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Método oficial de la AOAC 2012.16 Ácido
pantoténico (vitamina B) en preparados para lactantes
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y fórmula nutricional para adultos/pediátricos
Cromatografía líquida de ultra rendimiento-
Método de espectrometría de masas en tándem
Primera Acción 2012
[Aplicable a la determinación de ácido pantoténico libre (AP) en preparados para
lactantes y preparados nutricionales para adultos/pediátricos.]
Precaución:Consulte las hojas de datos de seguridad del material antes de usar
productos químicos y adhiérase a las precauciones de seguridad
provistas. Use equipo de protección personal cuando sea necesario.
A. Principio
Extracción de PA utilizando una solución tampón de acetato de
amonio 0,4 M. Después de la filtración, la solución final se somete a
UPLC-MS/MS.
B. Aparato
(a)Saldos.—Con legibilidad de 0,1 mg, capacidad 210 g
(AG204; Mettler-Toledo, Greifensee, Suiza); con legibilidad de 0,1
g, capacidad de 4100 g (PM4800 DeltaRange; Mettler-Toledo o
equivalente).
(b)medidor de pH.—Modelo 691 (Metrohm, Herisau, Suiza), con
legibilidad de 0,01 unidades de pH, o equivalente.
(C)Homogeneizador.—Polytron PT3000 (unidad de accionamiento),
Aggregate PT-DA 3012 (Kinematics, Lucerne, Suiza, o equivalente).
(d)Placa agitadora con agitadores magnéticos.
(mi)filtros.-Filtros de jeringa, tamaño de poro de 0,22 µm, 33 mm de d.i.,
Millex-HV PVDF (Millipore, Bedford, MA). Filtros de disco de membrana, tamaño
de poro de 0,22 µm (Millipore o equivalente).
(F)Papel de filtro.—Grado 597½, o equivalente.
(gramo)Sistema UPLC-MS/MS.—Acquity UPLC acoplado con detector
de triple cuadrupolo equipado con fuente de ionización por
electropulverización (ESI) y columna T3 (1,7 µm, 100 × 2,1 mm de d.i.;
Waters Corp., Milford, MA, o equivalente).
C. Productos químicos y disolventes
(a)Estándares.—D-pantotenato de calcio.—Sigma (St. Louis,
MO), o equivalente.pantotenato de calcio-[13C ,15norte].—
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IsoSciences (King of Prussia, PA), o equivalente.
(b)Enzima.-α-Amilasa, Sigma A3176, de páncreas porcino,
aproximadamente 25 U/mg, o equivalente.
(C)Disolventes.—acetonitrilo.— Grado LC/MS (Honeywell
LC015-1; Muskegon, MI, o equivalente).Agua.—>18 MΩ.
(d)Acetato de amonio.—Calidad ACS, >98 % Fluka 9690
(Buchs, Suiza o equivalente).
(mi)Ácido acético.—Calidad ACS (Marcon Chemicals, Center Valley, PA;
3121-46, o equivalente).
(F)Ácido fórmico.—Calidad ACS (Sigma 695076, o equivalente). (
gramo)Ácido fórmico al 1% en agua.—Calidad ACS (Honeywell
LC452-1 o equivalente).
D. Preparación de Soluciones Estándar y Reactivos
(a)Solución madre de PA (250 µg/mL).—Pesar 54,5 mg de pantotenato
de calcio en un matraz aforado de 200 mL (tener en cuenta el contenido
de humedad indicado en el certificado del proveedor) y diluir a volumen
con agua. Almacenar alícuotas a –20°C.
(b)Solución intermedia PA (10 µg/mL).—Transferir 1 mL de la solución
madre de PA a un matraz volumétrico de 25 mL y diluir al volumen con
agua. Almacenar alícuotas a –20°C.
(C)pantotenato de calcio-[13C ,15N 6] solución
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madre de patrón
interno (IS) (20 µg/mL).—Pesar 5,0 mg de pantotenato de calcio-[13C ,
15N] en un matraz aforado de 250 mL y diluir a volumen con agua.
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Almacenar alícuotas a –20°C.
(d)Preparación de la curva estándar de cinco niveles.—Transferir los
volúmenes apropiados de la solución intermedia de PA (10 µg/mL) a matraces
volumétricos de 10 mL para obtener cinco concentraciones diferentes de PA
(0.08, 0.16, 0.32, 0.64 y 1.2 µg/mL). Agregar 500 µL de solución madre de IS (20
µg/mL) y diluir al volumen. Almacene alícuotas de estas soluciones a –20 °C
durante no más de 1 mes antes de su uso.
(mi)Acetato de amonio, 400 mmol/L, pH 3,8 (utilizado para la extracción de
muestras).—En un vaso de precipitados de 500 mL, agregar 30,8 ± 0,10 g de
acetato de amonio. Agregue aproximadamente 300 ml de agua y revuelva para
disolver con un agitador magnético. Ajustar a pH 3,8 ± 0,1, añadiendo
cuidadosamente ácido acético glacial (se necesitan unos 150 mL). Transferir a
un matraz aforado de 1000 mL y enrasar con agua. Esta solución es estable
durante 1 mes a 4°C.
E. Preparación y extracción de muestras
(a)Preparación de muestras de alimentos..—Pesar una porción de muestra de 25,0
g de muestras sólidas homogéneas (es decir, fórmula infantil en polvo o productos
nutricionales). Agregar 200 mL de agua a 40°C antes de mezclar hasta obtener una
suspensión homogénea. Se puede utilizar un homogeneizador cuando sea necesario.
Nota: Si el producto contiene almidón, agregar 50 mg de α-amilasa e
incubar por 15 min a 40°C para disminuir la viscosidad y facilitar la
manipulación. Mezcle bien las muestras líquidas para garantizar la
homogeneidad y continúe directamente con la extracción.
(b)Extracción.—Pese una alícuota de 15,0 g de suspensión de muestra
homogeneizada (correspondiente a una porción de muestra de 5,0 g) o 20,0 g de
muestra líquida en un matraz volumétrico de 50 mL. Agregar un volumen de 25 mL
de una solución de acetato de amonio 0,4 M, pH 3,8. Diluir el extracto de muestra al
volumen con agua. Agregue una barra de agitación y revuelva durante 10 min. Filtrar
una porción de 20 ml a través de papel doblado (grado 597½). Ejecute el análisis
cromatográfico.
F. Análisis
(a)Análisis cromatográfico.—Transferir una alícuota de 1 mL del
filtrado obtenido enPreparación y extracción de muestras(b) en un tubo
de polipropileno de 15 mL (p. ej., tubo Falcon) que contiene 500 µL de la
solución madre de IS. Diluir la solución a 10,0 ± 1,0 mL con tapón de agua
y mezclar. Filtrar a través de un filtro de jeringa de 0,22 μm. Inyecte en el
sistema UHPLC-MS/MS.
(b)Condiciones UPLC.—Volumen de inyección, 2 µL; temperatura
de la columna, 30°C; caudal, 0,45 ml/min; fase móvil A, ácido fórmico
al 0,1% (v/v) en agua; y fase móvil B, acetonitrilo.
La composición inicial de la fase móvil fue 92 % A y 8 % B. El programa
de gradiente fue una rampa de 0 a 2,2 min desde 92 a 80 % de fase A;
Rampa de 2,2 a 2,4 min del 80 al 50 % de la fase A; 50% A espera de 2,4 a
4,0 min; volver a la composición inicial de la fase móvil a los 4,1 min y
mantener hasta los 7,0 min. El flujo de HPLC se dirigió al detector de MS
solo entre 0 y 2 min para evitar en la medida de lo posible el
ensuciamiento de la fuente.
(C)Condiciones de EM/EM.—ESI positivo; tensión capilar, 2,2 kV; cono, 25 V;
extractor, 3,0 V; temperatura de la fuente, 140°C; temperatura de
desolvatación, 350°C; y flujo de gas de cono, 700 L/h.
MS se ejecutó en el modo de monitoreo de reacción única. Las
transiciones monitoreadas entre 0 y 2.1 min fueronm/z220.2→90.1 para
PA, ym/z224,2→94,1 para el IS marcado con isótopos. La energía de
colisión se fijó en 14 V. El tiempo de permanencia para cada transición
monitoreada fue de 0,1 s.
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 (d)Identificación.—La detección de MS en el modo de monitoreo de
reacción única incluyó la detección simultánea de iones moleculares
correspondientes a PA y IS marcados. Las transiciones de masa
seleccionadas fueronm/z220.2→90.1 ym/z224,2→94,1, respectivamente.
(mi)cuantificación.—Calcular para cada patrón la relación de área de
pico entre PA e IS. Establezca una curva de calibración de 5 puntos (que
oscile entre 0,16 y 0,24 ng en la columna) trazando la relación del área
del pico frente a la concentración de PA. Calcular la regresión lineal. Se
recomienda utilizar una curva de regresión ponderada (1/x). Calcula la
pendiente (S) y el intercepto (I). Calcular la concentración de PA, w, en
(mg/100 g) utilizando la siguiente ecuación:

w=
(A-yo)×V1×V3×100
S×metro×V2×1000

donde A = relación de área de pico PA/IS en la solución de prueba; I =

intersección de la curva de calibración; S = pendiente de la curva de 1
calibración; V = volumen del extracto de muestra, en mL
2
(= 50); V =
volumen del filtrado pipeteado, en mL
3
(= 1); V = volumen final de la
solución de prueba, en mL (= 10 ± 1); m = masa de la porción de ensayo,
en g; 100 = conversión a base de 100 g; y 1000 = conversión de µg a mg.

Referencias:J. AOAC Internacional.95, 143 (2012)

J. AOAC Internacional.96, 497(2013)

DOI: 10.5740/jaoacint.13-054

SMPR AOAC 2012.009

J. AOAC Internacional.96, 487 (2013)
DOI: 10.5740/jaoac.int.SMPR2011.009

© 2012 AOAC INTERNACIONAL