NORMA TÉCNICA NTC

COLOMBIANA 3630

2002-08-28

CALIDAD DEL AGUA.

DEMANDA BIOQUÍMICA DE OXÍGENO (DBO)

E: WATER QUALITY. BIOCHEMICAL OXYGEN DEMAND (BOD)

CORRESPONDENCIA: esta norma es idéntica (IDT) a las

partes A y B de la Sección 5210 del
STANDARD METHODS FOR THE
EXAMINATION OF WATER AND
TH
WASTEWATER. 20 Edition. 1998.

DESCRIPTORES: calidad del agua; demanda

bioquímica de oxígeno; análisis de
agua; DBO.

I.C.S.: 13.060.50

Editada por el Instituto Colombiano de Normas Técnicas y Certificación (ICONTEC)

Apartado 14237 Bogotá, D.C. - Tel. 6078888 - Fax 2221435

Prohibida su reproducción Primera actualización

Editada 2002-09-16
 PRÓLOGO

El Instituto Colombiano de Normas Técnicas y Certificación, ICONTEC, es el organismo

nacional de normalización, según el Decreto 2269 de 1993.

ICONTEC es una entidad de carácter privado, sin ánimo de lucro, cuya Misión es fundamental
para brindar soporte y desarrollo al productor y protección al consumidor. Colabora con el
sector gubernamental y apoya al sector privado del país, para lograr ventajas competitivas en
los mercados interno y externo.

La representación de todos los sectores involucrados en el proceso de Normalización Técnica

está garantizada por los Comités Técnicos y el período de Consulta Pública, este último
caracterizado por la participación del público en general.

La NTC 3630 (Primera actualización) fue ratificada por el Consejo Directivo el 2002-08-28.

Esta norma está sujeta a ser actualizada permanentemente con el objeto de que responda en
todo momento a las necesidades y exigencias actuales.

A continuación se relacionan las empresas que colaboraron en el estudio de esta norma a

través de su participación en el Comité Técnico 000016 Agua.

ACODAL INSTITUTO NACIONAL DE SALUD

AQUALAB LTDA. IVONNE BERNIER LABORATORIO LTDA.-
BAVARIA S.A. IBLAB
CONCESIONARIA TIBITOC LAQMA LTDA.

Además de las anteriores, en Consulta Pública el Proyecto se puso a consideración de las

siguientes empresas:

ACEITES Y GRASAS VEGETALES S.A. COMPAÑÍA COLOMBIANA AUTOMOTRIZ

ACIPET COMPAÑÍA NACIONAL DE VIDRIOS S.A.
AGUAS DE MANIZALES S.A. ESP CORNARE
ALPINA PRODUCTOS ALIMENTICIOS DAMA
S.A. EMPRESA COLOMBIANA DE
AMBIENCOL INGENIEROS LTDA. PETRÓLEOS - ECOPETROL
ANTEK S.A. EMAC LTDA.
ASOCIACIÓN COLOMBIANA DE EMPRESA DE ACUEDUCTO Y
INGENIEROS DE PETRÓLEOS ALCANTARILLADO DE BOGOTÁ
ASOCIACIÓN COLOMBIANA DE EMPRESA DE ENERGÍA DE BOGOTA
INDUSTRIAS PLÁSTICAS EMPRESAS PÚBLICAS DE MEDELLÍN
ASOCIACIÓN NACIONAL DE ESCOBAR Y MARTÍNEZ
INDUSTRIALES - ANDI FRIGORÍFICO GUADALUPE
BAYER S.A. GASEOSAS LUX S.A.
CARVAJAL S.A. GOBERNACIÓN DE CUNDINAMARCA
CENTRAGAS GRIFFITH COLOMBIA S.A.
CEMENTOS BOYACÁ S.A. GRUPO AMBIENTAL INPTECO
CERVECERÍA LEONA S.A. IDEAM
CERVECERÍA UNIÓN S.A. INCOLBESTOS S.A.
INGEOMINAS SOCIEDAD COLOMBIANA DE TOXICOLOGÍA
INSTITUTO COLOMBIANO AGROPECUARIO SOCIEDAD DE ACUEDUCTO,
ICA ALCANTARILLADO Y ASEO DE
INTEGRAL S.A. BARRANQUILLA S.A. ESP
LARKIN LTDA. SUPERINTENDENCIA DE INDUSTRIA Y
MINIPAK LTDA. COMERCIO
MINISTERIO DEL MEDIO AMBIENTE TEFCO LTDA.
MINISTERIO DE DESARROLLO UNILEVER ANDINA S.A.
MINISTERIO DE MINAS Y ENERGÍA UNIVERSIDAD CATÓLICA DE MANIZALES
MINISTERIO DE TRANSPORTE UNIVERSIDAD DE ANTIOQUIA
NESTLÉ DE COLOMBIA S.A. UNIVERSIDAD INCCA DE COLOMBIA
PANAMCO COLOMBIA S.A. UNIVERSIDAD DE LA SALLE
PELDAR LTDA. UNIVERSIDAD JAVERIANA
POSTOBÓN S.A. UNIVERSIDAD JORGE TADEO LOZANO
PROMIGAS S.A. UNIVERSIDAD LIBRE
SIEMENS SOCIEDAD ANÓNIMA UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA
SIKA ANDINA S.A.

ICONTEC cuenta con un Centro de Información que pone a disposición de los interesados
normas internacionales, regionales y nacionales.

DIRECCIÓN DE NORMALIZACIÓN
NORMA TÉCNICA COLOMBIANA NTC 3630 (Primera actualización)

CALIDAD DEL AGUA.

DEMANDA BIOQUÍMICA DE OXÍGENO (DBO)*

OBJETO

Esta norma tiene por objeto establecer el método de ensayo para determinar la demanda
bioquímica de oxígeno (DBO) a los 5 d en aguas contaminadas.

A. INTRODUCCIÓN

1. DISCUSIÓN GENERAL

La determinación de la demanda bioquímica de oxígeno (DBO) es un ensayo empírico, en el

cual se usan procedimientos de laboratorio normalizados para determinar los requisitos de
oxígeno relativos de las aguas residuales, efluentes, y aguas contaminadas. La mayor
aplicación de este ensayo es en la medición de descargas de desechos a plantas de
tratamiento y en la evaluación de la eficiencia de la remoción de la DBO en dichos sistemas de
tratamiento. El ensayo mide el oxígeno molecular utilizado durante un período de incubación
especificado para la degradación bioquímica de la materia orgánica (demanda de carbono), y el
oxígeno usado para oxidar la materia inorgánica como sulfuros y hierro ferroso. También puede
medir la cantidad de oxígeno empleado para oxidar formas reducidas de nitrógeno (demanda
de nitrógeno), a menos que su oxidación sea impedida por un inhibidor. Los procedimientos de
siembra y dilución permiten evaluar la DBO en un intervalo de pH de 6,5 a 7,5.

En esta norma se describen las mediciones del oxígeno consumido en un ensayo de 5 d (DBO
a los 5 d o DBO5, numeral B). En la Sección 5210, del Standard Methods, 20th Edition de 1998,
se describe la medición del oxígeno consumido después de 60 d a 90 d de incubación (DBO
última o DBOU, numeral C), y el consumo continuo de oxígeno (método respirométrico, véase
el método D). Existen muchas otras mediciones de variación de la demanda de oxígeno,
incluyendo el uso de períodos de incubación más cortos o más largos y pruebas para
determinar las velocidades de consumo de oxígeno. Se pueden seleccionar condiciones
alternativas de siembra, dilución e incubación para simular las condiciones del agua receptora,
de manera que se puedan estimar los efectos ambientales por las aguas residuales y efluentes.

La DBOU mide el oxígeno requerido para la degradación total de la materia orgánica (demanda
de carbono última); o el oxígeno para oxidar los compuestos de nitrógeno reducido (demanda

*
Aprobado por Standard Methods Committee. 1997
1
NORMA TÉCNICA COLOMBIANA NTC 3630 (Primera actualización)

de nitrógeno última), o ambas. Son necesarios valores de la DBOU y descripciones cinéticas

apropiadas para los estudios de modelos de la calidad del agua, tales como las proporciones
de DBOU:DBO5 para evaluar la capacidad asimilativa de la corriente para cumplir con las
exigencias reglamentarias; para la definición de la cinética de desoxigenación del río, estuario,
o lago; y para los valores de la DBO de carbono última en la corriente para la calibración del
modelo.

2. DBO DE CARBONO CONTRA DBO DE NITRÓGENO

La exactitud y precisión de las mediciones de la DBO pueden verse afectadas por varios
factores, por ejemplo, la materia orgánica soluble contra la particulada; los sólidos
sedimentables y los sólidos en suspensión; la oxidación de compuestos reducidos de hierro y
azufre; o la falta de homogeneización. Actualmente, no existen los medios para incluir los
ajustes o correcciones que tengan en cuenta el efecto de estos factores.

En la oxidación de formas reducidas de nitrógeno, como amoníaco y nitrógeno orgánico,

pueden intervenir microorganismos y ejercer una demanda de nitrógeno. La demanda de
nitrógeno ha sido considerada históricamente como una interferencia en la determinación de la
DBO, como lo evidencia claramente la inclusión de amoníaco en el agua de dilución. La
interferencia de la demanda de nitrógeno se evita ahora por medio de una sustancia
inhibidora1. Si no se emplea una sustancia inhibidora, la demanda de oxígeno medida es la
suma de las demandas de carbono y de nitrógeno.

Las mediciones que incluyen la demanda de nitrógeno, generalmente no son útiles para
aseverar la demanda de oxígeno asociada con la materia orgánica. La demanda de nitrógeno
puede estimarse directamente del nitrógeno amoniacal (Véase la NTC 4783); y la demanda de
carbono puede estimarse restando el equivalente teórico de la oxidación del nitrógeno reducido
a los resultados de la prueba no inhibida. Sin embargo, este método es engorroso y está sujeto
a un error considerable. La inhibición química de la demanda de nitrógeno brinda una medida
más directa y confiable de la demanda de carbono.

El grado de oxidación de los compuestos nitrogenados durante el período de incubación de 5 d,

depende de la concentración y del tipo de microorganismos capaces de llevar a cabo esta
oxidación. Tales organismos usualmente no están presentes en las aguas negras primarias en
crudo o sedimentadas, en número bastante para oxidar cantidades suficientes de formas
reducidas de nitrógeno en el ensayo de DBO a los 5 d. Muchos efluentes de plantas de
tratamiento biológico contienen suficiente número de organismos nitrificantes para causar
nitrificación en pruebas de DBO. Debido a que puede ocurrir la oxidación de compuestos
nitrogenados en estas muestras, se recomienda la inhibición de la nitrificación, según el
numeral B.4e6), para muestras de un efluente secundario, para muestras inoculadas con un
efluente secundario, y para muestras de aguas contaminadas.

Se reportan los resultados como demanda bioquímica de oxígeno de carbono (DBOC5) cuando
se inhibe la demanda de oxígeno de nitrógeno. Cuando no se inhibe la nitrificación, se reportan
los resultados como DBO5.

3. REQUISITOS DE LA DILUCIÓN

La concentración de DBO en la mayoría de las aguas residuales excede la concentración de

oxígeno disuelto (OD) disponible en una muestra saturada de aire. Por ello, es necesario diluir
la muestra antes de la incubación para lograr un balance apropiado de demanda y suministro
de oxígeno. Puesto que el crecimiento bacterial requiere nutrientes como nitrógeno, fósforo y

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NORMA TÉCNICA COLOMBIANA NTC 3630 (Primera actualización)

metales traza, éstos son adicionados al agua de dilución, la cual es regulada para garantizar
que el pH de la muestra incubada permanezca en un intervalo adecuado para el crecimiento
bacterial. La estabilización total de una muestra puede requerir un período de incubación
demasiado largo para fines prácticos, por eso, se ha aceptado 5 d como el período de
incubación estándar.

Si el agua de dilución es de baja calidad, la DBO del agua de dilución debe aparecer como
DBO de la muestra. Este efecto será amplificado por el factor de dilución, lo cual resultará en
un sesgo positivo. Los métodos B, a continuación, y el C (véase en el Standard Methods, 20th
Edition, 1998), contienen tanto una comprobación del agua de dilución como un blanco de
prueba del agua de dilución. La calidad aceptable de las aguas de dilución inoculadas, se
verifica además midiendo el consumo de oxígeno de una mezcla orgánica conocida,
usualmente glucosa y ácido glutámico.

La fuente de agua de dilución debe ser agua tipo III (véase la norma ISO 3696), libre de
organismos biodegradables y de sustancias bioinhibidoras como cloro o metales pesados. El
agua destilada puede contener amoníaco u organismos volátiles; las aguas desionizadas están
frecuentemente contaminadas con materia orgánica lixiviada del lecho de la resina. El uso de
destiladores revestidos en cobre o accesorios de cobre en las líneas de agua destilada, puede
producir aguas con cantidades excesivas de cobre (Véase el Standard Methods, 20TH Edition,
1998, Section 3500-Cu).

4. REFERENCIA

YOUNG, J.C. 1973. Chemical methods for nitrification control. J. Water Pollut. Control Fed. 45:637.

5. BIBLIOGRAFÍA

THERIAULT, E.J., P.D. MCNAMEE & C.T. BUTTERFIELD. 1931. Selection of dilution water for
use in oxygen demand tests. Pub. Health Rep. 46:1084.

LEA, W.L. & M.S. NICHOLS. 1937. Influence of Phosphorus and Nitrogen on Biochemical
Oxygen Demand. Sewage Works J. 9:34.

RUCHHOFT, C.C. 1941. Report on the cooperative study of dilution waters made for the Standard
Methods Committee of the Federation of Sewage Works Associations. Sewage Works J. 13:669.

MOHLMAN, F.W., E. HURWITZ, G.R. BARNETT & H.K. RAMER. 1950. Experience with
modified methods for BOD. Sewage Ind. Wastes 22:31.

B. MÉTODO DE ENSAYO DE DBO A LOS 5 d

1. DISCUSIÓN GENERAL

a) Principio: El método consiste en llenar con la muestra, hasta rebosar, una botella para
DBO con sello de agua de un tamaño específico, que se incuba a la temperatura
especificada durante 5 d. El oxígeno disuelto se mide inicialmente y después de la
incubación, y se calcula la DBO por diferencia entre el oxígeno disuelto (OD) inicial y
final. Puesto que el OD inicial se determina poco tiempo después de hacerse la dilución,

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NORMA TÉCNICA COLOMBIANA NTC 3630 (Primera actualización)

todo el consumo de oxígeno que ocurre después de esta medición queda incluido en el
cálculo de la DBO.

b) Muestreo y almacenamiento: Las muestras para análisis de DBO pueden degradarse

considerablemente durante el almacenamiento entre su recolección y análisis, resultando
valores bajos de DBO. Se minimiza la reducción de DBO analizando la muestra
inmediatamente o enfriándola hasta una temperatura cercana a la congelación durante el
almacenamiento. No obstante, aún a baja temperatura, se debe reducir al mínimo el tiempo
de almacenamiento. Se deja que las muestras alcancen una temperatura de 20 ºC ± 3 ºC
antes del análisis.

1) Muestras puntuales. Si el análisis se inicia dentro de las 2 h después de la

recolección, no es necesario el almacenamiento en frío. Si no se comienza el
análisis dentro de las 2 h de la recolección de la muestra, se mantiene la
muestra a 4 ºC o menos desde el momento de la recolección. Se debe comenzar
el análisis dentro de las 6 horas después de la recolección; cuando esto no sea
posible por estar el sitio de muestreo distante del laboratorio, se almacenan a
menos de 4 ºC y se registra la duración y la temperatura de almacenamiento con
los resultados. En ningún caso se comienza el análisis después de las 24 h de
tomada la muestra puntual. Cuando se vayan a usar las muestras para fines
reglamentarios se debe hacer todo lo posible por entregarlas para su análisis
dentro de las 6 h posteriores a su recolección.

2) Muestras compuestas. Se conservan las muestras a 4 ºC o menos durante la

composición. Se limita el período de composición a 24 h. Se usa el mismo
criterio de almacenamiento empleado con las muestras puntuales, comenzando
la medición del tiempo de retención al finalizar el período de composición. Se
incluye el tiempo y las condiciones de almacenamiento en los resultados.

2. APARATOS Y EQUIPOS

a) Botellas de incubación: Se usan botellas de vidrio de 60 ml o de mayor capacidad

(preferiblemente botellas de 300 ml con tapón de vidrio esmerilado y boca
acampanada). Se limpian las botellas con un detergente, se enjuagan completamente y
se escurren antes de usarse. Como precaución para evitar recoger aire en la botella de
dilución durante la incubación, se usa un sello de agua. Se obtienen sellos de agua
apropiados invirtiendo la botella en un baño de agua o añadiendo agua en la boca
acampanada de botellas especiales para DBO. Se coloca una copa de papel o de
plástico o una tapa de hoja metálica fina, sobre la boca acampanada de la botella para
reducir la evaporación del sello de agua durante la incubación.

b) Incubadora de aire o baño de María, controladas por termostato a 20 °C ± 1 ºC. Se

excluye toda la luz para evitar la posibilidad de producción fotosintética de OD.

3. REACTIVOS

Se preparan los reactivos con antelación pero se descartan si hay algún signo de precipitación
o crecimiento biológico en las botellas de dilución. Se pueden aceptar equivalentes comerciales
de estos reactivos y usar diferentes concentraciones de solución de ensayo, siempre que se
ajusten las dosis proporcionalmente.

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NORMA TÉCNICA COLOMBIANA NTC 3630 (Primera actualización)

a) Solución estabilizadora de fosfato: Se disuelven 8,5 g de KH2PO4, 21,75 g de

K2HPO4, 33,4 g de Na2HPO4·7H2O, y 1,7 g de NH4Cl, en aproximadamente 500 ml
de agua destilada y se diluye todo a 1 L. El pH debe ser de 7,2 sin ajuste posterior.
Alternativamente, se disuelven 42,5 g de KH2PO4 o 54,3 g de K2HPO4, en
unos 700 ml de agua destilada. Se ajusta el pH a 7,2 con solución de NaOH
al 30 % y se diluye a 1 L.

b) Solución de sulfato de magnesio: se disuelven 22,5 g de MgSO4·7H2O en agua

destilada y se diluye a 1 L.

c) Solución de cloruro de calcio: se disuelven 27,5 g de CaCl2 en agua destilada y

se diluye a 1 L.

d) Solución de cloruro férrico: se disuelven 0,25 g de FeCl3·6H2O en agua destilada

y se diluye a 1 L.

e) Soluciones ácida y alcalina, 1 N, para la neutralización de muestras residuales

cáusticas o ácidas.

1) Ácido. Lentamente y mientras se revuelve, se adicionan 28 ml de ácido

sulfúrico concentrado en agua destilada. Se diluye a 1 L.

2) Álcali. Se disuelven 40 g de hidróxido de sodio en agua destilada. Se

diluye a 1 L.

f) Solución de sulfito de sodio: se disuelven 1,575 g de Na2SO3 en 100 ml de agua

destilada. Esta solución no es estable; se debe preparar diariamente.

g) Inhibidor de nitrificación: 2-cloro-6-(triclorometil) piridina.*

h) Solución de glucosa y ácido glutámico: se secan la glucosa de grado reactivo y

el ácido glutámico de grado reactivo a 103 ºC por una hora. Se adicionan 150 mg
de glucosa y 150 mg de ácido glutámico en agua destilada y se diluye a 1 L. Se
prepara esta solución inmediatamente antes de usarse.

i) Solución de cloruro de amonio: se disuelven 1,15 g de NH4Cl en

aproximadamente 500 ml de agua destilada, se ajusta el pH a 7,2 con solución
de NaOH, y se diluye a 1 L. La solución contiene 0,3 mg de N/ml.

j) Agua de dilución: Se usa agua tipo III para hacer las diluciones de la muestra.
(Véase el numeral 3 y la norma ISO 3696)

* Inhibidor de Nitrificación, Fórmula 2533, Hach Co., Loveland, Co, o equivalente.

4. PROCEDIMIENTO

a) Preparación del agua de dilución: se adiciona el volumen de agua deseado (véase el

numeral 3 j), en una botella apropiada, y se adiciona 1 ml de solución de cada uno de
los siguientes compuestos: regulador de fosfato, soluciones de MgSO4, CaCl2 y FeCl3,
por litro de agua. Se siembra el agua de dilución, si se desea, como se describe en el
numeral 4 d). Se ensaya el agua de dilución tal como se describe en el numeral 4 h), de
forma que siempre se disponga de agua con la calidad requerida.

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NORMA TÉCNICA COLOMBIANA NTC 3630 (Primera actualización)

Antes de usarse, se lleva el agua de dilución a una temperatura de 20 ºC ± 3 ºC. Se

satura con OD mediante agitación en una botella parcialmente llena, o por aeración con
aire filtrado, libre de materia orgánica. Alternativamente, se almacena en botellas
taponadas con algodón, el tiempo suficiente para que el agua se sature de OD. Se
protege la calidad del agua utilizando accesorios de vidrio, tubos y botellas limpios.

b) Almacenamiento del agua de dilución: el agua de dilución (véase el numeral 3 j)) puede
almacenarse antes del uso mientras la dilución preparada cumpla los criterios de control
de calidad del blanco (véase el numeral 4 h)). Este almacenamiento puede mejorar la
calidad de algunas aguas de dilución, pero puede permitir que el desarrollo biológico
cause deterioro en otras. Preferiblemente, no almacenar el agua de dilución preparada
por más de 24 h después de añadirle nutrientes, minerales, y reguladores de pH, a
menos que el blanco de agua de dilución indique consistencia en el cumplimiento de los
límites de control de calidad. Se descarta el agua de dilución almacenada si el blanco
de prueba señala más de 0,2 mg/L de agotamiento en 5 d.

c) Comprobación con glucosa-ácido glutámico: puesto que el ensayo de DBO es un

bioensayo, sus resultados pueden estar influidos considerablemente por la presencia de
tóxicos o por el uso de inóculo de baja calidad. Las aguas destiladas frecuentemente
están contaminadas con cobre; algunos inóculos de aguas residuales son relativamente
inactivos. Con tales inóculos y aguas se obtienen siempre resultados bajos. Se verifica
periódicamente la calidad del agua de dilución, la efectividad del inóculo, y la técnica
analítica, realizando mediciones de la DBO en una mezcla de 150 mg de glucosa/L y
150 mg de ácido glutámico/L como solución de comprobación “estándar”. La glucosa
tiene una velocidad de oxidación excepcionalmente alta y variable pero cuando se
emplea con ácido glutámico, la velocidad de oxidación se estabiliza asemejándose a la
obtenida en muchas aguas residuales municipales. Alternativamente, si un agua
residual en particular contiene un componente principal identificable que contribuya a la
DBO, se usa un componente en lugar de glucosa-ácido glutámico.

Se determina la DBO a 5 d y 20 ºC de una dilución al 2 % de la solución de comprobación

estándar glucosa-ácido glutámico, empleando las técnicas de los numerales 4d-j. Se
ajustan las concentraciones de las mezclas comerciales para dar 3 mg/L de glucosa
y 3 mg/L de ácido glutámico en cada botella de ensayo GAG. Se evalúan los datos
como se describe en el numeral 6,sobre Precisión y Sesgo.

d) Siembra:

1) Origen del inóculo. Es necesario tener presente una población de

microorganismos capaces de oxidar la materia orgánica biodegradable en la
muestra. Las aguas residuales domésticas, los efluentes no clorados o no
desinfectados de plantas de tratamiento de residuos biológicos, y las aguas
superficiales que reciben descargas de aguas residuales, contienen poblaciones
microbianas satisfactorias. Algunas muestras no contienen una población
microbiana suficiente (por ejemplo, algunos residuos industriales no tratados,
residuos desinfectados, residuos a alta temperatura, o residuos con valores de
pH extremos). Para tales residuos se siembra el agua de dilución o la muestra
añadiendo una población de microorganismos. El inóculo preferido es un
efluente o licor mezclado de un sistema de tratamiento biológico que procese
residuos. Donde no sea posible conseguir este inóculo, se usa un sobrenadante
de aguas residuales domésticas después de dejarlo sedimentar a temperatura
ambiente durante al menos 1 h pero no más de 36 h. Cuando se emplee el
efluente de un proceso de tratamiento biológico, se recomienda inhibir la
nitrificación.

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NORMA TÉCNICA COLOMBIANA NTC 3630 (Primera actualización)

Algunas muestras pueden contener materia no degradada a tasas normales por

los microorganismos en aguas residuales domésticas sedimentadas. Se
siembran dichas muestras con una población microbiana adaptada, obtenida del
efluente no desinfectado del proceso de tratamiento biológico de residuos. En
ausencia de dichas facilidades, se obtiene el inóculo en las aguas receptoras
más abajo (preferiblemente de 3 km a 8 km) del punto de descarga. Cuando
tampoco se dispone de tales fuentes de inóculo, se desarrolla un inóculo
adaptado en el laboratorio, por medio de aeración continua de una muestra de
aguas negras domésticas sedimentadas, y añadiendo pequeños incrementos
diarios de residuos. Opcionalmente se utiliza una suspensión de suelo o lodo
activado, o un preparado de inóculo comercial para obtener la población
microbiana inicial. Se determina la existencia de una población satisfactoria
probando el desempeño del inóculo con ensayos de DBO sobre la muestra. Los
valores de DBO, que se incrementen con el tiempo de adaptación hasta un valor
estable alto, indican una adaptación exitosa del inóculo.

2) Control del inóculo. Se determina la DBO del material de siembra como para
cualquier otra muestra. Este es el control de inóculo. Con el valor del control de
inóculo y un conocimiento del factor de dilución del material que se va a sembrar
(en el agua de dilución), se determina el consumo de OD del inóculo.
Idealmente, se hacen las diluciones de inóculo de manera que la cantidad mayor
resulte con un agotamiento de OD de al menos un 50 %. Una gráfica de
agotamiento de OD, en miligramos por litro, contra mililitros de inóculo para
todas las botellas que tengan un agotamiento de 2 mg/L y 1,0 mg/L de OD
residual como mínimo, debe presentar una línea recta cuya pendiente indica
agotamiento de OD por mililitro de inóculo. El intercepto del eje OD es el
agotamiento de oxígeno causado por el agua de dilución y debe ser menor que
0,1 mg/L (véase el numeral 4h)). Como alternativa, se puede dividir el
agotamiento de OD por el volumen de inóculo en mililitros de toda botella de
control de inóculo que tenga 2 mg/L de agotamiento y un OD residual de 1 mg/L.
Se promedian los resultados de todas las botellas que cumplan los criterios de
agotamiento mínimo y OD residual. El consumo de OD atribuible al inóculo
agregado a cada botella debe estar entre 0,6 mg/L y 1,0 mg/L, pero la cantidad
de inóculo adicionado debe ajustarse de este rango a los límites requeridos, para
facilitar resultados de la comprobación con glucosa-ácido glutámico en el rango
de 198 mg/L ± 30,5 mg/L. Para determinar el consumo de OD de una botella de
ensayo, se resta el consumo de OD atribuible al inóculo, del consumo total de
OD (véase el numeral 5).

Las técnicas para adicionar el material de siembra al agua de dilución son

descritas para dos métodos de dilución de muestra en el numeral 4f).

e) Tratamiento previo de la muestra: se verifica el pH de todas las muestras antes de su

ensayo a menos que la experiencia previa indique que el pH está dentro del intervalo
aceptable.

1) Muestras con alcalinidad cáustica (pH > 8,5) o acidez (pH < 6,0). Se neutralizan
las muestras a pH entre 6,5 y 7,5 con una solución de ácido sulfúrico (H2SO4) o
se hidróxido de sodio (NaOH), de tal concentración que la cantidad de reactivo
no diluya la muestra en más del 0,5 %. El pH del agua de dilución no debe
afectarse por la menor dilución de muestra. Siempre se siembran muestras
cuyos pH han sido ajustados.

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NORMA TÉCNICA COLOMBIANA NTC 3630 (Primera actualización)

2) Muestras que contienen compuestos de cloro residual. Si es posible, se evitan

las muestras que contengan cloro residual tomando la muestra antes de los
procesos de cloración. Si la muestra ha sido clorada pero no hay residuos
perceptibles de cloro presentes, se siembra el agua de dilución. Si hay cloro
residual presente, se desclora la muestra y se siembra el agua de dilución
(véase el numeral 4f). No se ensayan muestras cloradas/descloradas sin
sembrar el agua de dilución. En algunas muestras el cloro se disipará dentro de
1 h a 2 h de exposición a la luz. Esto ocurre con frecuencia durante la
transportación y manipulación de la muestra. En las muestras que el cloro
residual no se disipe en un tiempo razonablemente corto, se destruyen los
residuos de cloro agregando solución de Na2SO3. Se determina el volumen
requerido de solución de Na2SO3 en una porción de 100 ml a 1 000 ml de
muestra neutralizada, añadiendo 10 ml de 1:1 de ácido acético o 1:50 de H2SO4,
titulando con 10 ml de solución de yoduro de potasio (KI) por porción de 1 000 ml
(10 g/100 ml), y disolviendo con solución de Na2SO3 hasta el punto final de almidón
yodado para el residual. Se adiciona a la muestra neutralizada el volumen relativo
de solución de Na2SO3 determinado por el ensayo anterior, se mezcla, y
después de 10 min a 20 min se verifica el cloro remanente en la muestra.
(Nota. El exceso de Na2SO3 ejerce una demanda de oxígeno y reacciona
lentamente con ciertos compuestos de cloramina orgánica que pueden estar
presentes en muestras cloradas).

3) Muestras que contienen otras sustancias tóxicas. Algunos desechos industriales,

por ejemplo, los desechos de niquelado, contienen metales tóxicos. Tales
muestras requieren con frecuencia estudio y tratamiento especiales.

4) Muestras sobresaturadas de OD. Las muestras con contenido de más de 9 mg

de OD/ L a 20 ºC pueden encontrarse en aguas frías o en aguas donde ocurra
fotosíntesis. Para evitar la pérdida de oxígeno durante la incubación de dichas
muestras, se reduce el OD a la saturación a 20 ºC llevando la muestra hasta
aproximadamente 20 ºC en botella parcialmente llena, mientras se agita con
sacudidas vigorosas o por aeración con aire comprimido filtrado y limpio.

5) Se ajusta la temperatura de la muestra. Se lleva la muestra a 20 °C ± 1 ºC antes

de hacer las disoluciones.

6) Inhibición de nitrificación. Si desea inhibir la nitrificación, se adicionan 3 mg de 2-

cloro-6- (triclorometil) piridina (TCMP) a cada botella de 300 ml, antes de taparla,
o se adicionan cantidades suficientes al agua de dilución para lograr una
concentración final de 10 mg/L. (NOTA: La TCMP pura puede disolverse
lentamente y flotar en la superficie de la muestra. Algunos preparados
comerciales se disuelven con más facilidad pero no son TCMP al 100 %; se
ajusta la dosis convenientemente). Las muestras que puedan requerir inhibición
de nitrificación incluyen, sin limitarse a efluentes tratados biológicamente, las
muestras inoculadas con efluentes tratados biológicamente, y agua de ríos. Se
registra el uso de inhibición de nitrificación en el informe de resultados.

f) Técnica de dilución: se hacen varias diluciones de la muestra que den un OD residual

de al menos 1 mg/L y una ingestión de OD de 2 mg/L como mínimo después de 5 d de
incubación. Se recomiendan 5 diluciones, excepto que la experiencia con una muestra
en particular muestre que el uso de un número inferior de disoluciones produce al
menos dos botellas que den mínimos aceptables de agotamiento de OD y límites
residuales. Un análisis más rápido, como la DQO, puede correlacionarse
aproximadamente con la DBO y servir de guía para seleccionar las diluciones. A falta de

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conocimiento previo, se usan las soluciones siguientes: 0,0 % a 1,0% para residuos
industriales fuertes de 1 % a 5% para aguas residuales crudas o sedimentadas de 5 %
a 25 % para un efluente tratado biológicamente, y de 25 % a 100% para aguas de río
contaminadas.

Se preparan las diluciones ya sea en probetas graduadas o en frascos volumétricos de

vidrio, y se transfieren luego a botellas de DBO, o se preparan directamente en botellas
de DBO. Cualquiera de los métodos de dilución puede combinarse con cualquier técnica
de medición de OD. El número de botellas por preparar para cada dilución depende de
la técnica de OD y del número de réplicas deseado.

Cuando se utilicen probetas o frascos volumétricos para preparar las soluciones, y

cuando se requiera la siembra, se adiciona el inóculo ya sea directamente al agua de
dilución o a las probetas o frascos individuales antes de la dilución. La siembra de
probetas o frascos individuales evita una proporción descendente de inóculo con
relación a la muestra cuando se hacen diluciones crecientes. Cuando las diluciones se
preparan directamente en botellas de DBO y cuando se necesita sembrar, se añade el
inóculo directamente al agua de dilución o directamente a las botellas de DBO. Cuando
una botella contiene más del 67 % de la muestra después de la dilución, se pueden
limitar los nutrientes en la muestra diluida y posteriormente reducir la actividad biológica.
En tales muestras, se añaden los nutrientes, minerales y las soluciones reguladoras del
pH (véanse los numerales del 3a) al 3e) directamente a botellas de DBO individuales en
una proporción de 1 ml/L (0,33 ml/botella de 300 ml) o se usan soluciones de
preparados comerciales dosificadas para el tamaño de botella apropiado.

1) Disoluciones preparadas en probetas graduadas o frascos volumétricos. Si se

emplea la modificación de ázida del método por titulación yodométrica (Véase el
Standard Method, 20 TH Edition, Section 4500-O.C), se extrae por sifonamiento
el agua de dilución, inoculada si es necesario, a un frasco o probeta de 1 L a 2 L
de capacidad. Se llena hasta la mitad sin permitir el arrastre del aire. Se añade la
cantidad deseada de muestra cuidadosamente mezclada y se diluye al nivel
apropiado con agua de dilución. Se mezcla bien con una jeringa mezcladora; se
evita el arrastre de aire. Se sifonea la dilución mezclada en dos botellas de DBO.
Se determina el OD inicial en una de estas botellas. Se tapona herméticamente
la segunda botella, se sella con agua, y se incuba durante 5 d a 20 ºC. Si se
emplea el método de electrodo con membrana para medir el OD, se sifonea la
mezcla de dilución a una botella de DBO. Se determina el OD inicial en esta
botella y se reemplaza cualquier pérdida de contenido con dilución de muestra
hasta llenar la botella. Se tapona ajustadamente, se sella con agua, y se incuba
durante 5 d a 20 °C.

2) Disoluciones preparadas directamente en botellas de DBO. Se emplea una

pipeta volumétrica de boquilla ancha con la que se adiciona el volumen de
muestra deseado, en botellas de DBO individuales de capacidad conocida. Se
añaden cantidades apropiadas de material de siembra, ya sea a las botellas
individuales o al agua de dilución. Se llenan las botellas con suficiente agua de
dilución, se siembra si es necesario, de manera que la inserción del tapón
desplace todo el aire sin dejar burbujas. Para diluciones mayores que 1:100 se
hace una dilución primaria en una probeta antes de realizar la dilución final en la
botella. Cuando se usen métodos de titulación yodométrica para la medición del
OD, se preparan dos botellas por cada dilución. Se determina el OD inicial en
una botella. Se tapona la segunda botella, se sella con agua, y se incuba por 5 d
a 20 ºC. Si se emplea el método de electrodo de membrana para medir el OD, se
prepara sólo una botella de DBO por cada dilución. Se determina el OD inicial en

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esta botella y se reemplaza cualquier contenido desplazado con agua de dilución

hasta llenar la botella. Se ajusta el tapón, se sella con agua, y se incuba durante
5 d a 20 °C. Se enjuaga el electrodo de OD entre cada medición para evitar la
contaminación cruzada.

Se usa la modificación de azida del método yodométrico (Véase la NTC 4705

(Standard Methods, 20 TH Edition, Section 4500-O.C)), o el método de electrodo
con membrana (Véase la NTC 4705 (Standard Methods, 20 TH Edition,
Section 4500 - O.G)) para determinar el OD inicial en todas las diluciones de
la muestra, diluciones de blancos, y cuando sea conveniente, en los controles
del inóculo.

Si se emplea el método de electrodo de membrana, se recomienda la

modificación de ázida del método yodométrico (Véase la NTC 4705, Standard
Methods, 20 TH Edition, Section 4500 O.C) para calibrar el medidor de OD.

g) Determinación del OD inicial: si la muestra contiene materia que reacciona rápidamente

con el OD, se determina el OD inicial inmediatamente después de llenar la botella de
DBO con la muestra diluida. Si el consumo rápido de OD inicial es insignificante, el
período de tiempo entre la preparación de la dilución y la medición del OD inicial no es
crítico, pero no debe exceder los 30 min.

h) Blanco de agua de dilución: se usa un blanco de la dilución como verificación preliminar

de la calidad del agua de dilución sin sembrar y de la limpieza de las botellas de
incubación. Junto con cada lote de muestras se incuba una botella de agua de dilución
sin sembrar. Se determina el OD inicial y el OD final como en los numerales 4g y 4j. El
consumo de OD no debe ser mayor de 0,2 mg/L y preferiblemente no debe ser superior
a 0,1 mg/L. Se descarta toda el agua de dilución con ingestión de OD mayor que 0,2 mg/L,
y se elimina la fuente de contaminación o se selecciona otra fuente de agua de dilución.

i) Incubación: se incuban las botellas de DBO con las diluciones a 20 ºC ± 1 ºC, los
controles de los inóculos, los blancos de agua de dilución, y las pruebas de verificación
de glucosa-ácido glutámico deseadas. Se sellan a prueba de agua las botellas, según
se describe en el numeral 4 f).

j) Determinación del OD final: después de 5 d de incubación, se determina el OD en las

diluciones de muestra, en los blancos, y en las pruebas de verificación, como en el
numeral 4 g).

5. CÁLCULO

Para cada botella de ensayo que cumpla los 2,0 mg/L de agotamiento mínimo de OD y 1,0 mg/L de
OD residual, se calcula la DBO5 como sigue:

Cuando el agua de dilución no está inoculada:

D1 − D2
DBO5 , mg / L =
P

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Cuando el agua de dilución está inoculada:

DBO5 , mg / L =
(D
1 − D
2
) − (B
1 − B2 ) f
P
de donde

D1 = OD de la muestra diluida inmediatamente después de la preparación,

mg/L,

D2 = OD de la muestra diluida después de 5 d de incubación a 20 ºC, mg/L,

P = fracción volumétrica decimal de la muestra usada,

B1 = OD del control de inóculo antes de la incubación, mg/L (Véase el numeral

4 d),

B2 = OD del control de inóculo después de la incubación, mg/L (Véase el

numeral 4 d), y

f = relación del inóculo en la muestra diluida al inóculo en el control del

inóculo = (% inóculo en la muestra diluida)/(volumen del inóculo en el
control del inóculo).

Si el inóculo se añade directamente a la muestra o a las botellas de

control del inóculo:

f = (volumen de inóculo en la muestra diluida)/(volumen de inóculo en el

control del inóculo).

Se reportan los resultados como DBOC5, si se inhibe la nitrificación.

Si más de una dilución de muestra cumple los criterios de un OD residual de al menos 1 mg/L y
un agotamiento de OD de al menos 2 mg/L, y no existe evidencia de toxicidad a
concentraciones mayores de muestra o presencia de alguna anomalía obvia, se promedian los
resultados en el intervalo aceptable.

En estos cálculos, no se deben hacer correcciones de consumo de OD por el blanco durante la

incubación. Esta corrección es innecesaria si el agua de dilución cumple los criterios de blanco
estipulados anteriormente. Si el agua de dilución no cumple estos criterios, se hace difícil una
corrección adecuada; no se registran los resultados, o como mínimo, se indica que no cumplen
los criterios de control de calidad.

6. PRECISIÓN Y SESGO

No existe una medida para establecer el sesgo del procedimiento de la DBO. La prueba de
glucosa-ácido glutámico prescrita en el numeral 4 c), pretende ser un punto de referencia para
la evaluación de la calidad del agua de dilución, la eficiencia del inóculo, y la técnica analítica.
Ensayos de laboratorios individuales, usando una solución mezclada de glucosa-ácido
glutámico de 300 mg/L, arrojaron los resultados siguientes:

Número de meses: 14

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Número de triplicados: 421

Recuperación promedio mensual: 204 mg/L

Desviación estándar promedio mensual: 10,4 mg/l

En una serie de estudios interlaboratorios1, que involucraron de 2 a 112 laboratorios cada uno
(e igual número de analistas y fuentes de inóculo), se hicieron mediciones de DBO a los 5 d en
muestras de agua sintéticas con una mezcla 1:1 de glucosa y ácido glutámico en el rango total
de
__
concentración de 3,3 mg/L a 231 mg/L. Las ecuaciones de regresión para el valor medio,
X , y desviación estándar, S, de dichos estudios fueron:

__
X = 0,658 (nivel agregado, mg/L) + 0,280 mg/L

S = 0,100 (nivel agregado, mg/L) + 0,547 mg/L

Para la prueba estándar primaria mezclada de 300 mg/L, la DBO promedio a los 5 d sería de 198
mg/L con una desviación estándar de 30,5 mg/L. Cuando se usan inhibidores de nitrificación los
ensayos de GAG que caigan fuera del límite de control de 198 ± 30,5 indican con bastante
frecuencia el uso de cantidades de inóculo incorrectas. Se ajusta la cantidad de inóculo agregada al
ensayo GAG para lograr que los resultados caigan dentro de este rango.

a) Límites de control: Debido a los numerosos factores que afectan los ensayos de
DBO en estudios multi-laboratorios y la consiguiente variabilidad extrema en los
resultados de los ensayos, se recomienda una desviación estándar, determinada
según los ensayos inter-laboratorios, como límite de control para laboratorios
individuales. Como alternativa, para cada laboratorio, se establecen sus límites
de control efectuando un mínimo de 25 pruebas de glucosa-ácido glutámico
(véase el numeral 4 c) por un período de varias semanas o meses, y calculando
la media y la desviación estándar. Se usa el promedio ± 3 desviaciones estándar
como el límite de control para futuras comprobaciones con glucosa-ácido
glutámico. Se comparan los límites de control calculados con los ensayos de un
laboratorio individual y con los resultados inter-laboratorios presentados
anteriormente. Si los límites de control están fuera del rango de 198 ± 30,5, se
evalúan nuevamente los límites de control y se investiga la fuente del problema.
Si la DBO medida por una prueba de glucosa-ácido glutámico está fuera del
rango del límite de control aceptado, se rechazan los ensayos hechos con ese
inóculo y esa agua de dilución.

b) Rango de trabajo y límite de detección: El rango de trabajo es igual a la

diferencia entre el máximo OD inicial (7 mg/L a 9 mg/L) y mínimo OD residual de
1 mg/L multiplicado por el factor de dilución. Los requisitos establecen un límite
inferior de detección de 2 mg/L para un agotamiento de OD mínimo de 2 mg/L.

7. REFERENCIA
1
U.S. ENVIRONMENTAL PROTECTION AGENCY, OFFICE OF RESEARCH AND
DEVELOPMENT. 1986. Method-by-Method Statistics from Water Pollution (WP) Laboratory
Performance Evaluation Studies. Quality Assurance Branch, Environmental Monitoring and
Support Lab., Cincinnati, Ohio.
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8. BIBLIOGRAFÍA

YOUNG, J.C., G.N. MCDERMOTT & D. JENKINS. 1981. Alterations in the BOD Procedure for
the 15th Edition of Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater. J. Water
Pollut. Control. Fed. 53:1253.

DOCUMENTO DE REFERENCIA

AMERICAN PUBLIC HEALTH ASSOCIATION; AMERICAN WATER WORKS ASSOCIATION;

WATER ENVIRONMENT FEDERATION. Standard Methods For The Examination of Water and
Wastewater, 20 TH Edition. 1998. Washington. Biochemical Oxygen Demand (BOD).Section 5210
A, B. 6 p.

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