NTC5097 Determinacion Acidos Grasos y Trigliceridos PDF

NORMA TÉCNICA NTC
COLOMBIANA 5097
2006-06-28
GRASAS Y ACEITES ANIMALES Y VEGETALES.

DETERMINACIÓN DE LA COMPOSICIÓN DE LOS
ÁCIDOS GRASOS EN LA POSICIÓN 2 DE LAS
MOLÉCULAS DE TRIGLICÉRIDOS
E: ANIMAL AND VEGETABLE FATS AND OILS.DETERMINATION OF

THE COMPOSITION OF FATTY ACIDS IN THE 2 POSITION OF
THE TRIGLYCERIDE MOLECULES
CORRESPONDENCIA: este proyecto es una adopción modificada

(MOD) de la ISO 6800:1997, por adición
del numeral A.3 del Anexo informativo
DESCRIPTORES: grasas y aceites vegetales –

determinación de ácidos grasos; grasas
y aceites animales - determinación de
ácidos grasos
I.C.S.: 67.200.10
Editada por el Instituto Colombiano de Normas Técnicas y Certificación (ICONTEC)

Apartado 14237 Bogotá, D.C. - Tel. 6078888 - Fax 2221435
Prohibida su reproducción Primera actualización

Editada 2006-07-10
PRÓLOGO
El Instituto Colombiano de Normas Técnicas y Certificación, ICONTEC, es el organismo

nacional de normalización, según el Decreto 2269 de 1993.
ICONTEC es una entidad de carácter privado, sin ánimo de lucro, cuya Misión es fundamental
para brindar soporte y desarrollo al productor y protección al consumidor. Colabora con el
sector gubernamental y apoya al sector privado del país, para lograr ventajas competitivas en
los mercados interno y externo.
La representación de todos los sectores involucrados en el proceso de Normalización Técnica

está garantizada por los Comités Técnicos y el período de Consulta Pública, este último
caracterizado por la participación del público en general.
La NTC 5097 (Primera actualización) fue ratificada por el Consejo Directivo del 2006-06-28.
Esta norma está sujeta a ser actualizada permanentemente con el objeto de que responda en
todo momento a las necesidades y exigencias actuales.
A continuación se relacionan las empresas que colaboraron en el estudio de esta norma a

través de su participación en el Comité Técnico 49 Aceites y grasas vegetales y animales
comestibles.
ACEGRASAS S.A. FÁBRICA DE GRASAS Y PRODUCTOS

ACEITES Y GRASAS VEGETALES S.A. QUÍMICOS S.A. -GRASCO-
ALIANZA TEAM S.A. GRASAS S.A.
CARULLA VIVERO S.A. LLOREDA S.A.
CENIPALMA UNIVERSIDAD INCCA DE COLOMBIA
COMESTIBLES RICOS S.A. UNIVERSIDAD JORGE TADEO LOZANO
DUQUESA S.A.
Además de las anteriores, en Consulta Pública el Proyecto se puso a consideración de las

siguientes empresas:
ASINAL LTDA. INDUSTRIAS DEL MAÍZ S.A.

ASOCIACIÓN NACIONAL DE INDUSTRIALES - –INVIMA– INSTITUTO NACIONAL DE
ANDI VIGILANCIA DE MEDICAMENTOS Y
COLOMBINA S.A. ALIMENTOS
COMERCIALIZADORA INTERNACIONAL IVONNE BERNIER LABORATORIO LTDA.
SANTANDEREANA DE ACEITES S.A.- C.I. – LUCTA GRANCOLOMBIANA LTDA.
SACEITES S.A.– MANUELITA S.A. DIVISIÓN ACEITES Y
COMPAÑÍA NACIONAL DE CHOCOLATES S.A. GRASAS
COMPAÑÍA NACIONAL DE LEVADURAS MERCADEO DE ALIMENTOS DE COLOMBIA S.A.
CORP PRODUCTS INTERNATIONAL MINISTERIO DE AGRICULTURA Y
DISA S.A. DESARROLLO RURAL
FABRICA DE ACEITES Y MARGARINAS DEL MINISTERIO DE COMERCIO, INDUSTRIA Y
MAGDALENA TURISMO.
FEDEPALMA MINISTERIO PROTECCIÓN SOCIAL
FIRMENICH S.A. MULTIMARCAS MAPLE S.A.
GRASCO S.A. NESTLÉ DE COLOMBIA S.A.
INDUSTRIAS ALIMENTICIAS NOEL - ZENU S.A. NULAB LTDA.
PRODUCTOS RAMO UNILEVER BESTFOODS
SOCIEDAD INDUSTRIAL DE GRASAS Y UNIVERSIDAD DE ANTIOQUIA
VEGETALES UNIVERSIDAD DEL VALLE
SUPERINTENDENCIA DE INDUSTRIA Y UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA
COMERCIO UNIVERSIDAD PEDAGÓGICA NACIONAL
UNILEVER ANDINA COLOMBIA S.A. -
ICONTEC cuenta con un Centro de Información que pone a disposición de los interesados
normas internacionales, regionales y nacionales y otros documentos relacionados.
DIRECCIÓN DE NORMALIZACIÓN
NORMA TÉCNICA COLOMBIANA NTC 5097 (Primera actualización)
INTRODUCCIÓN
En el presente documento se incluye información importante para tomar precauciones

relacionadas con el manejo de los reactivos, las cuales constituyen un complemento a la
información del documento de referencia ISO 6800:1997.
ISO6800: 1997 NTC Explicación

En el documento de referencia Se agregaron las siguientes notas: La adición de este numeral
no se contempla Anexo A (Normativo) corresponde a la importancia de
conocer las precauciones de
A.3 NOTAS DE PRECAUCIÓN seguridad en el momento de realizar
El n-hexano y el éter de petróleo el presente método.
liviano son extremadamente
inflamables. Se debe utilizar un
dispositivo eficaz para extraer los
vapores y se debe evitar la
electricidad estática.
El éter etílico es altamente inflamable

y representa un riesgo alto de
incendio o explosión al exponerse al
calor o llama. Es un depresor del
sistema nervioso central mediante
inhalación y absorción por la piel.
Formará peróxidos explosivos al
exponerse a la luz. Los recipientes
vacíos se deben manipular con
extrema precaución, particularmente
aquellos de los que se ha evaporado
éter. Los límites explosivos en el aire
son 1,85-48 %. El TLV (valor límite
umbral) es de 400 ppm en el aire.
Siempre que se use éter etílico, se
debería utilizar una campana
extractora de vapores.
La acetona es altamente inflamable y

presenta riesgo de incendio. En altas
concentraciones es narcótico y
moderadamente tóxico por ingestión
e inhalación. Los límites explosivos
en el aire son 2,6-12,8 %. El TLV en
el aire es 750 ppm.
GRASAS Y ACEITES ANIMALES Y VEGETALES.

DETERMINACIÓN DE LA COMPOSICIÓN DE LOS ÁCIDOS GRASOS
EN LA POSICIÓN 2 DE LAS MOLÉCULAS DE TRIGLICÉRIDOS
1. OBJETO
Esta norma especifica el método para la determinación de la composición de los ácidos grasos
esterificados en la posición 2 (β o posición interna) de las moléculas de triglicéridos en las
grasas y aceites animales y vegetales.
Debido a la naturaleza de la acción de la lipasa pancreática, el método se aplica sólo a grasas

y aceites cuyo punto de fusión es inferior a 45 °C.
El método no se aplica exclusivamente a todas las grasas y aceites, particularmente aquellos

que contienen cantidades importantes de:
- ácidos grasos con 12 o menos átomos de carbono (Ej.: aceite de copra, aceite
de palmiste, grasas de mantequilla butírica);
- ácidos grasos con 20 o más átomos de carbono y alto nivel de insaturación (más
de cuatro enlaces dobles) (Ej.: aceite de pescado y aceite de animales marinos)
- ácidos grasos con grupos secundarios que contienen oxígeno.
NOTA Los ácidos grasos con enlaces dobles en la posición (n-16) a (n-11) (Ej.: ácido petroselínico) son
convertidos lentamente por la lipasa pancreática. Esto puede dar resultados equívocos.
2. REFERENCIAS NORMATIVAS
Los siguientes documentos referenciados son indispensables para la aplicación de esta norma.
Para referencias fechadas, se aplica únicamente la edición citada. Para referencias no
fechadas, se aplica la última edición del documento referenciado(incluida cualquier corrección).
NTC 218 (Segunda actualización), Grasas y aceites vegetales y animales. Determinación del
índice de acidez y de la acidez.
NTC 5033, Grasas y aceites animales y vegetales. Preparación de la muestra para ensayo.
NTC 5013, Grasas y aceites vegetales y animales. Análisis de los esteres metilitos de ácidos
grasos por cromatografía de gases (ISO 5509).
1
NTC 4967, Grasas y aceites animales y vegetales. Preparación de esteres metilicos de ácidos
grasos (ISO 5508).
NTC 5395:2005, Agua para uso en análisis de laboratorio. Especificación y métodos de

análisis.
ISO 5508, Animal and Vegetable Fats and Oils, Analysis by Gas Chromatography of Methyl
Esters of Fatty Acids.
3. PRINCIPIO
El método consiste en la neutralización de la grasa en un solvente adecuado, la purificación de

la muestra de ensayo a través de una columna cromatográfica con alúmina activada,
posteriormente la hidrólisis parcial de los triglicéridos mediante lipasa pancreática para obtener
2 monoglicéridos, separación de los monoglicéridos formados por cromatografía de capa
delgada (TLC), la metanólisis de estos monoglicéridos y el análisis de los ésteres metílicos
obtenidos mediante cromatografía de gases.
4. REACTIVOS
Se usan sólo reactivos de grado analítico reconocido y agua de acuerdo con el Grado 2 de la
norma ISO 36961).
4.1 REACTIVOS PARA PURIFICAR LA MUESTRA DE ENSAYO
4.1.1 2-Propanol o etanol al 95 % (V/V).
4.1.2 Hexano (si está disponible) o éter de petróleo (punto de ebullición de 30 °C a 60 °C).
4.1.3 2-Propanol, al 50 % (V/V) o etanol, al 50 % (V/V).
4.1.4 Solución de Hidróxido de sodio, al 0,5 mol/l
4.1.5 Solución de fenoftaleína, 1 g por 100 ml de etanol al 95 % (V/V).
4.1.6 Alúmina neutra activada, para cromatografía, Brockman actividad I, activada recientemente
durante 2 h a 260 °C y guardada en un desecador.
4.1.7 Nitrógeno.
4.2 REACTIVOS PARA LA HIDRÓLISIS DE LOS TRIGLICÉRIDOS
4.2.1 Éter etílico, libre de peróxidos
4.2.2 Solución de Ácido Clorhídrico, 6 mol/L
4.2.3 Colato de sodio, 1 g/L en solución, calidad enzimática.
1)
Véase la referencia normativa NTC 5395.
2
4.2.4 Solución de Cloruro de calcio, 220 g/L
4.2.5 Solución amortiguadora, 2-amino-2-hidroximetil 1,3 propano-diol2), 1 mol/L, ajustado a

pH 8 con la solución de ácido clorhídrico (véase el numeral 4.2.2) y por medio del uso del
medidor de pH.
Esta solución se guarda entre 0 °C y 4 °C y se usa en un plazo de 14 d.
4.2.6 Lipasa pancreática, con una actividad entre 8 y 20 unidades/mg.
Se guarda seca en un refrigerador. Antes de su uso llevar una porción a temperatura ambiente.
NOTA La lipasa con actividad adecuada se puede obtener en el mercado. Si se prefiere, se puede preparar y
ensayar la lipasa de acuerdo con los procedimientos indicados en el Anexo A.
4.3 REACTIVOS PARA AISLAR LOS 2-MONOGLICÉRIDOS
4.3.1 Etanol, 95 % (V/V)
4.3.2 Hexano (si está disponible) o éter de petróleo (punto de ebullición de 30 °C a 60 °C).
4.3.3 Acetona
4.3.4 Sílica en Polvo, con aglomerante, para cromatografía de capa delgada.
4.3.5 Solvente de elusión, preparado como sigue:
hexano (si está disponible) o éter de petróleo 70 ml
éter etílico 30 ml
ácido fórmico al 98 % (V/V) mínimo 1 ml
4.3.6 Solución indicadora 2’,7’-Diclorofluoresceina, 2 g/L en etanol, a la cual, para que sea
ligeramente alcalina se le agrega una gota de Hidróxido de sodio NaOH al 1 mol/L por cada
100 ml de solución.
4.4 REACTIVOS PARA ANÁLISIS DE 2-MONOGLICÉRIDOS POR CROMATOGRAFÍA

DE GASES
Véanse las normas ISO 5508 y NTC 5013 (ISO 5509).
5. EQUIPOS Y MATERIALES
Equipo usual de laboratorio y lo siguiente, en particular:
5.1 APARATO PARA PURIFICAR LA MUESTRA DE ENSAYO
5.1.1 Baño de agua, controlado por termostato, con capacidad para permanecer entre 30 ºC y
40 ºC.
2)
Los nombres alternos son: tris(hidroximetil)metialamina; tris(hidroximetil)aminometano
3
5.1.2 Columna de vidrio, para cromatografía, diámetro interno de 13 mm y longitud de 400 mm,
equipada con una placa de vidrio sinterizado con llave de politetrafluoretileno y tapón.
5.1.3 Roto evaporador, con balón de 250 ml
5.1.4 Tubos, para hacer burbujear el nitrógeno
5.1.5 Embudo de separación, con capacidad de 500 ml
5.1.6 Balón de fondo redondo, con capacidad de 100 ml
5.2 APARATOS PARA LA HIDROLISIS DE LOS TRIGLICÉRIDOS
5.2.1 Centrífuga
5.2.2 Tubo de vidrio para centrífuga, con capacidad de 10 ml y tapón.
5.2.3 Agitador eléctrico vibrante, para lograr una vigorosa agitación del tubo de centrífuga.
5.2.4 Baño de agua, controlado con termostato y capaz de mantener una temperatura de 40 °C
± 0,5 °C.
5.2.5 Jeringa hipodérmica, de 1 ml con aguja delgada
5.2.6 Reloj cronómetro
5.3 APARATOS PARA AISLAR LOS 2-MONOGLICÉRIDOS
5.3.1 Cámara de desarrollo, para cromatografía de capa delgada, con tapa de vidrio
esmerilado, adecuado para contener placas de vidrio de 200 mm x 200 mm.
5.3.2 Distribuidor y bandeja, para preparar las placas.
5.3.3 Placas de vidrio, o equivalentes de 200 mm x 200 mm.
5.3.4 Micro-jeringa, con capacidad para dispensar gotas de 3 µl a 4 µl.
5.3.5 Atomizador para rociar la solución indicadora sobre las placas.
5.3.6 Micro-espátula.
5.3.7 Horno, capaz de mantener una temperatura de 103 °C ± 3 °C.
5.3.8 Lámpara ultravioleta, para examinar las placas cromatográficas, por ejemplo: con una
longitud de onda de 254 nm.
5.3.9 Balón de fondo redondo, con capacidad de 25 ml con condensador de aire de

aproximadamente 1 m de largo, con unión esmerilada.
5.3.10 Erlenmeyer, de 250 ml con tapón esmerilado.
5.3.11 Erlenmeyer, de 50 ml (si fuera necesario).
5.3.12 Filtro, de vidrio sinterizado, porosidad P 40 (16 µm a 40 µm) (si fuera necesario).
4
5.3.13 Desecador, con un desecante eficaz.
5.4 APARATOS PARA ANALIZAR 2-MONOGLICÉRIDOS POR CROMATOGRAFÍA DE

GASES
Véanse las NTC 4967 (ISO 5508) y la NTC 5013 (ISO 5509).
6. MUESTREO
Es importante que el laboratorio reciba una muestra que sea realmente representativa y que no
se haya dañado ni cambiado durante el transporte y el almacenamiento.
El muestreo no es parte del método especificado en esta norma internacional. La NTC 217
contiene un método de muestreo recomendado.
7. PREPARACIÓN DE LA MUESTRA DE ENSAYO
Se prepara la muestra de acuerdo con la NTC 5033.
8. PROCEDIMIENTO
NOTA Si es necesario verificar si se cumple el requisito de repetibilidad (véase el numeral 10.2), se hacen dos
determinaciones individuales de acuerdo con los numerales 8.1 a 8.6.
8.1 DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD DE LA ACIDEZ
Se determina la acidez de la muestra del ensayo de acuerdo con la NTC 218.
Si la acidez es inferior a 3 % (m/m) se purifica la muestra con alúmina, de acuerdo con el

numeral 8.3.
Si la acidez es superior a 3 % (m/m), se neutraliza primero la muestra con hidróxido de sodio

en presencia de solvente, de acuerdo con el numeral 8.2 y luego se purifica con alúmina, de
acuerdo con el numeral 8.3.
8.2 NEUTRALIZACIÓN CON HIDRÓXIDO DE SODIO
Se disuelven 10 g +/- 0,5 g de la muestra de ensayo en 100 ml de hexano (si está disponible) o
éter de petróleo (véase el numeral 4.1.2) y se transfiere la solución al embudo de separación
(véase el numeral 5.1.5). Se agregan 50 ml de 2-propanol o etanol (véase el numeral 4.1.1),
unas pocas gotas de la solución de fenoftaleína (véase el numeral 4.1.5) y un volumen de
solución de hidróxido de sodio (véase el numeral 4.1.4) equivalente a la acidez libre de la grasa
o aceite, con un exceso de 0,5 %. Se agita vigorosamente durante 1 min, se agregan 50 ml de
agua destilada, se agita nuevamente y se deja reposar. Cuando estén separadas las fases, se
retira la capa inferior que contiene el jabón y cualquier capa intermedia (mucílagos y sustancias
insolubles). Se lava la solución de hexano o de éter de petróleo y el aceite neutralizado con
porciones de 25 ml ó 30 ml de una solución de 2-propanol o etanol (véase el numeral 4.1.3)
hasta que desaparezca el color rosado de la fenoftaleína.
Se traslada la solución al balón del roto evaporador (véase el numeral 5.1.3) y se retira la
mayor parte del solvente evaporando a presión reducida. Se seca el aceite entre 30 °C y 40 °C
5
con una corriente de nitrógeno (véase el numeral 4.1.7) hasta que el solvente haya sido
retirado completamente.
8.3 PURIFICACIÓN DE LAMUESTRA DE ENSAYO CON ALÚMINA
Se prepara una suspensión de 15 g de alúmina activada (véase el numeral 4.1.6) en 50 ml de

hexano (si está disponible) o éter de petróleo (véase el numeral 4.1.2) y se vierte, mientras se
agita, en una columna de vidrio para cromatografía (véase el numeral 5.1.2). Se verifica que la
alúmina se deposite uniformemente y se deja caer el nivel del solvente a 1 mm ó 2 mm sobre el
nivel superior del adsorbente. Se vierte con cuidado en la columna una solución preparada
disolviendo 5 g de la muestra (neutralizada si fuera necesario), en 25 ml de hexano (si está
disponible) o éter de petróleo (véase el numeral 4.1.2) y se recoge todo el líquido que eluye de
la columna en un balón de 100 ml, con fondo redondo (véase el numeral 5.1.6).
Se retira la mayor parte del solvente por evaporación a presión reducida, luego se seca el
aceite a 30 °C ó 40 °C con corriente de nitrógeno (véase el numeral 4.1.7) hasta que no quede
solvente.
8.4 HIDRÓLISIS DE LOS TRIGLICÉRIDOS
8.4.1 Se pesa aproximadamente 0,1 g de la muestra purificada (8.3) en un tubo de centrífuga de

10 ml (véase el numeral 5.2.2). Si está muestra de ensayo no está líquida a temperatura ambiente,
se coloca el tubo en el baño de agua a una temperatura entre 60 °C y 65 °C. Si para entonces la
muestra de ensayo no está totalmente líquida, se continúa la inmersión durante 10 s más.
Se retira el tubo del baño de agua y se continúa directamente y en sucesión rápida con los
pasos de los numerales 8.4.2 a 8.4.5 del procedimiento.
8.4.2 Se agrega a la muestra de ensayo líquida, la cantidad previamente pesada de 20 mg de

lipasa (véase el numeral 4.2.6) y se agregan 2 ml de la solución amortiguadora (véase el
numeral 4.2.5). Se agita cuidadosamente y se agregan sucesivamente 0,5 ml de solución de
colato de sodio (véase el numeral 4.2.3) y 0,2 ml de solución de cloruro de calcio (véase el
numeral 4.2.4).
Se inserta el tapón, se agita cuidadosamente y se coloca inmediatamente el tubo en el baño de

agua a 40 ºC y se sigue agitando manualmente durante 60 s ± 2 s. Estas acciones se deben
realizar en aproximadamente 30 s.
8.4.3 Se retira el tubo del baño de agua y se agita vigorosamente a 40 ºC durante 120 s ± 2 s
con el agitador (véase el numeral 5.2.3).
8.4.4 Se agrega inmediatamente 1 ml de ácido clorhídrico (véase el numeral 4.2.2) y

aproximadamente 1 ml de éter etílico (4.2.1). Se inserta el tapón y se agita vigorosamente con
el agitador (véase el numeral 5.2.3).
8.4.5 Se centrifuga y se traslada la fase orgánica a un tubo de ensayo con una jeringa (véase
el numeral 5.2.5). Si la porción de ensayo estaba sólida a temperatura ambiente, se repite la
extracción con una porción adicional de 1 ml de éter etílico y se combinan los extractos en el
tubo de ensayo.
8.5 AISLAMIENTO DE LOS 2-MONOGLICÉRIDOS
8.5.1 Preparación de las placas
NOTA Las placas completamente preparadas se pueden obtener en el comercio.

6
Se limpian cuidadosamente las placas de vidrio (véase el numeral 5.3.3) con etanol (véase el
numeral 4.3.1), hexano, o éter de petróleo (véase el numeral 4.3.2) y acetona (véase el
numeral 4.3.3) hasta remover totalmente toda materia grasa.
Se pesan 30 g de sílica para cromatografía (véase el numeral 4.3.4) en un erlenmeyer de 250 ml

(véase el numeral 5.3.10). Se agregan 60 ml de agua. Se inserta el tapón y se agita
vigorosamente durante 1 min. Se introduce inmediatamente la pasta en el distribuidor (véase el
numeral 5.3.2). Se distribuye una capa de 0,25 mm de espesor en las placas limpias. Se dejan
secar al aire al menos 1 h.
En todos los casos, bien sea que las placas se hayan preparado como se indicó antes o
comercialmente, se activan las placas en el horno (véase el numeral 5.3.7) a 103 ºC durante 1 h.
Antes de usar las placas, se dejan enfriar a temperatura ambiente en el desecador (véase el
numeral 5.3.13).
Para evitar las migraciones de ácido, las placas de sílica gel deberían ser impregnadas con
ácido bórico. La mezcla reactiva se debe separar por TLC tan pronto como sea posible.
Puesto que ciertas sílicas contienen productos orgánicos, los cuales pueden afectar los ácidos
grasos durante el análisis por cromatografía, se recomienda hacer un ensayo en blanco para
asegurar que no haya presencia de tales sustancias. Si no, se limpian las placas preparadas
con anticipación colocándolas en una cámara de desarrollo con el solvente (véase el numeral
4.3.5) y permitiendo que el solvente llegue a la parte superior de la placa.
8.5.2 Separación de los 2-monoglicéridos
Con una microjeringa (véase el numeral 5.3.4) se lleva el extracto (véase el numeral 8.4.5) a
una placa preparada (véase el numeral 8.5.1) en forma de banda continua de gotas finas a lo
largo de 15 mm desde uno de los bordes.
Se coloca la placa en la cámara de desarrollo (véase el numeral 5.3.1), la cual se ha saturado

previamente con el solvente de elusión (véase el numeral 4.3.5). Se vuelve a colocar la tapa y
se desarrolla la placa hasta que el frente del solvente llegue a un punto a 10 mm del borde
superior.
Se desarrolla la placa a una temperatura aproximada de 20 ºC.
Se seca la placa al aire, aproximadamente a 20 ºC y se rocía con la solución indicadora (véase

el numeral 4.3.6) con el aparato atomizador (véase el numeral 5.3.5). Se marca la banda de
monoglicéridos (Rf = 0,035 aproximadamente) bajo luz ultravioleta (véase el numeral 5.3.8) y se
raspa con una micro-espátula (véase el numeral 5.3.6). Se debe evitar la remoción de los
componentes que permanecen en la línea inicial.
Cuando se usen porciones de ensayo purificadas (véase el numeral 8.3), las cuales están
líquidas a temperatura ambiente, se traslada la sílica recogida a un balón de metilación de 25 ml
(véase el numeral 5.3.9) y se procede como se describe en el numeral 8.6.
Para porciones de ensayo purificadas (véase el numeral 8.3), las cuales están sólidas a
temperatura ambiente, se traslada la sílica a un erlenmeyer de 50 ml (véase el numeral 5.3.11)
con 15 ml de éter etílico. Se agita vigorosamente y se traslada toda la sílica a un filtro de vidrio
sinterizado (véase el numeral 5.3.12). Se lava el filtro tres veces, cada vez con un porción de
15 ml de éter etílico y se recoge el filtrado en el balón del roto evaporador. Se evapora la
solución de éter etílico hasta 4 ml ó 5 ml y se traslada a un balón de fondo redondo de 25 ml
pesado previamente (véase el numeral 5.9.3). Luego se evapora el solvente bajo corriente de
nitrógeno. Se pesa el residuo. La cantidad de monoglicéridos obtenidos debe estar entre 10 % (m/m)
7
y 30 % (m/m) de la muestra de ensayo. Si éste no fuera el caso, se repite la hidrólisis de los

triglicéridos (véase el numeral 8.3) o se verifica nuevamente la actividad de la lipasa (véase el
Anexo A).
8.6 ANÁLISIS DE LOS 2-MONOGLICÉRIDOS POR CROMATOGRAFÍA DE GASES
Se preparan los ésteres metílicos de los ácidos grasos de los monoglicéridos tratando
directamente la sílica gel recogida (o los monoglicéridos extraídos de la sílica), de acuerdo con
la NTC 5013, con el método general de trifluoruro de boro ó el método alterno aplicable a
grasas y aceites neutros. Se procede con la cromatografía de gases de los ésteres metílicos,
de acuerdo con la NTC 5013 (ISO 5508).
9. EXPRESIÓN DE LOS RESULTADOS
Se calculan las proporciones de la posición 2 de los ésteres de los ácidos grasos, expresados
como porcentaje por masa de todos los ésteres de los ácidos grasos de los 2-monoglicéridos.
Se dan los resultados a un decimal.
10. PRECISIÓN
10.1 ENSAYOS ENTRE LABORATORIOS
Los detalles de los ensayos de precisión del método entre laboratorios se resumen en el Anexo B.
Es posible que los valores derivados de estos ensayos no se puedan aplicar a los rangos de
concentración y a las matrices distintas de las indicadas.
10.2 REPETIBILIDAD
La diferencia absoluta entre los resultados de dos ensayos independientes, obtenidos con el
mismo método, material de ensayo idéntico, en el mismo laboratorio por el mismo operador,
usando el mismo equipo, en un intervalo corto de tiempo, no deberán superar:
0,2 % (m/m) para los constituyentes contenidos < 5 % (m/m);
1 % (m/m) ó 3 % de la media de los dos resultados para los constituyentes

contenidos ≥ 5 % (m/m);
10.3 REPRODUCIBILIDAD
La diferencia absoluta entre los resultados de dos ensayos independientes, obtenidos con el
mismo método, material de ensayo idéntico, en laboratorios diferentes, por diferentes
operadores, usando equipos diferentes, no deberán superar:
0,5 % (m/m) para los constituyentes contenidos < 5 % (m/m);
3 % (m/m) ó 10 % de la media de los dos resultados para los constituyentes contenidos

≥ 5 % (m/m);
8
11. INFORME DEL ENSAYO
El informe del ensayo deberá especificar:
- el método, de acuerdo con el muestreo (si se conociera);
- el método utilizado;
- el o los resultados obtenidos; y
- si se ha verificado la repetibilidad, se cita el resultado final obtenido.
- Deberá mencionar también las condiciones de operación no especificadas en

esta norma, o las que se consideren opcionales, así como los detalles de
cualquier incidente que pudiera afectar los resultados.
El informe del ensayo deberá incluir toda la información necesaria para identificar totalmente la
muestra.
9
ANEXO A
(Normativo)
PREPARACIÓN DE LA LIPASA Y VERIFICACIÓN DE SU ACTIVIDAD
A.1 PREPARACIÓN DE LA LIPASA
Se enfrían 5 kg de páncreas fresco de cerdo a 0 °C. Se retira la grasa sólida y el tejido

conectivo que lo rodea y se macera el páncreas hasta obtener una pasta líquida. Se macera
esta pasta entre 4 h y 6 h con 2,5 L de acetona seca en frío y luego se centrifuga.
Se extrae el residuo tres veces más con el mismo volumen de acetona, dos veces con una
mezcla de una parte de acetona por volumen por una parte de éter etílico por volumen y dos
veces con éter bietílico.
Se seca el residuo durante 40 h a presión reducida hasta obtener un polvo estable. Se guarda
este polvo en un refrigerador.
A.2 VERIFICACIÓN DE LA ACTIVIDAD DE LA LIPASA
En una mezcladora adecuada se prepara una emulsión de aceite agitando una mezcla de 165 ml
de una solución de 100 g/L de goma arábiga, 15 g de hielo molido y 20 ml de aceite
previamente neutralizado, durante aproximadamente 10 min.
Se colocan sucesivamente en un vaso de precipitado de 50 ml, 10 ml de la emulsión, 0,3 ml de

la solución de colato de sodio (200 g/L) y 20 ml de agua destilada.
Se coloca el frasco beaker en un baño de agua a 37 ºC (véase la Nota 1).
Se insertan los electrodos de un medidor de pH y un agitador de hélice en el vaso de

precipitados y, con una probeta de 5 ml, se agrega una solución de 0,1 mol/L de hidróxido de
sodio, gota a gota hasta alcanzar un pH de 8,5.
Se agrega el volumen adecuado (véase la Nota 2), medido con exactitud del polvo de lipasa del
ensayo, en suspensión acuosa al 0,1 % (m/m). Tan pronto como el medidor de pH indique el
que pH es 8,3 se fija el reloj y se agrega 1,0 mol/L de solución de hidróxido de sodio para
mantener el valor pH en 8,3. Se toma nota del volumen de solución alcalina que se utiliza cada
minuto durante cerca de 10 min.
Se grafican los datos obtenidos, con el eje x para el tiempo y el eje y para el volumen, en
mililitros de la solución alcalina utilizada para mantener constante el pH. El resultado deberá ser
una línea recta.
NOTA 1 Puesto que se usa aceite líquido, la temperatura de la hidrólisis se fija a 37 ºC. Sin embargo, para el
ensayo se fija a 40 ºC, para poder examinar las grasas cuyo punto de fusión es inferior a 45 ºC.
NOTA 2 Para los fines de este ensayo, se usa una cantidad de lipasa en suspensión equivalente a 1 ml de la
solución alcalina que se consume en aproximadamente 4 min o 5 min. Usualmente se obtiene este resultado
utilizando de 2 ml a 5 ml de lipasa en suspensión; Ej.: de 1 mg a 5 mg de polvo.
La unidad de lipasa se define como la cantidad de enzima necesaria para liberar 1 µmol de
ácido por minuto a 37 °C con un pH de 8,3.
10
La actividad A, expresada en unidades de lipasa por miligramo del polvo utilizado, se obtiene
con la siguiente ecuación:
V .c
A =
m
en donde
V es el volumen de solución de hidróxido de sodio que se consume, dividido por tiempo, calculado de
acuerdo con el gráfico, en mililitros por minuto;
m es la masa de la porción de ensayo, en miligramos de polvo de lipasa; la lipasa que se use debe
tener una actividad entre 8 y 20 unidades de lipasa por miligramo;
c es la concentración de la solución de hidróxido de sodio, en mili moles por litro (c = 100 mmol/l).
A.3 NOTAS DE PRECAUCIÓN
El n-hexano o éter de petróleo liviano es extremadamente inflamable. Se debe utilizar un

dispositivo eficaz para extraer los vapores y se debe evitar la electricidad estática.
El éter dietílico es altamente inflamable y representa un riesgo alto de incendio o explosión al

exponerse al calor o llama. Es un depresor del sistema nervioso central mediante inhalación y
absorción por la piel. Formará peróxidos explosivos al exponerse a la luz. Los recipientes
vacíos se deben manipular con extrema precaución, particularmente aquellos de los que se ha
evaporado éter. Los límites explosivos en el aire son 1,85 %-48 %. El TLV (valor límite umbral)
es de 400 ppm en el aire. Siempre que se use éter etílico, se debería utilizar una campana
extractora de vapores.
La acetona es altamente inflamable y presenta riesgo de incendio. En altas concentraciones es

narcótico y moderadamente tóxico por ingestión e inhalación. Los límites explosivos en el aire
son 2,6 % -12,8 %. El TLV en el aire es 750 ppm.
11
ANEXO B
(Informativo)
RESULTADOS DE LAS ENSAYOS ENTRE LABORATORIOS
B.1 MÉTODO DE COLUMNA EMPACADA
Se hizo una ensayo entre laboratorios, en los Países Bajos, con muestras de grasa de cerdo,
grasa de res y una mezcla de 40/60 (V/V) de grasa de cerdo y grasa de res. Participaron 8
laboratorios. En la Tabla B.1 se indican los resultados estadísticos (evaluados de acuerdo con
la norma ISO 5725(2) después de eliminar los sobrantes. Los resultados se expresan como
porcentaje por masa de los ésteres metílicos de los ácidos grasos.
B.2 MÉTODO DE COLUMNA CAPILAR GLC
En 1993, AOCS/IOOC hizo un ensayo entre laboratorios, con tres muestras de aceite de oliva.
Participaron veinticuatro laboratorios. En la Tabla B.2 se indican los resultados estadísticos
(evaluados de acuerdo con la norma ISO 5725(2). Los resultados se refieren a los ácidos grasos
C16:0 y C18:0 en la posición e de las moléculas de triglicéridos.
Tabla B.1. Resultados estadísticos del estudio de grasas de cerdo y res con columna empacada
Ácidos grasos C14:0 C16:0 C16:1 C18:0 C18:1 C18:2 C18:3

A) Grasa de cerdo
Contenido promedio % (m/m) 4,0 70,6 3,0 4,5 11,3 4,0 0,39
Desviación estándar de 0,14 1,41 0,51 0,40 0,32 0,15 0,04
repetibilidad s,
Coeficiente de variación de 3,5 2,0 17,0 8,8 2,8 3,7 9,8
repetibilidad (%)
Limite de Repetibilidad r 0,40 4,00 1,45 1,13 0,89 0,41 0,12
reproducibilidad
Coeficiente de variación de la 4,1 2,5 27,4 8,9 6,3 20,4 22,6
reproducibilidad (5)
Límite de reproducibilidad R 0,46 5,05 2,33 1,14 2,02 2,28 0,27
B) Grasa de bovino
repetibilidad s,
repetibilidad (%)
reproducibilidad
C) Mezcla de grasa de cerdo y grasa de bovino, 40/60 (V/V) 0,74
repetibilidad s,
repetibilidad (%)
reproducibilidad
12
Tabla B.2 Resultados estadísticos del estudio de aceite de oliva

por el método de columna capilar GLC
Muestra 1 5 8
Número de laboratorios retenidos luego
23 23 22
de eliminar datos anormales
Contenido promedio % ( m/m) 0,86 1,39 1,02
Desviación estándar de repetibilidad s, 0,06 0,07 0,06
Coeficiente de variación de repetibilidad
6,70 5,42 5,98
(%)
Limite de Repetibilidad r 0,16 0,21 0,17
Desviación estándar de reproducibilidad 0,19 0,26 0,17
Coeficiente de variación de la
21,91 18,51 17,05
Límite de reproducibilidad R 0,53 0,73 0,49
13
ANEXO C
(Informativo)
BIBLIOGRAFÍA
[1] SO5555:1991, Animal and Vegetable Fats and Oliz. Sampling. NTC 217 Grasas y
aceites animales y vegetales. muestreo.
[2] ISO 5725:1986 PRECISION OF TEST METHODS – Determination of Repeatability and

Reproducibility for a Standard Test Method by Inter-Laboratory Tests (Now Withdrawn),
Was Used to Obtain the Precision Data. NTC 3529-1, NTC 3529 –2, NTC 3529 –3.
[3] AOCS Método Oficial Ch 3 –91, Determinación de ácidos grasos en la posición –2 en

triglicéridos de aceites y grasas.
14
DOCUMENTO DE REFERENCIA
INTERNATIONAL ORGANIZATION FOR STANDARDIZATION. Animal and Vegetable Fats and

Oils. Determination of the Composition of Fatty Acids in the 2 Position of the Triglyceride
Molecules. Geneve: ISO, 1997. 12 p.(ISO 6800).
15

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NORMA TÉCNICA NTC

GRASAS Y ACEITES ANIMALES Y VEGETALES.

E: ANIMAL AND VEGETABLE FATS AND OILS.DETERMINATION OF

CORRESPONDENCIA: este proyecto es una adopción modificada

DESCRIPTORES: grasas y aceites vegetales –

Editada por el Instituto Colombiano de Normas Técnicas y Certificación (ICONTEC)

Prohibida su reproducción Primera actualización

El Instituto Colombiano de Normas Técnicas y Certificación, ICONTEC, es el organismo

La representación de todos los sectores involucrados en el proceso de Normalización Técnica

A continuación se relacionan las empresas que colaboraron en el estudio de esta norma a

ACEGRASAS S.A. FÁBRICA DE GRASAS Y PRODUCTOS

Además de las anteriores, en Consulta Pública el Proyecto se puso a consideración de las

ASINAL LTDA. INDUSTRIAS DEL MAÍZ S.A.

En el presente documento se incluye información importante para tomar precauciones

ISO6800: 1997 NTC Explicación

El éter etílico es altamente inflamable

La acetona es altamente inflamable y

GRASAS Y ACEITES ANIMALES Y VEGETALES.

Debido a la naturaleza de la acción de la lipasa pancreática, el método se aplica sólo a grasas

El método no se aplica exclusivamente a todas las grasas y aceites, particularmente aquellos

- ácidos grasos con grupos secundarios que contienen oxígeno.

NTC 5395:2005, Agua para uso en análisis de laboratorio. Especificación y métodos de

El método consiste en la neutralización de la grasa en un solvente adecuado, la purificación de

4.1 REACTIVOS PARA PURIFICAR LA MUESTRA DE ENSAYO

4.1.1 2-Propanol o etanol al 95 % (V/V).

4.1.3 2-Propanol, al 50 % (V/V) o etanol, al 50 % (V/V).

4.1.4 Solución de Hidróxido de sodio, al 0,5 mol/l

4.1.5 Solución de fenoftaleína, 1 g por 100 ml de etanol al 95 % (V/V).

4.2 REACTIVOS PARA LA HIDRÓLISIS DE LOS TRIGLICÉRIDOS

4.2.1 Éter etílico, libre de peróxidos

4.2.2 Solución de Ácido Clorhídrico, 6 mol/L

4.2.3 Colato de sodio, 1 g/L en solución, calidad enzimática.

4.2.4 Solución de Cloruro de calcio, 220 g/L

4.2.5 Solución amortiguadora, 2-amino-2-hidroximetil 1,3 propano-diol2), 1 mol/L, ajustado a

Esta solución se guarda entre 0 °C y 4 °C y se usa en un plazo de 14 d.

4.2.6 Lipasa pancreática, con una actividad entre 8 y 20 unidades/mg.

4.3 REACTIVOS PARA AISLAR LOS 2-MONOGLICÉRIDOS

4.3.1 Etanol, 95 % (V/V)

4.3.4 Sílica en Polvo, con aglomerante, para cromatografía de capa delgada.

4.3.5 Solvente de elusión, preparado como sigue:

hexano (si está disponible) o éter de petróleo 70 ml

ácido fórmico al 98 % (V/V) mínimo 1 ml

4.4 REACTIVOS PARA ANÁLISIS DE 2-MONOGLICÉRIDOS POR CROMATOGRAFÍA

Véanse las normas ISO 5508 y NTC 5013 (ISO 5509).

Equipo usual de laboratorio y lo siguiente, en particular:

5.1 APARATO PARA PURIFICAR LA MUESTRA DE ENSAYO

5.1.3 Roto evaporador, con balón de 250 ml

5.1.4 Tubos, para hacer burbujear el nitrógeno

5.1.5 Embudo de separación, con capacidad de 500 ml

5.1.6 Balón de fondo redondo, con capacidad de 100 ml

5.2 APARATOS PARA LA HIDROLISIS DE LOS TRIGLICÉRIDOS

5.2.2 Tubo de vidrio para centrífuga, con capacidad de 10 ml y tapón.

5.2.5 Jeringa hipodérmica, de 1 ml con aguja delgada

5.2.6 Reloj cronómetro

5.3 APARATOS PARA AISLAR LOS 2-MONOGLICÉRIDOS

5.3.2 Distribuidor y bandeja, para preparar las placas.

5.3.3 Placas de vidrio, o equivalentes de 200 mm x 200 mm.

5.3.4 Micro-jeringa, con capacidad para dispensar gotas de 3 µl a 4 µl.

5.3.5 Atomizador para rociar la solución indicadora sobre las placas.

5.3.7 Horno, capaz de mantener una temperatura de 103 °C ± 3 °C.

5.3.9 Balón de fondo redondo, con capacidad de 25 ml con condensador de aire de

5.3.10 Erlenmeyer, de 250 ml con tapón esmerilado.

5.3.11 Erlenmeyer, de 50 ml (si fuera necesario).