HUMANA

CA
BIO UÍMI

- F
QB II
MED -
Q

CÁTEDRA 1
UB
.

A - DPTO

TRABAJO PRÁCTICO
CURVAS DE CONSUMO
DE OXÍGENO

MATERIA: QUÍMICA BIOLÓGICA II

CÁTEDRA 1
DPTO. BIOQUÍMICA HUMANA - FMED - UBA
CICLO LECTIVO 2022
 DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA HUMANA
CÁTEDRA 1 - QUÍMICA BIOLÓGICA - CICLO LECTIVO 2022

SÍNTESIS DE ATP Y CADENA RESPIRATORIA

En las células eucariontes, la síntesis de ATP acoplada a la cadena de transporte de

electrones, fosforilación oxidativa, ocurre en la membrana interna de las mitocondrias.
Dicha síntesis de ATP depende de un proceso quimiosmótico. Los electrones de alta
energía de los hidrógenos del NADH y el FADH2 (compuestos con una baja tendencia a
reducirse) son cedidos a un compuesto con menor energía (alto potencial de reducción).
La energía liberada en su paso de un transportador a otro (pares rédox), es utilizada para
bombear protones a través de la membrana interna desde la matriz mitocondrial al
espacio intermembrana. Esto genera un gradiente electroquímico de protones a través de
la membrana mitocondrial interna y aprovechando dicho gradiente, éstos vuelven a la
matriz a través de la H+/ATP sintasa que cataliza la fosforilación del ADP para dar ATP,
en un proceso a favor de gradiente.
La teoría quimiosmótica predice la existencia de un gradiente de pH transmembrana.
Esto se puede comprobar experimentalmente. Cuando se agrega un sustrato oxidable
(succinato, por ejemplo) y O2 a una suspensión de mitocondrias aisladas, se puede
detectar la acidificación del medio. Las determinaciones estequiométricas indican que
cuando se transfiere un par de electrones a partir del NADH a través del complejo I se
translocan 4 H+ y los complejos III y IV translocan 6 H+ entre ambos. Además, se ha
detectado que por cada ATP sintetizado se toman 3 o 4 H+ del espacio intermembrana.
Cuando se intenta calcular la relación P/O no da un número exacto y actualmente se
considera que el rendimiento de la cadena respiratoria acoplada a la fosforilación
oxidativa es de 2,5 moles de ATP cuando se oxida un mol de NADH y de 1,5 moles de
ATP cuando se oxida un mol de FADH2.
En mitocondrias normales la reacción de oxidación del sustrato respiratorio (NADH o
succinato) depende de la presencia de ADP y Pi. En condiciones fisiológicas, la matriz
mitocondrial contiene alta concentración de Pi, de manera que la concentración de ADP
es la reguladora de la actividad del sistema de transporte de electrones y, por lo
tanto, de la respiración mitocondrial.
La funcionalidad de la cadena de transporte de electrones y fosforilación oxidativa
mitocondriales pueden ser evaluadas midiendo la concentración de oxígeno presente en
una suspensión de mitocondrias intactas y/o la concentración de ATP del medio a lo largo
del tiempo en diferentes condiciones. El gráfico obtenido se denomina trazado
polarográfico.

Cuando se suspenden mitocondrias aisladas en una solución, a pH regulado, que

contiene ADP y Pi, y luego se agrega un sustrato oxidable como el succinato o el malato,
se producen tres procesos:
1.- se oxida el sustrato
2.- se consume O2 y
3.- se sintetiza ATP

Se puede utilizar un electrodo de O2 para medir sus niveles en la suspensión de

mitocondrias. Determinando como varía la concentración de O 2 a lo largo del tiempo se
obtiene el consumo de O2 mitocondrial.

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Si además de determinar la cantidad de O2 se toman muestras de la suspensión

para determinar el contenido de ATP, los resultados transferidos a un eje de coordenadas
serán similares a los de la siguiente figura.

[ ATP ]

ADP

Los trazados polarográficos de mitocondrias intactas permiten comprobar que en

ausencia de ADP la actividad es limitada, mientras que después de añadir ADP la
respiración se activa a niveles que pueden alcanzar hasta 20 veces el valor obtenido en
ausencia de este. Una vez que el ADP adicionado ha sido totalmente convertido en ATP,
la actividad respiratoria retorna a un nivel muy próximo al inicial. Al estado metabólico
caracterizado por la presencia de sustrato oxidable, en ausencia de ADP y consumo de
oxígeno lento se lo denomina “estado controlado” o estado “4”. La adición de ADP
establece un consumo de oxígeno rápido, y por ello a este estado se lo denomina “estado
activado” o estado “3”, que se mantiene hasta que todo el ADP ha sido fosforilado a ATP,
produciéndose entonces un retorno al estado “4”. El cociente entre las pendientes de
consumo de oxígeno en estado ”3” y en estado “4” se denomina índice de control
respiratorio y es la expresión del control que ejerce el ADP sobre el transporte de
electrones mitocondrial. El fenómeno de control respiratorio es de máxima importancia en
la regulación fisiológica de la respiración celular.

Se puede determinar que cuando se usa malato como sustrato oxidable se

producen 2,5 moles de ATP/mol de malato, mientras que con el succinato se obtienen 1,5
moles de ATP/mol de succinato. Este experimento nos indica que aún en condiciones
aisladas, las mitocondrias consumen O2 y son capaces de realizar síntesis de ATP.

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El índice de control respiratorio y el índice P:O (la relación entre el fosfato

incorporado al ATP y el oxígeno consumido al oxidar el sustrato) son utilizados para
expresar el grado de acoplamiento entre los procesos de oxidación y fosforilación. Bajos
valores de estos índices indican mitocondrias desacopladas o dañadas. El acoplamiento
de los procesos de transporte de electrones y de síntesis de ATP pueden ser modificados
por agentes químicos y por alteración física de la membrana mitocondrial.

Se pueden realizar experimentos para demostrar el acoplamiento entre la cadena

de transporte de electrones y la síntesis de ATP. (Los polarogramas se verán en la
ejercitación).
Cuando se agrega succinato, rápidamente aumenta la respiración (es el consumo
de O2 es mayor) y se sintetiza ATP. Si entonces se agrega cianuro (CN-) que bloquea la
transferencia de electrones entre la citocromo oxidasa y el O 2, ambos procesos se
detienen.

Dado que la energía de oxidación del sustrato (succinato, en este caso), es

necesaria para la síntesis de ATP, no debería sorprendernos que un inhibidor del pasaje
de electrones al O2 (el cianuro), bloquee la síntesis de ATP. Se puede también estudiar el
efecto de la inhibición de la síntesis de ATP sobre la transferencia de electrones en las
mitocondrias aisladas. Para realizar este experimento lo más sencillo es utilizar una
suspensión de mitocondrias en una solución de pH regulado en presencia de O 2 y de un
sustrato oxidable, pero sin el agregado ADP. En estas condiciones se observará que
además de la falta de formación de ATP, la transferencia de electrones al O 2, se reduce
drásticamente, dado que ambos procesos están acoplados.

También se puede comprobar el acoplamiento entre la oxidación y la fosforilación

mediante el uso de oligomicina, que inhibe la ATP sintasa (en particular la fracción Fo)
mitocondrial. Como se observa en la siguiente figura, cuando se agrega oligomicina a una
suspensión de mitocondrias, se detienen tanto la síntesis de ATP como el consumo de
O2. Dado que la oligomicina sólo actúa directamente sobre la síntesis de ATP, el hecho de
que esta droga también bloquee el consumo de O2, demuestra que, en condiciones
fisiológicas, ambos procesos están acoplados, es decir, cada uno de estos procesos
(transporte de electrones o síntesis de ATP) no ocurre si el otro se inhibe (síntesis de ATP
o transporte de electrones).

Existen, sin embargo, ciertas condiciones y/o reactivos que permiten desacoplar la
oxidación de las coenzimas de la fosforilación del ADP. Por ejemplo, cuando las
mitocondrias aisladas se rompen mecánicamente o por el uso de detergentes, en los
fragmentos de membrana obtenidos se puede observar que persiste la transferencia de
electrones al O2, pero no se produce la síntesis de ATP. Asimismo, como ya se
mencionó, ciertos compuestos químicos pueden desacoplar ambos procesos sin romper
la estructura mitocondrial. Estos desacoplantes químicos incluyen ácidos débiles con
propiedades hidrofóbicas, como por ejemplo el 2,4-dinitrofenol (DNP) y compuestos
denominados ionóforos que se unen a iones inorgánicos y los rodean de una estructura
hidrofóbica que fácilmente atraviesa la membrana. Como se observa en la figura anterior,
cuando se agrega DNP a una suspensión de mitocondrias, aún en presencia de
oligomicina (que interrumpe la síntesis de ATP), se restablece el consumo de O 2.

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A continuación, se muestran el esquema correspondiente a la cadena de transporte

de electrones acoplada a la fosforilación oxidativa y polarogramas típicos de [O2] = f
(tiempo) y [ATP] = f (tiempo), cuando se tiene una suspensión mitocondrial en presencia
de un sustrato oxidable y ADP. Estas herramientas serán de utilidad para contestar el
cuestionario que sigue.
ADP
[ ATP ]
[ O2 ]
ADP

tiempo tiempo

Teniendo en cuenta conocimientos básicos de reacciones rédox y de la cadena de

transporte de electrones, responder las siguientes preguntas:
a) ¿Cuáles pueden ser los sustratos oxidables para las curvas ejemplificadas?
b) ¿Cómo se modificarían las curvas ejemplificadas cuando a la suspensión mitocondrial
se agregan sucesivamente:
i. Malato, ADP, rotenona?
ii. Malato, ADP, antimicina?
iii. Succinato, ADP, rotenona?
iv. Succinato, ADP, antimicina?

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v. Malato, ADP, dinitrofenol?

vi. Malato, ADP, cianuro?
vii. Succinato, ADP, oligomicina?
viii. Succinato, ADP, oligomicina, dinitrofenol?
ix. Succinato, ADP, dinitrofenol, oligomicina?
x. Malato, ADP, antimicina, dinitrofenol?
xi. Malato, ADP, dinitrofenol, antimicina?
xii. Succinato, ADP, oligomicina, cianuro?
xiii. Succinato, ADP, cianuro, oligomicina?
xiv. Succinato, ADP, rotenona, 2,4 dinitrofenol y cianuro?
xv. Malato, ADP, cianuro, oligomicina y 2,4 dinitrofenol?
xvi. Malato, ADP, oligomicina, 2,4 dinitrofenol y cianuro?
c) Sabiendo que por cada mol de NADH + H+ que ingresa a la cadena respiratoria, la
fosforilación oxidativa acoplada produce aproximadamente 2,5 moles de ATP y se
consume medio mol de oxígeno, prediga la cantidad de ATP formado y de oxígeno
consumido para los siguientes procesos (considerar GTP = ATP):
i. Transformación de -cetoglutarato en succinato
ii. ídem i en presencia de 2,4 dinitrofenol
iii. transformación de isocitrato en succinato
iv. transformación de succinato en oxaloacetato
v. ídem iv en presencia de rotenona

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CASOS CLÍNICOS

I - Infarto de miocardio
Un hombre de 55 años se sintió mal después de almorzar, quejándose de dolor de
estómago y pecho. Se retiró a su domicilio a descansar y al fumar un cigarrillo se sintió
peor. Fue al hospital, donde se le indicó una radiografía de tórax, un electrocardiograma
(ECG) y se le determinaron enzimas séricas.
El trazado del ECG fue anormal por lo que se internó al paciente de inmediato.
Las enzimas CPK, LDH, GOT y GPT estaban elevadas.
Había sufrido un infarto de miocardio.
El infarto de miocardio se produce como consecuencia de una obstrucción en alguna
rama de la circulación coronaria. El flujo de sangre disminuye y como consecuencia se
produce isquemia. La falta de oxigenación produce necrosis celular de la parte del tejido
con defecto de irrigación.
Cuestionario
1) ¿Cuáles son los efectos de la anoxia sobre...
a) la respiración celular?
b) la relación NAD+/NADH intramitocondrial?
c) la cadena de transporte de electrones?
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d) la síntesis de ATP?
e) la velocidad del ciclo de Krebs?
f) el pH del tejido?
2) ¿Por qué al romperse las células del miocardio la enzima succinato deshidrogenasa es
la única enzima del ciclo de Krebs que no se detecta en plasma?
3) ¿Por qué el cigarrillo empeoró la situación del paciente? (hay que tener en cuenta que
la nicotina es vasoconstrictora).

II - Intoxicación con aspirina

Un niño de 5 años ingresa al hospital presentando fiebre de causa desconocida y
aumento de la frecuencia respiratoria. Del interrogatorio a la madre surge que el niño
había tomado aspirinetas (ácido acetilsalicílico, AAS) en dosis superiores a las toleradas
para su edad.
Los exámenes de laboratorio dieron los siguientes resultados
PACIENTE NORMAL
pH 7,3 7,38-7,42
pCO2 (mm Hg) 55 35
PO2 (mm Hg) 50 88
Cuestionario:
1) Dibuje el trazado polarográfico de las mitocondrias del músculo de este paciente.
2) ¿Cuál es el efecto de las cantidades tóxicas de AAS sobre...
a) la cadena de transporte de electrones?
b) la fosforilación oxidativa?
c) la velocidad del ciclo de Krebs?
3) ¿A qué se debe el aumento de la pCO2 y la disminución de la pO2 del paciente?
4) ¿A qué se debe el aumento de la frecuencia respiratoria?

III - Infección bacteriana

Una mujer de 34 años ingresa al servicio de emergencia de un hospital presentando
dolor agudo de abdomen de 20 horas de evolución. Se le diagnostica una infección con
bacterias Gram negativas, productoras de endotoxinas. El análisis de laboratorio de una
muestra de sangre arrojó los siguientes resultados:
PACIENTE NORMAL
Piruvato (mM) 3,5 30-60
Lactato (mM) 26,8 0,5-18
Diferencia arterio-venosa de O2 (vol) 0,5 5

Se realizaron los trazados polarográficos de la función mitocondrial del tejido

muscular (normal: A; de la paciente: B) y se obtuvieron los siguientes resultados:

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Cuestionario:
1) ¿Qué conclusión se puede sacar de la acción de la endotoxina sobre la cadena de
transporte de electrones? ¿A qué nivel de esta ejerce su acción? Justifique.
2) ¿Cuál será el efecto de la endotoxina sobre la fosforilación oxidativa? ¿Y sobre la
velocidad del ciclo de Krebs?
3) ¿A qué se debe la disminución de la diferencia arterio-venosa de O2?
4) ¿A qué se deben las concentraciones de piruvato y lactato hallados en la sangre del
paciente?