DETERMINACIÓN DE ACETAMINOFEN EN UN MEDICAMENTO POR

CROMATOGRAFIA LIQUIDA (HPLC)

Marcelo Echeverry (1640126)1, Zulma Moari Martínez (1643929)2
stiven.echeverry@correounivalle.edu.co1, zulma.moari@correounivalle.edu.co2
Departamento de Química – Universidad del Valle.
Fecha de realización: 28/02/2020
Fecha de entrega: 06/02/2020
Docente: Harold Díaz

Resumen: Se determinó el contenido de acetaminofén por cromatografía liquida (HPLC) usando el

método de patrón externo, inicialmente se utilizó acetaminofén grado analítico para preparar una
solución patrón, la cual se usó para preparar 6 soluciones estándar de acetaminofén entre el rango
(2.0-16.0 mg/L) a las cuales se le adicionaron 5 mL de metanol grado HPLC y se enrazaron con agua
desionizada, seguidamente se pulverizo la muestra y se pesó adicionándole 5 mL metanol grado
HPLC. Posteriormente se filtraron los estándares, la muestra, y el blanco a través de una membrana
de 0.45𝜇𝑚. Finalmente, se realizó las medidas del área del pico en un cromatógrafo con un sistema
de inyección manual. Por medio de la curva obtenida a partir del método de mínimos cuadrados se
cuantifico el contenido de acetaminofén en la muestra de 267,62 ± 0,2 mg con un error relativo
de 46,5 %.

Palabras claves: curva de calibración patrón externo, acetaminofén, HPLC

Cálculos y resultados.

Solución patrón de acetaminofén 𝑆 0.0001 2 0.1 2

= √( ) + ( )
[201] 0.0201 100.0
Se realizó el cálculo para determinar cuántos
gramos eran necesarios de acetaminofén 𝑆𝑠𝑜𝑙𝑢𝑐𝑖ó𝑛 𝑝𝑎𝑡𝑟ó𝑛 = 1.0
analítico para preparar 100.0 mL de una
solución de 200.00 mg/L de acetaminofén [𝑠𝑜𝑙𝑢𝑐𝑖ó𝑛 𝑝𝑎𝑡𝑟ó𝑛] = (201.0 ± 1.0) 𝑚𝑔/𝐿
analítico.
Curva de calibración método patrón
200.0 𝑚𝑔 1𝐿 externo
100.0 𝑚𝐿 × ×
1𝐿 1000 𝑚𝐿
= 20 𝑚𝑔 𝑎𝑐𝑒𝑡𝑎𝑚𝑖𝑛𝑜𝑓𝑒𝑛 Preparación de soluciones estándares
Se pesaron 0.0201 g de acetaminofén analítico Se realizó el cálculo del volumen necesario
y se transfirieron a un matraz de 100.0 mL, se para preparar 6 soluciones estándar en un
adiciono 5.00 mL de metanol grado HPLC y matraz de 50.00 mL con concentraciones en un
se enrazo con agua desionizada. rango de 2.0-16.0 mg/L de acetaminofén.

Teniendo en cuenta las desviaciones de los 𝑉1 ∗ 𝐶1 = 𝑉2 ∗ 𝐶2 𝑬𝒄𝒖. 𝟐

factores implicados en la determinación de la
concentración de la solución patrón, se Estándar 1. Concentración 2.0 mg /L
procedió a realizar el cálculo para su
respectiva desviación, se utilizó ecuación 1. Despejando el V1 de la ecuación 2, se obtuvo
los mL necesarios para preparar el estándar 1.
𝑺[𝒚] 𝑺𝒂 𝟐 𝑺𝒃 𝟐 𝑺𝒄 𝟐
= √( ) + ( ) + ( ) 𝑬𝒄𝒖𝟏 50.0 𝑚𝐿 ∗ 2.0 𝑚𝑔/𝐿
[𝒚] 𝒂 𝒃 𝒄 𝑉1 = = 0.5 𝑚𝐿
201 𝑚𝑔/𝐿
 Luego se filtraron los estándares, la muestra, y
𝑉1 = 0.5 𝑚𝐿 el blanco a través de una membrana de 0.45𝜇𝑚
.
De manera análoga se calculó el volumen Medición en el cromatógrafo.
necesario de solución patrón para las
soluciones restantes los resultados se muestran Se utilizó un cromatógrafo de marca
en la tabla 1. HEWLETT PACKARD serie 1100, con un
sistema de inyección de manual 1000 de 20.0
Tabla 1. Datos experimentales de las mL el cual se ajustó con las condiciones del
concentraciones, método patrón externo. análisis necesarias tal como se muestra en la
Estándar Concentración volumen tabla 2.
Acetaminofén de la sln
(mg/L) patrón Tabla 2. Condiciones operacionales en el
mL cromatógrafo
Parámetro Condiciones
1 2.0±0.02 0.5
Fase movil Metanol-agua 50-50
2 4.0±0.2 1.0 Flujo 0.5 mL / min
3 8.0±0.1 2.0 Columna Hyspersil ODS
4 12.0±0.1 3.0 Detector UV 243 nm
5 16.0±0.1 4.0
Después de que se estabilizara la línea base del
Preparación de la muestra instrumento, con el inyector del cromatógrafo
en posición “load” se llenó el “boucle” de
Se procedió a realizar el cálculo para 20.0 𝜇𝐿 utilizando una jeringa de 50 𝜇𝐿,
determinar cuántos gramos de muestra se posteriormente se cambió la posición del
requieren para analizar y preparar 100.0 mL de inyector a “inject”.y se obtuvo el cromatógrafo
una solución cuya la cual es la respuesta del detector con respecto
al tiempo y nos brinda la relación del área del
20 𝑚𝑔 𝑎𝑐𝑒𝑡𝑎𝑚𝑖𝑛𝑜𝑓𝑒𝑛 pico con la concentración del acetaminofén
1 𝑡𝑎𝑏𝑙𝑒𝑡𝑎 este procedimiento se le realizo a todas las
∗ soluciones estándar y la muestra.
500 𝑚𝑔 𝑎𝑐𝑒𝑡𝑎𝑚𝑖𝑛𝑜𝑓𝑒𝑛
1.1121 𝑔 𝑎𝑐𝑒𝑡𝑎𝑚𝑖𝑛𝑜𝑓𝑒𝑛 Los valores obtenidos se muestran en la
∗ siguiente tabla 3.
1 𝑡𝑎𝑏𝑙𝑒𝑡𝑎
= 0,04 𝑔
Tabla3. Datos experimentales, medición del
Se pulverizaron las tabletas se tomó 0.04g de área del pico de los estándares y de la
muestra la cual se transfiere a un matraz de muestra.
100.0 mL se le adiciono 5.00 mL de metanol Estándar Concentración Área del
grado HPLC, se agito durante 5 min y se acetaminofén pico
completó el volumen con agua desionizada. 1 2.0±0.02 460.160
2 4.0±0.2 1000.100
Preparación del blanco 3 8.0±0.1 1600.900
4 12.0±0.1 2216.200
En un matraz volumétrico de 10.0 mL se 5 16.0±0.1 3040.700
adiciono 0.5 mL de metanol grado HPLC, y se Muestra 1 1539.71
enraso con agua desionizada, seguidamente de
esta solución se tomó una alícuota 1.0 mL se
Se realizó la gráfica del área del pico en
llevó a un matraz de 25.00 mL y se enrazo con
función de la concentración de acetaminofén
agua desionizada.
mg/L resultando una línea recta.
 3500 Sxx = Σ(xi − x̅)2 𝑬𝒄𝒖. 3
3000 y = 176,08x + 184,53
Area del pico (A)
R² = 0,9935
Syy = Σ(yi − y̅)2 𝑬𝒄𝒖. 𝟒
2500
2000 Sxy = Σ(xi − x̅ )(yi − y̅ ) 𝑬𝒄𝒖. 𝟓
1500
1000 a = y̅ − bx̅ 𝑬𝒄𝒖. 𝟔
500
0 1 x̅ 2
0 5 10 15 Sa = SR√ + 𝑬𝒄𝒖. 𝟕
Concentracion (mg/L) n Sxx
Grafico 1. Curva de calibración de las Sxy
soluciones estándar de acetaminofén por el b= 𝑬𝒄𝒖. 𝟖
método patrón externo. Sxx
SR
La linealidad determina la relación directa Sb = 𝑬𝒄𝒖. 𝟗
√Sxx
entre la señal instrumental (área del pico) y la
concentración del producto analizado
(acetaminofén). Para evaluar el índice de ΣSyy − b 2 Sxx
SR = √ 𝑬𝒄𝒖. 𝟏𝟎
correlación “r” se realizó una prueba t. n−2

Prueba t para evaluar el r 𝑰𝑪𝒃 = 𝒃 ± 𝒕( 𝒕 = 𝒏 − 𝟐) ∗ 𝑺𝒃 𝑬𝒄𝒖. 𝟏𝟏

1. Hipótesis nula 𝐻0 : si r = 0 no hay 𝑰𝑪𝒂 = 𝒂 ± 𝒕( 𝒕 = 𝒏 − 𝟐) ∗ 𝑺𝒂 𝑬𝒄𝒖. 𝟏𝟐

correlación
0.9967=0 Tabla 4. Datos estadísticos de la regresión
lineal curva de calibración por el método
2. Hipótesis alterna 𝐻1 : si r ≠ 0 hay adición estándar.
Correlación. ̅
𝒙 8.4
0.9967≠0 ̅
𝒚 1663.6
3. 𝐒𝐱𝐱 131.2
|𝑟| × √𝑛 − 2 4,094× 107
𝑡𝑐𝑎𝑙𝑐𝑢𝑙𝑎𝑑𝑜 = 𝐒𝐲𝐲
√1 − 𝑟 2
|0.9967| × √3 𝐒𝐱𝐲 2,3101× 105
= a 184.53
√1 − (0.9967)2 Sa 80.60
𝑡𝑐𝑎𝑙𝑐𝑢𝑙𝑎𝑑𝑜 =21,3 b 176.08
Sb 8.2
4. 𝑡𝑐𝑟𝑖𝑡𝑖𝑐𝑜 =3.18 R 0.9967
R2 0.9935
5. Decisión: SR 93.8
ICa 184.53±256.3
Si 𝑡𝑐𝑎𝑙𝑐𝑢𝑙𝑎𝑑𝑜 > 𝑡𝑐𝑟𝑖𝑡𝑖𝑐𝑜 rechazo 𝐻0 ICb 176.08±26.07
Si 21,3 > 3.18
Muestra
xo 7.70
En conclusión, existe una relación lineal entre
Sxo 0.6
la señal analítica y la concentración. El método
es lineal I.C 7.70 ± 1.9
LD 1.37
Se aplicaron mínimos cuadrados para expresar LC 4.58
la ecuación de manera correcta.
A partir del método de los mínimos cuadrados, 𝑆𝐶𝑥0
se determina la ecuación de la recta, utilizando 93.8
la ecuación 13. =
176.08
𝑦 ± 𝑆𝑟 = (𝑏 ± 𝑆𝑏 )𝑥0 + (𝑎 ± 𝑆𝑎 ) Ecu. 13 1 1539.71 − 1663.6 2 1
× √ +( )
5 176.08 131.2
Determinación de la concentración de
acetaminofén en la muestra por el método 𝑺𝑪𝒙𝟎 = 𝟎. 𝟔
de patrón externo.
El intervalo de confianza al 95% de confianza
Teniendo en cuenta la ecuación de la curva de con t=3.18, se calculó con la ecuación 16.
calibración por el método de patrón externo y
valor de la absorbancia obtenido en la muestra, 𝐼𝐶 = 𝐶𝑥0 ± 𝑡( 𝑡 = 𝑛 − 2) ∗ 𝑆𝐶𝑥0 𝑬𝒄𝒖. 𝟏𝟔
se calculó la concentración de acetaminofén
mg/L en la muestra y su desviación estándar se 𝐼𝐶 = (7.70 ± 1.9) 𝑚𝑔/𝐿 𝑎𝑐𝑒𝑡𝑎𝑚𝑖𝑛𝑜𝑓é𝑛
utilizó ecuación 14 y 15.
Límite de Detección (Patrón Externo)
A ± 93.8 = (176.08 ± 8.2)mg/L¯¹ (x0 )
+ (184.53 ± 80.60) Utilizando la ecuación17, se determinó el
Límite de Detección (LD).
Donde (A) es el valor de la señal en la muestra
(absorbancia=1539.71), (𝐶𝑥0 ) es la
concentración de acetaminofén en mg/L, (yB + 3Sa ) − a
LD = 𝑬𝒄𝒖. 𝟏𝟕
despejando (𝐶𝑥0 ) se tiene la concentración de m
acetaminofén en la dilución.
Dónde:
A−(a)
Cx0 = b
Ecu. 14
yB = Señal del blanco (intercepto).
Sa= Desviación del intercepto.
1539.71 − (184.53) m = Pendiente de la recta.
𝐶𝑥0 = 𝑚𝑔
176.08 −1
𝐿
𝐶𝑥0 = 7.70 𝑚𝑔/𝐿
(184.53 + 3(80.60)) − 184.53
LD =
La desviación estándar de la concentración del 176.08
analito en la muestra (𝑆𝐶𝑥0 ) se calculó con la
ecuación 15. LD = 1.37𝑚𝑔/𝑙Acetaminofén

𝑺𝑪𝒙𝟎 Límite de Cuantificación (Patrón Externo)

𝟐
𝑺𝒓 𝟏 𝒚𝟎 − 𝒚 𝟏 Utilizando la ecuación18, se determinó el
= ×√ +( ) 𝑬𝒄𝒖. 𝟏𝟓
𝒃 𝒏 𝒃 𝑺𝒙𝒙 Límite de Cuantificación (LC).

(yB + 10Sa ) − a
LC = 𝑬𝒄𝒖. 𝟏𝟖
m
 (184.53 + 10(80.60)) − 184.53
LC = =
176.08 Las columnas de HPLC, las cuales son el
corazón del equipo se caracterizan por
estar empaquedas con micropartículas de
LC = 4.58 𝑚𝑔 Acetaminofén/𝐿 tamaño de entre 2 y 5 µm de diámetro, esto
hace que se necesite una presión
A partir de la concentración de acetaminofén considerable para mantener la elución de
determinada en la muestra 7.70 ± 1.9 mg/L se analito a través de la columna, por lo cual
determinó la concentración de acetaminofén durante mucho tiempo la letra “P” de las
en la muestra expresado en mg de siglas “HPLC” correspondía a la palabra
acetaminofén por tableta.
“pressure” (presión). En el laboratorio se
7,70 𝑚𝑔 𝐴𝑐 25 𝑚𝐿 𝑓𝑖𝑛𝑎𝑙 utilizó una columna tipo C-18, la cual es
× columna rellena con silica gel modificada,
1000 𝑚𝐿 𝑓𝑖𝑛𝑎𝑙 1,0 𝑚𝐿 𝑖𝑛𝑖𝑐𝑖𝑎𝑙
100 𝑚𝐿 𝑖𝑛𝑖𝑐𝑖𝑎𝑙 es decir, está compuesta por una red de
× sílice con 18 carbonos en línea recta siendo
40 𝑚𝑔 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎
556,1 𝑚𝑔 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎 está altamente no polar asumiéndose la
× cromatografía en fase reversa o también
1 𝑡𝑎𝑏𝑙𝑒𝑡𝑎
267,62 ± 0,02 𝑚𝑔 𝐴𝑐𝑒𝑡𝑎𝑚𝑖𝑛𝑜𝑓𝑒𝑛⁄ llamada de interacción hidrofóbica.
= 𝑡𝑎𝑏𝑙𝑒𝑡𝑎

Para determinar el porcentaje de error en la

concentración de acetaminofén en la muestra
patrón externo se tomó el valor teórico el
reportado por la etiqueta utilizando la ecuación
19.

% Error = Figura 2. Composición columna C-18

|Valor real−Valor experimental|
x 100 Ecu. 19
Valor real En cromatografía liquida se utilizan
|500 − 267,62| distintos detectores, pero el más popular y
% Error = x 100 el cual se utilizó en la práctica es un
500
% Error = 46,5 % espectrómetro UV-VIS, ya que
usualmente las sustancias que se analizan
Análisis de resultados por este método son sustancias que no son
estables a temperaturas altas como lo son
Entre las técnicas cromatografías, la muchas sustancias orgánicas, que en
cromatografía liquida de alta eficacia general tienen grupos o enlaces
(HPLC) se caracteriza por ocupar una fase cromoforos, es decir que poseen la
móvil en estado líquido, este hecho en particularidad de absorber y emitir a
particular se destaca, ya que se pueden longitudes de onda específicas en general
realizar fases móviles muy elaboradas que en la región del UV, específicamente,
aportan mucha selectividad y resolución al gracias a las transiciones electrónicas entre
análisis. Además, que a lo largo del tiempo π a π* o n- π* como lo hacen los enlaces π
se ha miniaturizado el experimento presentes en los enlaces C=C y C=O de la
(nanocromatografía), pudiéndose molécula en este caso de acetaminofén. [2]
combinar con otras técnicas
instrumentales como el espectrómetro
masas. [1].

Figura 3. Estructura del acetaminofén.
El cromatógrafo utilizado, modelo HP
1100 marca Hewlett Packard, operaba con
un detector de UV a una longitud de onda
de 273 nm y una fase móvil metanol-agua
(50:50). La columna C-18 utilizada es de
carácter no polar, por ende, pasaran a
través de la columna primero los
componentes polares por poca interacción
con la columna, como los excipientes de la
pastilla, los cuales son almidón
pregelatinizado, polividona y ácido
esteárico.
En la práctica determino una cantidad de
267,3 mg acetaminofén por tableta, con un
error del 46,5%, atribuyéndose
principalmente a la preparación de las
muestras y a errores de los analistas al
inyectar, ya que aun obteniéndose un
límite de detección (LD) de 1.3731 mg /L,
el cual está por debajo del primer estándar
de la curva de calibración, los intervalos de
confianza son bastante amplios y el límite
de cuantificación está en la curva,
haciendo que esta poco confiable.
Conclusiones
 Antes de inyectar los solventes al
equipo es importante filtrarlos,
debido a que pueden contener
partículas disueltas que pueden
dañar el instrumento.
 Se debe tener especial cuidado al
preparar las soluciones, fíltralas, de
gasificarlas e inyectarlas en el
cromatógrafo.
 La cromatografía liquida es un
método muy versátil, ya que cuenta
con diferentes variables que
pueden adaptarse al analito.
Preguntas
Porque la cuantificación en HPLC con
curva de calibración de patrón externo
es precisa mientras que en
cromatografía gaseosa es recomendable
usar una curva de calibración por
patrón interno.
Al utilizar el método de patrón externo, la
fuente de error más importante en los
análisis es por lo regular la incertidumbre
en el volumen de la muestra; a veces, la
velocidad de inyección de la muestra es
también un factor por considerar. A
menudo, las muestras son pequeñas
(~1μL) y la incertidumbre asociada con la
inyección de un volumen reproducible de
este tamaño con una microjeringa puede
alcanzar cierto porcentaje relativo, tal vez
de varias unidades. La situación es más
difícil en la cromatografía de gases porque
la muestra se ha de inyectar en una vía de
acceso para la muestra, la cual está
caliente; en este caso, la evaporación en el
extremo de la aguja puede conducir a una
gran variación del volumen inyectado. Los
errores relativos en el volumen de muestra
se pueden reducir a un 1 o 2% usando
tomadores de muestra automáticos o una
válvula rotatoria para la muestra.
La mayor precisión en cromatografía
cuantitativa se consigue con el uso de
patrones internos debido a que se evitan las
incertidumbres asociadas a la inyección de
la muestra. En este procedimiento se
introduce en cada patrón y en la muestra
una cantidad cuidadosamente medida de
una sustancia patrón interno, y la relación
del analito con las áreas (o alturas) del pico
del patrón interno sirve como variable
analítica. Para que este método sea
satisfactorio, es necesario que el pico del
patrón interno este bien separado de los
picos de los demás componentes de la
muestra (Rs > 1.25); por otra parte, el pico
del patrón interno debería aparecer cerca
del pico del analito. Con un patrón interno
adecuado, se pueden conseguir precisiones
relativas mejores que uno por ciento. [2]

Referencias

[1] Rouessac, F., Rouessac, A., & Cuadros

Rodríguez, L. (2003). Análisis químico:
métodos y técnicas instrumentales
modernas. Pág 57.

[2] Skoog, D. A., Holler, F. J., & Nieman,

T. A. (2008). Principios de análisis
instrumental. Pág. 369, 783.

Freund, J. E., Miller, I., & Miller, M.

(2000). Estadística Matemáticas con
Aplicaciones. Pearson educación.