado y el volumen del lquido sin airear

DESARROLLO EXPERIMENTAL

3.7 Determinacin del kLa por el mtodo del sulfito


o Agregar al biorreactor la solucin de Sulfito de sodio 0.4 M.
o Adicionar la solucin de Sulfato de cobre al biorreactor.
o Ajustar el pH a un valor de 7.2 con HCl concentrado.
o Poner a funcionar el biorreactor de acuerdo a las condiciones de operacin.
o Despus de que el biorreactor alcance una operacin estable, tomar una muestra de 1
mL y verterla a un matraz erlenmeyer de 250 mL, que contiene 10 mL de la solucin
de Yodo 0.1N. Este tiempo de toma de muestra es el tiempo cero.
o Dependiendo de la capacidad de transferencia de oxgeno del biorreactor, se tomarn
muestras cada X tiempo. El tiempo ser sugerido por el profesor y se establecer de
acuerdo a los resultados que se tengan de la titulacin de la segunda muestra.
o Despus de tomar 5 muestras, detener la aireacin y/o la agitacin del biorreactor.
o Titular el exceso de Yodo de los matraces donde se depositaron las muestras con la
solucin de Tiosulfato de sodio 0.1N. Registrar el volumen gastado de Tiosulfato de
sodio.

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Manual del Laboratorio de Ingeniera de Reactores y Biorreactores

3.8 Determinacin del kLa por el mtodo dinmico


o Calibrar el electrodo de oxgeno disuelto e instalarlo en el biorreactor.
o Llenar el biorreactor con agua de la llave hasta alcanzar el volumen de operacin.
o Poner a funcionar el biorreactor de acuerdo a las condiciones de operacin.
o Despus de que el biorreactor alcance una operacin estable, suministrar nitrgeno
para que la C disminuya.
o Cuando la C sea baja, del orden de 0% a 10% de saturacin, suspender el suministro
de nitrgeno e iniciar el suministro de oxgeno a un flujo correspondiente a una
condicin de operacin, registrando el % de saturacin de oxgeno disuelto cada 15
s. Este tiempo puede ser diferente de acuerdo a la capacidad de transferencia de
oxgeno del biorreactor. Despus del primer experimento usted establecer cada
cuanto tiempo debe registrar % de saturacin de oxgeno disuelto.
o Cuando el % de saturacin de oxgeno disuelto sea alto, del orden de 90% a 100%
puede terminar el experimento.

3.9 Condiciones de operacin


Las siguientes condiciones de operacin se siguieren, queda en el profesor seguirlas o
cambiarlas por otras, de acuerdo al tipo y tamao de biorreactor que se utilice.

Biorreactor tanque agitado.


Velocidades de agitacin: 100 y 300 rpm.
Para cada velocidad de agitacin se probarn las siguientes velocidades de aireacin: 0.3,
0.6, 1.0, 1.3 y 1.6 vvm.

Biorreactores de columna de burbujeo y airlift.


Velocidad de aireacin: 0.3, 0.6, 1.0, 1.3 y 1.6 vvm.

3.10 Medicin de la fraccin de gas retenido global por el mtodo de expansin.


Medir el nivel del lquido sin airear y el nivel del lquido aireado para cada condicin de
operacin en cada tipo de biorreactor

4. RESULTADOS

4.1 Para el mtodo del sulfito

a.- Elabore graficas del volumen de Tiosulfato de sodio (mL) gastado en las titulaciones vs
el tiempo (h).
b.- Calcule la velocidad de transferencia de oxgeno (VTO) de acuerdo a las ecuaciones (4).
c.- El cociente (V2-V1)/(t2-t1) es la pendiente de la grafica del volumen de Tiosulfato de sodio
(mL) gastado en la titulacin vs el tiempo (h).

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Manual del Laboratorio de Ingeniera de Reactores y Biorreactores

V2 V1 N A
VTO (4)
t 2 t1 V

Donde:
V1 y V2: volmenes de la solucin de Tiosulfato de sodio gastados (en mL), correspondientes
al tiempo t1 y t2 (en h), respectivamente.
N: normalidad de la solucin de Tiosulfato de sodio (meq/mL).
V: volumen de muestra (L).
A: equivalente estequiomtrico de oxgeno a Tiosulfato de sodio e igual a 0.25 mMoles
O2/meq de Tiosulfato de sodio.

d.- Calcule el coeficiente volumtrico de transferencia de oxgeno (kLa) de acuerdo a la


ecuacin (1).
e.- Elabore una grfica de kLa en funcin de fraccin de gas retenido, velocidad de agitacin,
velocidad de aireacin, potencia de agitacin con aireacin y potencia de aireacin.
f.- Obtenga la correlacin del kLa en funcin de cada una de las variables mencionadas en el
prrafo anterior.

4.2 Para el mtodo dinmico

a.- Tabule los valores de tiempo (s) y % de saturacin de oxgeno. Calcule el valor de C*
(g/L) usando la Ley de Henry; este valor es el 100% de saturacin. Calcule la C (g/L). Haga
una grafica de C (g/L) vs tiempo (h).
b.- Tabule los valores necesarios para que elabore una grafica que le permita obtener el kLa
(h-1)
c.- Calcule la VTO, el kLa y la fraccin de gas retenido global para cada condicin de
operacin.
d.- Obtenga la correlacin del kLa en funcin de la fraccin de gas retenido, velocidad de
agitacin, la velocidad de aireacin, la potencia de agitacin con aireacin y la potencia de
aireacin.

5. DISCUSIN
La discusin deber contener al menos la siguiente informacin:

a.- Comparacin de las diferentes condiciones de operacin y fracciones de gas retenido con
respecto a los valores del kLa.
b.- Comparacin de los valores de kLa que obtuvo para cada uno de los biorreactores
empleados y explique el porqu de las diferencias.
c.- Cul es el aspecto de la dispersin gas-lquido para cada condicin de operacin.

28
Manual del Laboratorio de Ingeniera de Reactores y Biorreactores

d.- Explicacin de los valores de kLa de los lquidos coalescentes y de los lquidos no
coalescentes.

6. BIBLIOGRAFA

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29
Manual del Laboratorio de Ingeniera de Reactores y Biorreactores

PRCTICA 4
Prctica 4. Axenia y operacin axnica de biorreactores

Axenia y operacin axnica de biorreactores

1. INTRODUCCIN

La axenia es cuando un cultivo de un microorganismo se desarrolla en un ambiente donde no


hay ningn otro organismo vivo. Entonces, una operacin axnica de un biorreactor se refiere
al mantenimiento de la axenia gracias al buen funcionamiento de los filtros absolutos de aire;
de los sellos mecnicos, que permiten el giro de la flecha que sostiene a los impulsores; de
los sellos de vapor de las entradas de cido, lcali, antiespumante y salidas, como por ejemplo
la toma de muestras.

Una condicin importante para iniciar una operacin axnica de biorreactores es que en ellos
exista una condicin asptica. La asepsia se considera como el conjunto de procedimientos
destinados a eliminar o retirar microorganismos de un biorreactor y de todas las tuberas
conectadas a l, con el propsito de asegurar que nicamente est presente el microorganismo
responsable de efectuar la bioconversin de materias primas a un producto especificado. En

30
Manual del Laboratorio de Ingeniera de Reactores y Biorreactores

consecuencia, la asepsia del biorreactor y de las tuberas asociadas a l garantiza que los
procesos de bioconversin se lleven a cabo sin contaminaciones microbianas.

Los microorganismos contaminantes pueden competir con el microorganismo cultivado por


el substrato o pueden desplazarlo al tener una velocidad de crecimiento mayor, incluso
pueden producir sustancias que daen al microorganismo cultivado o inactiven a las enzimas.
Por lo tanto, la presencia de microorganismos contaminantes ocasionan que los rendimientos
y productividades establecidos no se puedan alcanzar, ocasionando prdidas econmicas.

Para lograr la asepsia del biorreactor y de las tuberas asociadas a l, se deben proponer desde
la etapa de diseo, una geometra interna y arreglos de tuberas que eviten la acumulacin de
sustancias al llevar a cabo el vaciado de ellos. Las sustancias acumuladas pueden propiciar
una contaminacin. Tambin, la asepsia se facilita mediante una limpieza efectiva del
biorreactor y de las tuberas, lo que se alcanza al especificar materiales de construccin con
un acabado que evite el atrapamiento de partculas slidas con microorganismos. Las
partculas slidas eventualmente limitan la transferencia de calor, evitando el calentamiento
de los microorganismos a la temperatura de esterilizacin y por lo tanto, dejndolos viables
para generar una contaminacin.

Una vez lavado el biorreactor y las tuberas, el biorreactor se llena con medio de cultivo para
proceder a la esterilizacin. Despus de la esterilizacin el biorreactor debe operar
aspticamente. Para lograrlo, es necesario el buen funcionamiento del sello mecnico para
mantener una presin positiva que evite la entrada de microorganismos. Tambin se requiere
el ms alto aseguramiento posible de la integridad y eficiencia de remocin del filtro para la
esterilizacin del aire.

Existen diferentes mtodos para probar la integridad de filtros, uno de ellos es la prueba de
la intrusin del agua. Es una prueba prctica y validada que se puede considerar para probar
la integridad in situ de los filtros hidrofbicos para la esterilizacin del aire. Otra prueba es
la de mantenimiento de la presin.

2. OBJETIVO

El alumno conocer la prueba de mantenimiento de la presin para probar la integridad de


filtros de aire con los que se garantice una operacin axnica en biorreactores.

3. MATERIALES Y MTODOS

3.1 Biorreactor
Biorreactor agitado de 14 L equipado con prefiltros y filtros hidrofbicos para la
esterilizacin de aire.
3.2 Instrumentacin

31
Manual del Laboratorio de Ingeniera de Reactores y Biorreactores

Cronmetro.
Rotmetro.
Manmetro.
Termmetro.

3.3 Reactivos
Agua desionizada
Isopropanol

3.4 Prueba de mantenimiento de la presin


La prueba de mantenimiento de la presin es una forma modificada de una prueba de flujo
difusivo, que es la prueba de flujo hacia delante corriente arriba del filtro. sta puede llevarse
a cabo despus de la esterilizacin del filtro, antes de la filtracin y despus de la filtracin
estril, puesto que las conexiones estriles corriente abajo no se desconectan. Una ventaja de
la prueba de mantenimiento de la presin es que tambin confirma la integridad de la unidad
de filtracin, incluyendo los sellos de la carcasa.

3.5 Procedimiento experimental

3.5.1 Prueba de mantenimiento de la presin


1. Mojar la membrana del filtro con una mezcla de isopropanol agua 60:40 (v/v).
2. Instalar el filtro en la carcasa.
3. Presurizar la unidad de filtracin a una determinada presin.
4. Aislar la unidad de filtracin de la fuente de presin y de la tubera corriente bajo.
5. La difusin del gas a travs de la membrana mojada se mide cuantitativamente como un
descenso de la presin despus de un periodo de tiempo especificado.
6. Medir el volumen corriente abajo de la carcasa.
7. Mantener constante la temperatura en el volumen corriente abajo de la carcasa.
8. Verificar que no haya fugas en el sistema de tuberas corriente abajo.
9. Comparar los resultados con los valores publicados de la disminucin de la presin, los
cuales se basan en carcasas estndares con vlvulas corriente arriba localizadas tan cerca
como sea posible de la carcasa del filtro.
10. Si los resultados estn dentro de los lmites especificados, entonces el filtro est listo
para usarse.

4. RESULTADOS
1. Elaborar el isomtrico de tuberas que muestre la instalacin del filtro.
2. Dibujar un diagrama de bloques de los procedimientos experimentales realizados en esta
prctica.
3. Realizar una grfica de la presin en funcin del tiempo.

5. DISCUSIN Y CONCLUSIONES

32
Manual del Laboratorio de Ingeniera de Reactores y Biorreactores

La discusin deber contener al menos lo siguiente:


1. Las especificaciones de los lquidos que se requieren para mojar la membrana de filtros
hidrofbicos en las pruebas de integridad de flujo difusivo.
2. La razn de que las pruebas de integridad de filtros deban ser correlacionados con la
prueba de la carga bacteriana lquida, la cual es un indicador del desempeo de los filtros.
3. Tres pruebas que se han utilizado comnmente en filtros para la esterilizacin de gas, as
como sus ventajas y desventajas.

6. BIBLIOGRAFA
1. Davila-Vazquez G., Len-Rodrguez A., Alatriste-Mondragn F., Elas Razo-Flores E.
2011. The buffer composition impacts the hydrogen production and the microbial
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33
Manual del Laboratorio de Ingeniera de Reactores y Biorreactores

PRCTICA 5

Prctica 5. Implementacin tecnolgica de sistemas fermentativos: cultivos


en lote, cultivos en lote alimentado y cultivos continuos.

Implementacin tecnolgica de sistemas


fermentativos:
cultivos en lote,
cultivos en lote alimentado
y cultivos continuos

1. INTRODUCCIN

El tratamiento biolgico de aguas residuales generalmente se lleva a cabo en biorreactores.


La forma en la que el agua residual es introducida y retirada de un biorreactor, despus de
que ha ocurrido el tratamiento biolgico, es la base para clasificar a un proceso en lote, lote
alimentado o continuo.

Un proceso en lote se caracteriza porque una vez que a un biorreactor se introduce agua
residual y un inoculo, no hay entrada ni salida de esos materiales hasta que el proceso de
transformacin biolgica termina. Un proceso es continuo cuando los flujos de entrada y
salida son iguales, mantenindose constante el volumen de operacin en el biorreactor. Un
proceso en lote alimentado es cuando hay alimentacin al biorreactor sin que haya una
corriente de salida, por lo que el volumen de lquido aumenta hasta que el proceso termina.

Una planta de tratamiento de aguas residuales regularmente inicia su operacin en cultivo en


lote, para alcanzar una concentracin de microorganismos de entre 2000 y 3000 mg/L y para

34
Manual del Laboratorio de Ingeniera de Reactores y Biorreactores

iniciar la aclimatacin de los microorganismos al tipo de agua residual que tratarn; despus
el proceso permanece en operacin continua. Los procesos por lote alimentado nicamente
se usan en casos excepcionales; por ejemplo, cuando los contaminantes en alta concentracin
inhiben el metabolismo de los microorganismos.

Decidir la forma de operacin de un proceso para alcanzar un tratamiento efectivo de


contaminantes, requiere del entendimiento de los principios bsicos que gobiernan el
crecimiento de los microorganismos, en particular, el de las bacterias, que son los
microorganismos de primera importancia en el tratamiento biolgico. Ellas generalmente se
reproducen por fisin binaria y el tiempo requerido para cada fisin, tambin conocido como
tiempo de generacin, llega a ser de alrededor de 20 min.

El patrn de crecimiento de bacterias en cultivo en lote se muestra en la figura 1. Inicialmente,


un nmero relativamente pequeo de microorganismos es inoculado dentro de un volumen
fijo de medio de cultivo (agua residual) y el nmero de microorganismos viables se registra
en funcin del tiempo. El patrn de crecimiento basado en el nmero de clulas tiene las
siguientes fases: lag, log de crecimiento, estacionaria y log de muerte. Estas fases no
corresponden sobre la escala de tiempo con las fases del patrn de crecimiento en trminos
de la masa bacteriana, las cuales son: lag, log de crecimiento, declinacin de crecimiento y
fase endgena.

Fase
No. de estacionaria
micro-
organismos
Fase log
Fase log de muerte
de crecimiento

Fase lag

tiempo

Figura 1. Curva de crecimiento de microorganismos.

35
Manual del Laboratorio de Ingeniera de Reactores y Biorreactores

Es importante notar que en la mayora de los procesos de tratamiento biolgico intervienen


poblaciones biolgicas mixtas interrelacionadas entre s. Cada tipo de microorganismo tiene
su propia curva de crecimiento. La posicin y la forma de una curva de crecimiento particular
sobre la escala de tiempo, depende de los nutrientes disponibles y de factores ambientales,
como la temperatura, el pH y las condiciones aerbicas o anaerbicas. Si bien las bacterias
son de primera importancia, tambin muchos otros microorganismos, como hongos, algas y
protozoarios, toman parte en la transformacin de los residuos orgnicos.

Desde el punto de vista didctico y para realizar un trabajo en condiciones de seguridad


anulando riesgos microbiolgicos, en esta prctica se realizarn procesos en lote, lote
alimentado y en continuo, para determinar parmetros cinticos y coeficientes de una cepa
que es inocua para la salud humana. La determinacin de parmetros cinticos y coeficientes
tiene la finalidad de conocer, predecir y controlar el proceso de transformacin biolgica de
contaminantes.

En esta prctica la cepa mencionada en el prrafo anterior, se usa como si fueran lodos
activados y el agua residual es un medio de cultivo formulado para conseguir los objetivos
de esta prctica.

2. OBJETIVOS

2.1 Cultivo por lote


El alumno determinar los parmetros cinticos en las diferentes fases de la curva de
crecimiento de microorganismos.

El alumno determinar las constantes cinticas y coeficientes de rendimiento de los lodos


activados en un proceso de tratamiento con lodos activados.

2.2 Cultivo por lote alimentado

El alumno conocer y realizar un cultivo por lote con alimentacin constante y comparar
la tasa volumtrica de degradacin de materia orgnica y rendimiento con los de una
operacin por lote.

2.3 Cultivo continuo

El alumno determinar la importancia de conocer la velocidad especfica de crecimiento de


los microorganismos para establecer las condiciones de alimentacin de un proceso continuo.

36
Manual del Laboratorio de Ingeniera de Reactores y Biorreactores

3. EQUIPO, MATERIALES Y MTODOS

3.1 Equipo

1. Autoclave (15 L de capacidad).


2. Balanza analtica (0 a 200 g de capacidad.).
3. Biorreactores de tanque agitado (0.5 y 2 L )
4. Bombas peristlticas (0 a 1 L/h).
5. Centrfuga clnica (0 a 5000 rpm).
6. Espectrofotmetro (longitud de onda visible y UV).
7. Estufa.
8. Incubadora rotatoria de temperatura controlada.
9. Placas de calentamiento y agitacin.

3.2 Materiales

Todos los reactivos debern ser de grado analtico.


(NH4)2SO4
NaH2PO4
Extracto de levadura
FeSO4 7H2O
CuSO4 5H2O
ZnSO4 H2O
Na2MoO4 2H2O
MnSO4 H2O

3.3 Microorganismos

En esta prctica se considerarn como slidos suspendidos voltiles de licor mezclado


(SSVLM) a microorganismos que son inocuos para la salud humana. La cepa de
microorganismos est en un tubo con agar inclinado que proporcionar el profesor del
laboratorio.

3.4 Agua residual

La tabla 1 muestra la composicin de las soluciones que se utilizarn como agua residual
en los diferentes tipos de cultivos.

37
Manual del Laboratorio de Ingeniera de Reactores y Biorreactores

Tabla 1. Composicin del agua residual


COMPONENTE INOCULO OPERACIN OPERACIN OPERACIN
(g/L) POR LOTE POR LOTE CONTINUA
(g/L) ALIMENTADO (g/L)
(g/L)
Glucosa 15.0 15.0 40.0 20.0
(NH4)2SO4 2.73 1.365 3.64 1.82
NaH2PO4 1.2637 1.2637 3.37 1.685
Extracto de levadura 0.990 0.990 2.64 1.32
* FeSO4 7H2O
* CuSO4 5H2O
* ZnSO4 H2O
* Na2MoO4 2H2O
* MnSO4 H2O
Emplear agua destilada
(*) Todas las sales ya estn disueltas en una solucin concentrada, el volumen (en mL) a
emplear se calcula mediante la siguiente relacin:
Vsales (mL) = 0.05 x conc. de glucosa (g/L) x volumen medio (L)
Todos los medios se ajustan a un pH=4.0 (excepto el medio para el inoculo).

3.5 Mtodos

Determinacin de la concentracin celular, equivalente a SSVLM


Para determinar la concentracin celular, que en esta prctica es igual a la concentracin de
slidos suspendidos voltiles de licor mezclado (SSVLM), se emplear una curva tipo de As
= f (concentracin celular).

Procedimiento: La curva tipo se obtuvo de la siguiente forma: A las membranas puestas


previamente a peso constante y colocadas sobre el dispositivo de filtracin se les adiciona 5
mL de suspensin celular y se filtra al vaco. Se separa el filtrado y el paquete celular se lava
con 5 mL de agua destilada y se filtra nuevamente (este segundo filtrado no debe mezclarse
con el primero). El paquete celular lavado se coloca en una estufa a 60oC durante 24 horas
para obtener peso constante. La concentracin celular se estima por diferencia de pesos entre
la membrana sola y la membrana con paquete celular. Todas las pesadas deben hacerse en
balanza analtica. Con los datos de absorbancia y concentracin celular de cada una de las
suspensiones celulares, se obtuvo la curva tipo de As = f (concentracin celular).

Entonces, para conocer la concentracin celular durante el cultivo, tome una muestra y
mdale la absorbancia, la cual interpolar en la curva tipo para obtener la concentracin
celular. Si la absorbancia de la muestra es mayor que la ms alta de la curva tipo, entonces
deber hacer diluciones de su muestra para que el valor de absorbancia est dentro del
intervalo de la curva tipo.

38
Manual del Laboratorio de Ingeniera de Reactores y Biorreactores

Determinacin de azcares reductores por DNS, equivalente a DQO


En esta prctica se usa glucosa como fuente de carbono y su determinacin es con el mtodo
del DNS. La concentracin de glucosa que determinen debe de usarse para calcular su
equivalente como concentracin de demanda qumica de oxgeno (DQO), la cual deben usar
para hacer las graficas y clculos correspondientes.
Reactivos: Un gramo de cido 3,5- dinitrosaliclico se disuelve en 20 mL de NaOH 2N, se
agregan despus 50 mL de agua, y luego 30 g de tartrato de sodio y potasio. Todo se lleva a
un volumen de 100 mililitros.
Procedimiento: En un tubo Eppendorf colocar 0.1 mL de lquido clarificado y adicionar 0.1
mL del reactivo DNS; mezclar bien. Colocar el tubo en bao mara a ebullicin durante cinco
minutos, evitando que se abran. Posteriormente adicionar 1 mL de agua destilada, enfriar y
agitar en vortex. Leer a 540 nm. Se emplean dos controles de concentraciones de 0.4 y 0.8
g/L de glucosa y con el blanco de reactivos se ajusta a cero el espectrofotmetro.

Curva tipo de glucosa: Elaborar una curva tipo de glucosa con volmenes de 0.1 a 1 mL de
solucin patrn de 1.0 g/L de glucosa. El volumen de la solucin de glucosa se completa a 1
mL con agua destilada y se trata como si fuera una muestra.

4. DESARROLLO EXPERIMENTAL

En esta prctica se realizarn los siguientes procesos: a).- Un lote y al trmino de l inicia un
lote alimentado. B).- Un lote y al trmino de l inicia un continuo. El lote durar
aproximadamente 12 h, el lote alimentado 5 h y el continuo 36 h. Los cultivos se llevarn a
cabo en un biorreactor agitado mecnicamente. La figura 2 muestra el procedimiento para la
realizacin de los cultivos en operacin por lote y continua, mientras que la figura 3 muestra
el procedimiento para la realizacin de los cultivos en operacin por lote y lote alimentado.

39
Manual del Laboratorio de Ingeniera de Reactores y Biorreactores

4.1 Actividades previas al 4.3 Preparacin de 300 mL de agua residual, llenado del
proceso en lote biorreactor y esterilizacin

4.7 Procesamiento de
4.2 Preparacin de 4.4 Inoculacin del muestras
inculo biorreactor

4.9 Preparacin y 4.6 Toma de


4.5 Proceso en lote
esterilizacin de 2.5 muestras
L de agua residual

4.13 Limpieza de
4.10 Proceso continuo biorreactores

4.8 Actividades
previas al proceso 4.12 Procesamiento de
continuo 4.11 Toma de muestras muestras

Figura 2. Procedimiento experimental para cultivo por lote y cultivo continuo.

4.14 Actividades previas al 4.16 Preparacin de 900 mL de agua residual, llenado


proceso en lote del biorreactor y esterilizacin

4.15 Preparacin de inculo 4.17 Inoculacin del biorreactor


4.20
Procesamiento
4.22 Preparacin y 4.18 Proceso en lote 4.19 Toma de de muestras
esterilizacin de 0,7 muestras
L de agua residual

4.23 Proceso lote 4.26 Limpieza


alimentado de biorreactores

4.21 Actividades
previas al proceso
lote alimentado 4.25 Procesamiento de
4.24 Toma de muestras muestras

Figura 3. Procedimiento experimental para cultivo en operacin por lote y lote alimentado.

40
Manual del Laboratorio de Ingeniera de Reactores y Biorreactores

CULTIVO EN OPERACIONES POR LOTE Y EN CONTINUO

4.1 Actividades previas al proceso por lote

a) Preparar los reactivos y el material para la determinacin de azcares reductores.


b) Hacer curva tipo de glucosa.
c) Preparar el medio de cultivo para el inoculo / esterilizar / enfriar / inocular matraces
con la cepa en tubo inclinado / incubar durante 18 horas.
d) Preparar el medio de cultivo para la operacin por lote / preparar el biorreactor /
esterilizar el biorreactor con medio de cultivo y esterilizar el lcali y el antiespumante
/ enfriar / inocular con los matraces al biorreactor / arranque de la operacin por lote.

4.2 Preparacin del inculo


Preparar 60 mL de agua residual para desarrollo del inculo, los cuales se reparten en dos
matraces (de 125 mL) con 30 mL de agua residual cada uno. Esterilizar a 15 lb/in2 durante
15 min. Enfriar. Inocular con 5 mL de la suspensin celular formada al disgregar con 5 mL
de agua residual estril la masa celular crecida en tubo inclinado. Todo en condiciones
aspticas. Incubar a una temperatura de 350C durante 10 horas en una agitadora (100 rpm).

4.3 Preparacin de agua residual para el proceso en lote, llenado del biorreactor y
esterilizacin
Preparar 300 mL de agua residual para el proceso por lote y ajustar el pH a 6.5. El agua
residual se carga en el reactor, previamente preparado, y se esteriliza en el autoclave a 15
lb/in2, 15 min.

4.4 inoculacin
Una vez alcanzadas las condiciones de operacin dadas en el punto 4.5, el biorreactor se
inocula en condiciones aspticas con los dos matraces del inculo.

4.5 Proceso en lote


El proceso por lote operar bajo las siguientes condiciones: velocidad de agitacin (250 rpm),
aireacin (0.5 vvm), temperatura (ambiente) y pH (6.5). El proceso por lote durar
aproximadamente 12 horas.

4.6 Toma de muestras del proceso por lote


Las muestras se toman cada hora para la determinacin de la concentracin celular por
absorbancia y azcares residuales por el mtodo DNS. Las determinaciones se harn por
duplicado.

4.7 Procesamiento de muestras


El procesamiento de las muestras se realizar como lo muestra la figura 4 y se aplicarn los
mtodos analticos descritos en la Seccin 3, de Equipo, Materiales y Mtodos. Con los
resultados obtenidos, llenar la tabla 2

41
Manual del Laboratorio de Ingeniera de Reactores y Biorreactores

Muestra (3 mL) Leer As (620 nm) Centrifugar Paquete celular

Sobrenadante A tratamiento

Determinacin de glucosa residual por mtodo DNS

Figura 4. Procesamiento de las muestras.

Tabla 2. Resultados del cultivo por lote.


Da Hora Tiempo Concentracin celular Glucosa residual
del (por absorbancia)
cultivo Tubo As Dilucin Conc. Tubo As Dilucin Conc.
(h) (g/L) (g/L)

Curva tipo de biomasa Reunir todas las muestras y


pendiente (m) = aplicar el mtodo DNS
ordenada (b) =

4.8 Actividades previas al proceso continuo

a) Preparar los reactivos para la determinacin de glucosa por el mtodo DNS.


b) Calibrar la bomba peristltica que adicionar el agua residual para el proceso continuo,
a un flujo de 40 mL/h.
c) Conectar la manguera del recipiente que contiene el agua residual estril para el
proceso continuo a la bomba y al puerto de inoculacin del biorreactor.

4.9 Preparacin y esterilizacin de 2.5 L de agua residual para el proceso continuo


Preparar 2.5 litros de agua residual para el proceso continuo. Con el agua residual
preparada, llenar recipientes que tengan mangueras y conexiones para la alimentacin del

42
Manual del Laboratorio de Ingeniera de Reactores y Biorreactores

proceso continuo, ajustar el pH a 6.5. Esterilizar a 15 lb/in2 durante 15 min. Conectar la


manguera de alimentacin al biorreactor.

4.10 Proceso continuo


Calcule la velocidad de dilucin a emplear en el cultivo continuo, empleando la velocidad
especfica de crecimiento al final del lote.

Una vez que termine el proceso por lote, iniciar el proceso continuo alimentando agua
residual para el proceso continuo, usando la bomba peristltica a un flujo tal que se consiga
la velocidad de dilucin mencionada en el prrafo anterior. En caso que no tenga dicha
velocidad de dilucin, use un flujo de 40 mL/h.

4.11 Toma de muestras durante el proceso continuo


Cada 2 h medir absorbancia para calcular concentracin de SSVLM. Una vez que la
concentracin de SSVLM permanezca constante, se puede cambiar la velocidad de dilucin.

4.12 Procesamiento de muestras


El procesamiento de las muestras se realizar como lo muestra la figura 4 y se aplicarn los
mtodos analticos descritos en la seccin 3, de Equipo, Materiales y Mtodos.

4.13 Limpieza de biorreactores


Al trmino de la prctica pasar el contenido del biorreactor a un recipiente especial para su
posterior tratamiento y realizar el lavado del biorreactor.

CULTIVO EN OPERACIONES POR LOTE Y POR LOTE ALIMENTADO

4.14 Actividades previas al proceso por lote en biorreactor agitado de 1.5 L


a) Preparar los reactivos y el material para la determinacin de azcares reductores.
b) Hacer curva tipo de glucosa.
c) Preparar el medio de cultivo para el inoculo / esterilizar / enfriar / inocular matraces
con la cepa en tubo inclinado / incubar durante 18 horas.
d) Preparar el medio de cultivo para la operacin por lote / preparar el biorreactor /
esterilizar el biorreactor con medio de cultivo y esterilizar el lcali y el antiespumante
/ enfriar / inocular con los matraces al biorreactor / arranque de la operacin por lote.

4.15 Preparacin del inculo


Preparar 100 mL de agua residual para desarrollo del inculo, los cuales se reparten en dos
matraces (de 125 mL) con 50 mL de agua residual cada uno. Esterilizar a 15 lb/in2 durante
15 min. Enfriar. Inocular con 5 mL de la suspensin celular formada al disgregar con 5 mL
de agua residual estril la masa celular crecida en tubo inclinado. Todo en condiciones
aspticas. Incubar a una temperatura de 350C durante 10 horas en una agitadora (100 rpm).

43
Manual del Laboratorio de Ingeniera de Reactores y Biorreactores

4.16 Preparacin de agua residual para el proceso en lote, llenado del biorreactor y
esterilizacin
Preparar 900 mL de agua residual para el proceso por lote y ajustar el pH a 6.5. El agua
residual se carga en el reactor, previamente preparado, y se esteriliza en el autoclave a 15
lb/in2, 15 min.

4.17 inoculacin
Una vez alcanzadas las condiciones de operacin dadas en el punto 4.18, el biorreactor se
inocula en condiciones aspticas con los dos matraces del inculo.

4.18 Proceso en lote


El proceso por lote operar bajo las siguientes condiciones: velocidad de agitacin (250 rpm),
aireacin (0.5 vvm), temperatura (ambiente) y pH (6.5). El proceso por lote durar
aproximadamente 12 horas.

4.19 Toma de muestras del proceso por lote


Las muestras se toman al inicio y al final del proceso, para determinar la concentracin
celular por absorbancia y azcares residuales por el mtodo DNS. Las determinaciones se
harn por duplicado.

4.20 Procesamiento de muestras


El procesamiento de las muestras se realizar como lo muestra la figura 4 y se aplicarn los
mtodos analticos descritos en la Seccin 3, de Equipo, Materiales y Mtodos.

4.21 Actividades previas al lote alimentado


a) Preparar los reactivos para la determinacin de glucosa por el mtodo DNS.
b) Calibrar la bomba peristltica que adicionar el agua residual para el proceso
continuo, a un flujo de 40 mL/h.
c) Conectar la manguera del recipiente que contiene el agua residual estril para el
proceso continuo a la bomba y al puerto de inoculacin del biorreactor.

4.22 Preparacin y esterilizacin de 0.8 L de agua residual para el proceso por lote
alimentado
Preparar 0.8 litros de agua residual para el proceso continuo. Con el agua residual
preparada, llenar recipientes que tengan mangueras y conexiones para la alimentacin del
proceso continuo, ajustar el pH a 6.5. Esterilizar a 15 lb/in2 durante 15 min. Conectar la
manguera de alimentacin al biorreactor.

4.23 Proceso por lote alimentado


Una vez que termine el proceso por lote, iniciar el proceso por lote alimentado, alimentando
agua residual para el proceso continuo, usando la bomba peristltica a un flujo de 160
mL/h.

4.24 Toma de muestras durante el proceso por lote alimentado


Cada hora medir absorbancia para calcular concentracin de SSVLM.

44
Manual del Laboratorio de Ingeniera de Reactores y Biorreactores

4.25 Procesamiento de muestras


El procesamiento de las muestras se realizar como lo muestra la figura 4 y se aplicarn los
mtodos analticos descritos en la seccin 3, de Equipo, Materiales y Mtodos. Con los
resultados obtenidos llenar la tabla 3.

4.26 Limpieza de biorreactores


Al trmino de la prctica pasar el contenido del biorreactor a un recipiente especial para su
posterior tratamiento y realizar el lavado del biorreactor.

Tabla 3. Resultados del cultivo por lote alimentado constantemente


Hora Tiempo Volumen Concentracin celular Glucosa residual
(h) Lquido (por absorbancia)
(L) Tubo As Dilucin Conc. Tubo As Dilucin Conc.
(g/L) (g/L)

Curva tipo de biomasa Reunir todas las muestras y


pendiente (m) = aplicar el mtodo DNS,
ordenada (b) = empleando dos controles de 0.4
y 0.8 g/L de glucosa
0.4 g/L _________
0.8 g/L _________

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Manual del Laboratorio de Ingeniera de Reactores y Biorreactores

5. RESULTADOS Y DISCUSIN

5.1 Para el proceso en lote:


a) Los resultados de la tabla 2.
b) La curva tipo de absorbancia en funcin de concentracin celular.
c) Grficas de:
o Concentracin de SSVLM en funcin de tiempo (identificar las fases del
crecimiento).
o Concentracin de DQO en funcin de tiempo.
o Logaritmo natural de la concentracin de SSVLM en funcin de tiempo (solo para
la fase exponencial)
e) Determinar las siguientes constantes cinticas y coeficientes de rendimiento:
o Velocidad especfica mxima de crecimiento (max).
o Velocidad especfica de consumo de sustrato (qs) a cada tiempo del proceso.
o Rendimiento celular con base en el consumo de sustrato (Yxs) a cada tiempo del
proceso.
o Rendimiento celular global con base en el consumo de sustrato (Yxs(global)).
o Constante de afinidad por el sustrato (Ks).

f) Calcular la productividad celular global (g SSVLM / L h) y la tasa volumtrica de


degradacin de materia orgnica (g DQO / L h).

5.2 Para el proceso por lote alimentado

a) Determinar max, Yx/s (global) y productividad celular global (g SSVLM / L h) y la


tasa volumtrica de degradacin de materia orgnica (g DQO / L h), previo al lote
alimentado.
b) Para el cultivo alimentado elaborar las siguientes grficas:
o Concentracin de SSVLM contra tiempo.
o Volumen de medio de cultivo alimentado (V) contra tiempo.
o Biomasa total (SSVLM) contra tiempo; donde SSVLM = SSVLM *V.
o DQO residual contra tiempo.
o Velocidad especfica de crecimiento () contra tiempo.

c) Estimar los valores de productividad celular global (g SSVLM/L h) y la tasa


volumtrica de degradacin de materia orgnica (g DQO/L h); adems, el rendimiento
celular global con base al consumo de sustrato (Yx/s global) en el cultivo por lote
alimentado constantemente.

5.3 Para el proceso en continuo

a) Grfica de concentracin de SSVLM y de glucosa en funcin del tiempo

b) Determinar Yx/s (global), productividad celular global (g SSVLM/L h) y la tasa


volumtrica de degradacin de materia orgnica (g DQO/L h).

46
Manual del Laboratorio de Ingeniera de Reactores y Biorreactores

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4. Changa H.M., Junga K., Choi J., Chul L.J., Hee-Chul W. 2014. Multi-stage continuous
high cell density culture systems: A review. Biotechnology Advances 32: 514525.

5. Gummadi S.N., Kumar D.S. 2008. Batch and fed batch production of pectin lyase and
pectate lyase by novel strain Debaryomyces nepalensis in bioreactor. Bioresource
Technology. 99: 874881.

6. Ibarra-Junquera V., Jrgensen S.B., Virgen-Ortz J.J., Escalante-Minakatac P., Osuna-


Castro J.A. 2012. Following an optimal batch bioreactor operations model. Chemical
Engineering and Processing. 62: 114128.

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Manual del Laboratorio de Ingeniera de Reactores y Biorreactores

PRCTICA 6

Prctica 6. Limpieza y esterilizacin de recipientes, tuberas, aire y medios


de cultivo.

Limpieza y esterilizacin de recipientes,


tuberas, aire
y medios de cultivo

1. INTRODUCCIN

En el rea ambiental, las prcticas de limpieza y esterilizacin se llevan a cabo en estudios


de investigacin a nivel de laboratorio, para obtener informacin sobre procesos de
biodegradacin de contaminantes bajo condiciones controladas en biorreactores. En
situaciones como estas, para obtener informacin fidedigna atribuible a un microorganismo,
cultivo mixto o consorcio microbiano, es necesario limpiar y esterilizar el biorreactor,
tuberas, aire y medios de cultivo que se emplean para dicha investigacin.

La limpieza es un trmino que significa eliminar suciedad de algo. En el tratamiento de


materiales contaminados utilizando microorganismos, la suciedad generalmente son residuos
del proceso de bioconversin, tales como residuos de microorganismos y del medio de
cultivo o material contaminado utilizados. Existen diversas sustancias limpiadoras y
procedimientos de aplicacin de ellas, que se pueden usar dependiendo de la naturaleza
qumica de la suciedad a remover. La limpieza de los materiales es un requisito indispensable
para la esterilizacin de los mismos. La esterilizacin es el procedimiento de destruir o

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Manual del Laboratorio de Ingeniera de Reactores y Biorreactores

separar a los microorganismos contaminantes indeseables de un medio slido, lquido o


gaseoso.

La destruccin de microorganismos se puede llevar a cabo por varios mtodos, como son:
trmicos, mediante calor seco o hmedo; fsicos, mediante radiaciones o vibraciones snicas;
y qumicos.

El mtodo ms comnmente utilizado para medios lquidos es el de calor hmedo, ya que es


simple y econmico. La separacin de microorganismos se lleva a cabo principalmente por
filtracin, la cual de emplea para esterilizar aire y cantidades pequeas de lquidos que
contienen sustancias termolbiles.

1.1 Cintica de muerte trmica de microorganismos


Generalmente se clasifica la velocidad de muerte de los microorganismos en: velocidad de
muerte logartmica y velocidad de muerte no logartmica.

Velocidad de muerte logartmica


La velocidad de muerte logartmica se puede expresar matemticamente mediante la
ecuacin:

dN
- kN (1)
dt

Separando variables e integrando.


N
ln kt (2)
No

N
exp( kt ) (3)
No

La ecuacin (3) describe apropiadamente la cintica de muerte trmica de clulas vegetativas.

1.2 Efecto de la temperatura sobre la cintica de muerte


Considerando la muerte trmica de los microorganismos de manera similar a las reacciones
qumicas, la relacin entre las constantes cinticas y la temperatura presenta un
comportamiento anlogo. La teora ms frecuentemente empleada es la teora de Arrhenius.
Esta relacin se expresa matemticamente como
:

E
k A exp (8)
RT

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Manual del Laboratorio de Ingeniera de Reactores y Biorreactores

1.3 Esterilizacin por lote


En el proceso de esterilizacin por lote, el medio se coloca en el fermentador y el contenido
se calienta a la temperatura de esterilizacin asignada. Para establecer la relacin entre
tiempo y temperatura se puede utilizar la ecuacin (1). Sin embargo, k durante la
esterilizacin por lote no es constante ya que la temperatura durante el calentamiento y
enfriamiento varan. Incorporando el efecto de la temperatura establecido por la ecuacin de
Arrhenius la ecuacin queda:

E
t
No
TOTAL ln A exp dt (9)
N 0
RT

El smbolo representa el grado de destruccin en todo el proceso.


El ciclo de esterilizacin est formado por tres perodos:
1. Elevacin de temperatura o calentamiento.
2. Mantenimiento de temperatura
3. Descenso de temperatura o enfriamiento.

El perfil temperatura - tiempo durante la fase de calentamiento es funcin de varios factores,


por ejemplo: la forma en que se lleva a cabo el calentamiento, ya sea inyeccin directa de
vapor, calentamiento indirecto a la chaqueta, mediante serpentines o elctricamente. La tabla
1 muestra las relaciones tiempo temperatura de acuerdo a la forma de transferencia de calor.

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Manual del Laboratorio de Ingeniera de Reactores y Biorreactores

Tabla 1. Relaciones Tiempo Temperatura de acuerdo a la forma de transferencia de calor


TIPO DE RELACION
TRANSFERENCIA DE TEMPERATURA- ayb
CALOR TIEMPO
Adicin de vapor al medio at
a
hs
T To 1
1 bt MToC

(Hiperblica ) s
b
M

Calentamiento con T To1 at q


dispositivo elctrico a
MToC
( lineal )


Calentamiento con vapor T T 1 be at
(intercambiador de calor)
H a
Ua
MC
( exponencial )
To TH
b
TH
Enfriamiento
T T 1 be at a
WC
1 e
Ua

WC
MC
(Intercambiador de calor)

To T
b
T

2. OBJETIVO

El alumno disear el ciclo de esterilizacin para un medio de cultivo en un biorreactor.

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Manual del Laboratorio de Ingeniera de Reactores y Biorreactores

3. DESARROLLO EXPERIMENTAL

3.1 Equipo, Material y Mtodos


1. Fermentador de 14 litros o de 75 L.
2. Cronmetro
3. Cajas de Petri estriles.
4. Pipetas estriles.
5. Frascos de dilucin con agua estril.
6. Agar nutritivo
7. Mechero.
8. Esporas de Bacillus stearothermophilus.

3.2 Trabajo experimental


1. Una vez montado el vaso conteniendo 12 L o 55 L de agua, inocular con esporas de
Bacillus stearothermophilus.
2. Establecer la temperatura de esterilizacin.
3. Anotar los datos de tiempo y temperatura durante todo el ciclo de esterilizacin, en
intervalos de un minuto.
4. Tomar cuatro muestras a diferentes tiempos: al principio del ciclo de esterilizacin
(No), al final del perodo de calentamiento (N1), al final del perodo de mantenimiento
(N2), y al final del perodo de enfriamiento (N3).
5. De cada una de las muestras tomadas, se hacen diluciones seriadas y se siembran por
duplicado en cajas de Petri, utilizando la tcnica de vaciado en placa, de acuerdo a
como se indica en la tabla 2. Posteriormente se incuban a 30 C. Hacer conteo de
colonias cada 24 h, durante dos das.

Tabla 2. Diluciones a realizar de cada muestra y las que se siembran en placa


Muestra Diluciones a Diluciones a sembrar
realizar
NO 10-1 a 10-9 10-6, 10-7, 10-9
N1 10-1 a 10-8 10-5, 10-6, 10-7
N2 10-1 a 10-8 10-4, 10-5, 10-6
-1 -8
N3 10 a 10 10-3, 10-4, 10-5

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Manual del Laboratorio de Ingeniera de Reactores y Biorreactores

4. RESULTADOS Y DISCUSIN

1. Presentar en un cuadro los valores de temperatura y tiempo para el ciclo de


esterilizacin. Graficar los perfiles para las etapas de calentamiento, mantenimiento y
enfriamiento.
2. Determinar los valores de (a) y (b) de las ecuaciones de temperatura en funcin del
tiempo para las etapas de calentamiento y enfriamiento.
3. Calcular el coeficiente global de transferencia de calor (UiD) para las etapas de
calentamiento y enfriamiento.
4. Con los valores de No, N1, N2 y N3 determinar el grado de destruccin para el
calentamiento, mantenimiento, enfriamiento y el ciclo de esterilizacin.
5. En el perodo de mantenimiento determinar el valor de la energa de activacin
conociendo el valor de la constante de Arrhenius: A = 7.49 X 1038 min-1 .
6. Elaborar un cuadro de valores de (k) en funcin del tiempo y trazar la grfica
correspondiente. Obtendr el grado de destruccin para calentamiento,
mantenimiento, enfriamiento y total por integracin grfica en la curva anterior y por
algn mtodo numrico.
7. En el caso de que la esterilizacin haya sido deficiente, recalcular el tiempo de
mantenimiento, suponiendo los criterios de diseo de calentamiento y enfriamiento
constantes y una poblacin final de microorganismos viables de 10-3 ( probabilidad
de que en mil lotes de esterilizacin, uno resulte contaminado).
8. Exponer sus conclusiones.

NOMENCLATURA.

a - rea de transferencia de calor: calcularla experimentalmente


A - Constante de Arrhenius, min-1.
C - Calor especfico del medio de cultivo, kcal/ kg C
C - Calor especfico del elemento enfriador, kcal / kg C
E - Energa de activacin, cal / g mol, kcal / kg mol
h - Entalpa relativa al medio. kcal / kg (entalpa del vapor a la temperatura del medio de
cultivo).
k - Constante especfica de velocidad de muerte, min. -1
kR - Constante especfica de inactivacin de esporas resistentes.
ks - Constante especfica de intermediarios sensibles.
M - Masa inicial del medio, kg.
N - Concentracin de microorganismos en el tiempo t
No - Concentracin de microorganismos to
N1 - Concentracin de microorganismos t1
N2 - Concentracin de microorganismos t2
N3 - Concentracin de microorganismos t3
ND -Concentracin de esporas inactivas.
NR -Concentracin de esporas resistentes.
NS - Concentracin de esporas sensibles

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q - Velocidad de transferencia de calor, kcal / s


R - Constante Universal de los gases, 1.98 cal / g Mol K
s - Gasto masa de vapor, kg / s, kg / h, kg / min.
t - Tiempo, min, h.
T - Temperatura absoluta K
T0 - Temperatura inicial del medio K
TH - Temperatura de la fuente de calentamiento K
T - Temperatura de la fuente de enfriamiento, 293 K
U - Coeficiente global de transferencia de calor, kcal / m2 h C
W - Gasto masa del elemento enfriador: calcularla experimentalmente, kg/h.

5. BIBLIOGRAFA

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