Pta-Mic 003 Recuento de Coliformes Totales 09-07

LABORATORIO MICROBIOLÓGICO ORTIZ
Código: PTA-MIC 003

MARTINEZ Fecha: 2021/07/07
ÁREA MICROBIOLOGÍA. Versión: 13
Página 1 de 10
MÉTODO HORIZONTAL PARA LA ENUMERACIÓN DE COLIFORMES –TÉCNICA
RECUENTO EN PLACA
TÍTULO: MÉTODO HORIZONTAL PARA LA ENUMERACIÓN DE COLIFORMES –
TÉCNICA RECUENTO EN PLACA
CÓDIGO: PTA-MIC 003
VERSIÓN: 13
ELABORADO POR: LIESSEL FECHA: 20213/06/

Analista Profesional de
Microbiología Junior
REVISADO POR: SHIRLEY MARTINEZ ACOSTA FECHA: 20213/06/

Jefe de Microbiología Área Interna
SHIRLEY MARTINEZ ACOSTA

APROBADO POR: FECHA: 20213/06/
Jefe de Microbiología Área Interna
Página 2 de 10
RECUENTO EN PLACA
CONTROL DE CAMBIOS
Fecha Motivo y Tipo de

Versión Responsable Aprobado
A M D Modificación
Jefe de Área
2009 10 20 03 Adición control de cambios Director Técnico
Microbiología
Cambio versión ISO 9000 de Jefe de Área
2009 12 21 04 Director Técnico
versión 2000 a versión 2008 Microbiología
Cambio Ltda a S.A.S y
Jefe de Área
2012 02 23 05 Cambio del nombre de Gerente Técnico
Microbiología
algunos cargos.
Cambia el objetivo
Se incluye alcance, técnica,
método.
Se incluye y actualiza los
Profesional de
equipos utilizados para la
investigación,
2014 02 24 06 realización de los ensayos. Gerente Técnico
desarrollo y aguas
Modificación de acuerdo al
residuales
PCD – 001.
Se modifica y actualiza el
método en base a la NTC –
4458.
Subcoordinadora
2015 09 14 07 Se actualizan los cargos. Gerente Técnico
área microbiología
Se agrega el numeral control
analítico y se agrega el Profesional de
formato FMIC050A-01 investigación,
2016 02 01 08 Gerente Técnico
Registro de datos primarios desarrollo y aguas
recuento de Coliformes residuales
Totales y E. Coli.
Profesional de
Se referencia la metodología
investigación,
2016 06 29 09 ISO 4832 para el recuento de Gerente Técnico
desarrollo y aguas
Coliformes totales
residuales
Profesional de
Se establecen criterios para investigación,
el análisis de duplicados. desarrollo y aguas
residuales
Se modifica el formato FIMIC
050A-01 y el procedimiento Coordinador de
para la confirmación de los Calidad y Aguas
Coliformes totales de acuerdo Residuales área
a lo establecido en la ISO de Microbiología
4832
2019 10 17 12 Se Actualizan los cargos. Jefe de Gerente Técnico
Se enumera todo el Microbiología Área
procedimiento. Interna
Se actualiza código del
Página 3 de 10
RECUENTO EN PLACA
documento. Jefe de Área

Microbiología Gerente
Técnico.
Se actualiza el logo. Se Analista Jefe de
coloca como responsable en Profesional de Microbiología Área
2021 07 07 13
el ítem 5, al jefe de Microbiología
Microbiología Área Interna. Junior Interna
Analista Jefe de
Se actualiza el titulo ítem 1. Profesional de Microbiología Área
2023 04 11 14
OBJETIVOS y 2. ALCANCE Microbiología
Junior Interna
Analista Jefe de
Se adiciona el ítem 7.
Profesional de Microbiología Área
2023 04 11 15 TÉRMINOS Y
Microbiología
DEFINICIONES Interna
Junior
Analista Jefe de
Se ingresaron equipos al ítem Profesional de Microbiología Área
2023 04 11 16
8.3 EQUIPOS Microbiología
Junior Interna
Analista Jefe de
Se adiciona el ítem 9.2. Profesional de Microbiología Área
2023 04 11 17
RECUENTO DE COLONIAS Microbiología
Junior Interna
Analista Jefe de
Se adiciono el ítem 10.
2023 04 11 18 EXPRESIÓN DE LOS
Microbiología
RESULTADOS Interna
Junior
Analista Jefe de
Se adiciona el ítem 11. Profesional de Microbiología Área
2023 04 11 19
MÉTODO DE CALCULO Microbiología
Junior Interna
Analista Jefe de
Se modifico el ítem 12. Profesional de Microbiología Área
2023 04 11 20
CONTROLES ANALÍTICOS Microbiología
Junior Interna
Analista Jefe de
Se modifico el ítem 13.
2023 04 11 21 REPORTE DE
Microbiología
RESULTADOS Interna
Junior
Página 4 de 10
RECUENTO EN PLACA
1. OBJETIVO: determinar las directrices generales para el recuento de Coliformes totales, presentes
en productos para el consumo humano o para alimentación de animales, por medio de la técnica de
recuento de colonias en un medio solido cromogénico o flourogénico.
2. ALCANCE: este procedimiento es aplicable a productos destinados al consumo humano y a la

alimentación de los animales, muestras ambientales en el área de producción y manipulación de
alimentos donde se requiera la enumeración de Coliformes.
3. REFERENCIA NORMATIVA: ISO 4832:2006 Microbiología de alimentos y piensos para animales -

Método horizontal para la enumeración de Coliformes - Técnica de recuento de colonias.
4. TÉCNICA: técnica de recuento en placa.
5. RESPONSABLES: Jefe de Microbiología Área Interna
6. GRUPO DE TRABAJO: Analista Profesional de Microbiología Senior, Analista Profesional de

Microbiología Junior y Técnicos de laboratorio.
7. TERMINOS Y DEFINICIONES
7.1 Coliformes Totales: bacterias que crecen a temperatura especifica de 30°C o 37°C, forman
colonias características en agar cristal violeta, rojo neutro, bilis y lactosa y que a la prueba de la
confirmación fermentan de lactosa con producción de gas.
Grupo de bacterias que presentan ciertas características bioquímicas en común e importancia relevante
como indicadores de contaminación en agua y alimentos. Se encuentran común mente en las plantas,
suelo y los animales, incluyendo a los humanos. El grupo Coliforme está conformado por los siguientes
géneros tales como: Escherichia spp, Enterobacter spp, Citrobacter spp y Klebsiella spp, entre otros.
7.2. Escherichia coli: Bacilo corto Gram negativo que forma parte de la flora normal de intestino de
animales de sangre caliente. Es aerobio facultativo, de metabolismo fermentativo, O-Nitrofenli- β-D-
galactopiranósido positivo y su crecimiento optimo es a 37°C. Algunas cepas pueden producir
enterotoxinas y tiene otros factores de virulencia de colonización e invasión por lo cual pueden causar
infecciones asociadas a la atención en salud.
8. MEDIOS DE CULTIVOS, REACTIVOS, EQUIPOS Y MATERIALES
8.2. Medios de cultivos
8.2.1. Agar VRBL

8.2.2. Caldo Brilla
8.2.3. Agua peptonada Tamponada
8.3. Reactivos: N.A.
8.4. Equipos
8.4.1. Incubadora a 37 ºC +/-1 ºC.

8.4.2. Incubadora a 30 ºC ± 1ºC.
8.4.3. Cabina de flujo laminar.
Página 5 de 10
RECUENTO EN PLACA
8.4.4. Vórtex.
8.4.5. Micropipeta 1000 μl.
8.4.6. Micropipeta 100 μl – 1000 μl.
8.4.7. Balanza capacidad 4.000 gr.
8.4.8. Stomacher.
8.4.9. Nevera 0 ºC -8 ºC.
8.4.10. Cuenta colonias
8.5. Materiales
8.5.1. Lo necesario para la preparación y dilución de los homogenizados de alimentos.

8.5.2. Cajas de petri estériles
8.5.3. Pipetas de 1, 5 y 10 ml estériles
9. DESARROLLO DEL PROCEDIMIENTO:
9.2. Procedimiento de análisis.

9.2.1. Preparar la muestra y las diluciones de los homogeneizados como se describe en el
procedimiento PTT-MIC 003.
9.2.2. Se toman dos cajas de petri estériles. Usando una pipeta estéril, se transfiere a cada caja 1
mL de la muestra de ensayo, si el producto es líquido o 1 mL de la suspensión inicial en el
caso de otros productos ver procedimiento MIC -044.
9.2.3. Se toman otras dos cajas de petri estériles. Usando otra pipeta estéril, se transfiere a cada
caja 1 mL de la primera dilución decimal (10 -1) de la muestra de ensayo, si el producto es
líquido o 1 mL de la primera dilución decimal (10 -2) de la suspensión inicial en el caso de otros
productos.
9.2.4. Se repite el procedimiento descrito con las diluciones adicionales, usando una pipeta estéril
para cada dilución decimal.
9.2.5. Se vierten 15 mL del medio de cultivo que se encuentre a temperatura (44 °C a 47°C), en
cada caja de Petri. El tiempo transcurrido entre el final de la preparación de la suspensión
inicial (o de la dilución 10-1 si el producto es líquido) y el momento en que el medio se vierte en
las cajas no debe ser mayor de 20 minutos.
9.2.6. Cuidadosamente se mezcla el inóculo con el medio y se deja solidificar la mezcla, estando las
cajas de petri sobre una superficie horizontal fría.
9.2.7. Preparar también una placa de control con 15 mL del medio para comprobar su esterilidad.
9.2.8. Después de solidificar las placas, vierta aproximadamente de 4 mL del medio VRBL que se
encuentre a temperatura (44°C a 47°C) sobre la superficie del medio inoculado y dejar
solidificar por completo. Después de que se complete la solidificación, se vierten
aproximadamente 4 ml de medio de cultivo que cubra la superficie a 45 °C 2 °C, sobre la
superficie del medio inoculado. Se deja solidificar como se describió anteriormente. Se
pretende dejar una doble capa para visualizar mejor las colonias.
9.2.9. Invierta las cajas preparadas e incube a (30 °C 1 °C si son productos lácteos y derivados
lácteos) durante 24 h 2 h y a 37°C +/- 1 durante 24 horas +/- 2 horas (según lo acordado).
9.2.10. Si el objeto del análisis es solo la determinación de E. coli, para una mejor recuperación de
bacterias injuriadas, incubar a 35 °C 1 °C (si son productos lácteos i incubar a 30 °C 1 °C)
las primeras 4 horas y después incubar a 44 °C 1 °C por 18 h a 20 h.
9.3. Recuento de colonias
Después del periodo de tiempo de incubación especificado, seleccione las placas de petri si es
posible 10 o más colonias y menos de 150 colonias, utilizando el equipo cuenta colonias, las colonias
Página 6 de 10
RECUENTO EN PLACA
de color rojo purpura con un diámetro de al menos 0,5 mm (a veces rodeadas por una zona rojiza de
bilis precipitada).
Estas se consideran colonias típicas de coliformes totales y no requieren de confirmación adicional.
Después del período especificado de incubación, se seleccionan las cajas que tengan no más de 150
colonias (por encima de este número existe el riesgo que las colonias coliformes tengan una
apariencia atípica) cuente las colonias de coliformes típicas y no tipias utilizando el equipo para el
recuento de colonias.
Cuente las colonias atípicas y todas las colonias derivadas de productos lácteos que tengan
características similares a los coliformes típicos y confirme el número de colonias por fermentación de
la lactosa.
El número de coliformes por mililitro o por gramo de muestra se calcula a partir del número de
colonias características obtenidas. (Ver ISO7218).
Después del periodo de incubación se debe registrar la morfología de acuerdo a los medios de cultivo
utilizados.
Mediante la utilización de una lámpara de fluorescencia 360 nm a 366 nm, hacer la lectura de las
bacterias E.coli fluorescencia positiva
Confirmación de Coliformes totales: inocule 5 colonias de cada tipo de colonias atípicas, si están
disponibles, en tubos de caldo brilla con campana de Durham e incube a 30 °C o 37ºC (según lo
acordado) durante 24+/- 2 horas. Se consideran Coliformes totales los tubos que presenten gas en
las campanas de Durham.
Realizar el recuento de acuerdo a lo establecido anteriormente en este procedimiento. Mediante la
utilización de una lámpara de fluorescencia de 360 nm a 366 nm hacer la lectura de las bacterias E.
coli fluorescencia positiva. Si la fluorescencia es cuestionable incubar por un periodo adicional de 4 h
para la prueba con ONPG y hasta por un periodo adicional de 20 h para verificar la fluorescencia
intensificada como prueba de resultado positivo.
10. EXPRESIÓN DE LOS RESULTADOS
Ver ISO7218-
Los métodos de cálculo indicados a continuación corresponden a los casos que se presentan con
mayor frecuencia cuando los análisis se realizan siguiendo unas buenas prácticas de laboratorio.
Ocasionalmente, pueden producirse excepciones (por ejemplo, que los factores de dilución de dos
diluciones consecutivas sean diferentes), por lo que resulta necesario que los resultados del
recuento sean examinados e interpretados por un microbiólogo calificado, y en su caso, rechazados.
Después del periodo especifico de incubación, realizar el conteo de coliforme incluyendo la E.coli y
expresar independiente el conteo de bacterias coliformes del conteo de bacterias E.coli.
Glucoronidasas positivas, utilizando el equipo para el recuento de colonias.
10.1. E. coli medio fluorogenico
Examinar las cajas de Petri usando una lámpara de UV ultravioleta.
La presencia de fluorescencia es una prueba positiva para E. coli.
Si la fluorescencia es cuestionable incubar por un periodo adicional de 4 horas y hasta por un periodo
adicional de 20 horas para verificar la fluorescencia intensificada como prueba de resultado positivo.
Página 7 de 10
RECUENTO EN PLACA
11. MÉTODO DE CALCULO
11.1. Caso general
Para que un resultado sea válido, se suele considerar necesario que el recuento de colonias que se
realice al menos en una placa que contenga un mínimo de 10 colonias típicas o colonias que
cumplan los criterios de identificación.
El número de microorganismos N presentes en la muestra para análisis se calcula como la media

corregida de dos diluciones consecutivas, utilizando la ecuación:
donde
C
V es el volumen de inóculo utilizado en cada placa, en mililitros;

d es la dilución correspondiente a la primera dilución escogida [d = 1 cuando se utiliza
en el producto líquido sin diluir (para muestras líquidas)].
El resultado calculado se redondea a dos cifras significativas. Cuando se realiza esta

operación, si la tercera cifra es inferior a 5, no se modifica la cifra anterior; si la tercera cifra
es igual o superior a 5, la cifra anterior se incrementa en una unidad.
Preferiblemente, el resultado se expresa como un número entre 1,0 y 9,9 multiplicado por la
potencia de 10 adecuada, o como un número entero con dos cifras significativas.
El resultado se expresa como número de microorganismos N por mililitro (para los productos
líquidos) o por gramo (para el resto de productos).
 EJEMPLO El recuento ha proporcionado los siguientes resultados:
 Para la primera dilución escogida (10-2): 168 colonias;
 Para la segunda dilución escogida (10-3): 14 colonias;
Redondeando el resultado como se indicó anteriormente, el número de microorganismos es de 17 000 o 1,7  10 4 por mililitro o por gramos de producto.
Página 8 de 10
RECUENTO EN PLACA
es la suma de las colonias contadas en las dos placas escogidas de las dos diluciones
consecutivas, de la cuales al menos una contiene un mínimo de 10 colonias;
Cajas que contengan entre 15 colonias y 150 colonias características.
Se seleccionan las cajas que contengas no más de 150 colonias características en dos diluciones
consecutivas. Es necesario que una de estas cajas contengas por lo menos 15 colonias
características.
Se calcula el numero N de colonias por mililitro o por gramo de producto, dependiendo del caso,
utilizando la siguiente ecuación:
En donde,
∑c = Es la suma de colonias contadas en todas las cajas retenidas.
n1 = Es el número de cajas seleccionadas en la primera dilución.
n2 = Es el número de cajas seleccionadas en la segunda dilución.
d = Es el factor de dilución correspondiente a la primera dilución.
Se redondea el resultado calculado con dos cifras significativas
Se toma como resultado el número de unidades formadoras de colonias, UFC/mL o UFC/g de

producto, expresado como un numero entre 1,0 y 9,9 multiplicando por 10 x donde X es la potencia
apropiada de 10.
EJEMPLO Un recuento de coliformes dio los siguientes resultados
- En la primera dilución seleccionada (10-2): 83 y 97 colonias

- En la segunda dilución seleccionada (10-3): 13 y 8 colonias
Al redondear el resultado como se indicó antes, se obtiene 9 x 10 0 ó 9,1 x 103 UFC/ mL o UFC/g de
producto.
Página 9 de 10
RECUENTO EN PLACA
11.2. CASO EN EL QUE CADA CAJA CONTIENE MENOS DE 15 COLONIAS CARACTERÍSTICAS
Si cada una de las cajas seleccionadas, contiene menos de 15 colonias características, se calcula el
número estimado NE de coliformes usando la ecuación presentada en el numeral 11.1.
EJEMPLO Un recuento de colonias de coliformes dio los siguientes resultados:
- En una dilución 10-4: 140 y 145 colonias, de las cuales 5 y 3 Respectivamente fueron
características.
- En una dilución 10-5: 11 y 8 colonias, de las cuales 0 y 1 respectivamente fueron características.
11.3. ESTIMACIÓN DE NUMERO PEQUEÑOS
Si las dos cajas, correspondiente a la muestra de ensayo (Productos líquidos) o a la suspensión inicial
(otros productos) contienen menos de 15 colonias características, los resultados se reportan así:
- <15 UFC/mL (Productos líquidos)

- <15 x 1/d UFC/g (otros productos), en donde d es el factor de dilución de la suspensión inicial.
11.4. COLONIAS NO CARACTERÍSTICAS
Si dos cajas correspondientes a la muestra de ensayo (productos líquidos) a la suspensión inicial

(otros productos) no contienen colonias características, informa el resultado como a continuación:
- <1 UFC /mL (Productos líquidos)

- <1 x 1/d UFC/g (Otros productos), en donde d es el factor de dilución de la suspensión inicial.
12. CONTROLES ANALÍTICOS
12.1.1. Hacer control de esterilidad del medio de cultivo, incubando una caja con 15 mL
aproximadamente del medio de cultivo seleccionado. tubo que contenga Agar utilizado para la
siembra.
12.1.2. Realizar control de esterilidad al agua Peptonada Tamponada, inoculando 1 mL del agua
peptonada tamponada con agar Plate Count por profundidad. incubando una caja que contenga
1 mL de agua Peptonada y Agar Plate Count.
12.1.3. Los resultados de los duplicados con valores de <10 y Mayor que, no serán tenidos en
cuenta para la carta control de los análisis de la precisión entre analistas.
12.1.4. La aceptabilidad o el rechazo de los resultados expresados en los duplicados serán
avalados de acuerdo al criterio de precisión establecido en la verificación del método. Se tendrá
en cuenta como variabilidad excesiva y desviación de los duplicados cuando no cumplan con el
criterio de precisión establecido en un 30% de los últimos 20 ensayos registrados, en estos
casos se realiza un análisis de reproducibilidad entre analistas y se recalcula el criterio de
precisión del método.
Página 10 de 10
RECUENTO EN PLACA
12.1.5. Se realizará un control positivo y negativo con cepas de referencias para cada lote de
medio utilizado durante la siembra de las muestras y será registrado en el formato FAMIC00A-
01 Registro de resultados datos recuento de Coliformes Totales y E. Coli.
13. REPORTE DE RESULTADOS
Los resultados obtenidos de los ensayos microbiológicos de Coliformes Totales y E.Coli serán
reportados en el sistema SAMPLER por la analista a cargo del reporte de resultados.

Pta-Mic 003 Recuento de Coliformes Totales 09-07

Cargado por

Información del documento

Título original

Derechos de autor

Formatos disponibles

Compartir este documento

Compartir o incrustar documentos

Opciones para compartir

¿Le pareció útil este documento?

¿Este contenido es inapropiado?

Copyright:

Formatos disponibles

Pta-Mic 003 Recuento de Coliformes Totales 09-07

Cargado por

Copyright:

Formatos disponibles

LABORATORIO MICROBIOLÓGICO ORTIZ

Código: PTA-MIC 003

MÉTODO HORIZONTAL PARA LA ENUMERACIÓN DE COLIFORMES –TÉCNICA

TÍTULO: MÉTODO HORIZONTAL PARA LA ENUMERACIÓN DE COLIFORMES –

TÉCNICA RECUENTO EN PLACA

CÓDIGO: PTA-MIC 003

ELABORADO POR: LIESSEL FECHA: 20213/06/

REVISADO POR: SHIRLEY MARTINEZ ACOSTA FECHA: 20213/06/

SHIRLEY MARTINEZ ACOSTA

MÉTODO HORIZONTAL PARA LA ENUMERACIÓN DE COLIFORMES –TÉCNICA

Fecha Motivo y Tipo de

MÉTODO HORIZONTAL PARA LA ENUMERACIÓN DE COLIFORMES –TÉCNICA

documento. Jefe de Área

MÉTODO HORIZONTAL PARA LA ENUMERACIÓN DE COLIFORMES –TÉCNICA

2. ALCANCE: este procedimiento es aplicable a productos destinados al consumo humano y a la

3. REFERENCIA NORMATIVA: ISO 4832:2006 Microbiología de alimentos y piensos para animales -

4. TÉCNICA: técnica de recuento en placa.

5. RESPONSABLES: Jefe de Microbiología Área Interna

6. GRUPO DE TRABAJO: Analista Profesional de Microbiología Senior, Analista Profesional de

8. MEDIOS DE CULTIVOS, REACTIVOS, EQUIPOS Y MATERIALES

8.2. Medios de cultivos

8.2.1. Agar VRBL

8.3. Reactivos: N.A.

8.4.1. Incubadora a 37 ºC +/-1 ºC.

MÉTODO HORIZONTAL PARA LA ENUMERACIÓN DE COLIFORMES –TÉCNICA

8.5.1. Lo necesario para la preparación y dilución de los homogenizados de alimentos.

9. DESARROLLO DEL PROCEDIMIENTO:

9.2. Procedimiento de análisis.

9.3. Recuento de colonias

MÉTODO HORIZONTAL PARA LA ENUMERACIÓN DE COLIFORMES –TÉCNICA

10. EXPRESIÓN DE LOS RESULTADOS

10.1. E. coli medio fluorogenico

Examinar las cajas de Petri usando una lámpara de UV ultravioleta.

La presencia de fluorescencia es una prueba positiva para E. coli.

MÉTODO HORIZONTAL PARA LA ENUMERACIÓN DE COLIFORMES –TÉCNICA

11. MÉTODO DE CALCULO

11.1. Caso general

El número de microorganismos N presentes en la muestra para análisis se calcula como la media

V es el volumen de inóculo utilizado en cada placa, en mililitros;

El resultado calculado se redondea a dos cifras significativas. Cuando se realiza esta

 Para la primera dilución escogida (10-2): 168 colonias;

 Para la segunda dilución escogida (10-3): 14 colonias;

MÉTODO HORIZONTAL PARA LA ENUMERACIÓN DE COLIFORMES –TÉCNICA

Cajas que contengan entre 15 colonias y 150 colonias características.

∑c = Es la suma de colonias contadas en todas las cajas retenidas.

n1 = Es el número de cajas seleccionadas en la primera dilución.

n2 = Es el número de cajas seleccionadas en la segunda dilución.

d = Es el factor de dilución correspondiente a la primera dilución.

Se redondea el resultado calculado con dos cifras significativas

Se toma como resultado el número de unidades formadoras de colonias, UFC/mL o UFC/g de

EJEMPLO Un recuento de coliformes dio los siguientes resultados

- En la primera dilución seleccionada (10-2): 83 y 97 colonias

MÉTODO HORIZONTAL PARA LA ENUMERACIÓN DE COLIFORMES –TÉCNICA

11.2. CASO EN EL QUE CADA CAJA CONTIENE MENOS DE 15 COLONIAS CARACTERÍSTICAS

EJEMPLO Un recuento de colonias de coliformes dio los siguientes resultados:

11.3. ESTIMACIÓN DE NUMERO PEQUEÑOS

- <15 UFC/mL (Productos líquidos)

11.4. COLONIAS NO CARACTERÍSTICAS

Si dos cajas correspondientes a la muestra de ensayo (productos líquidos) a la suspensión inicial

- <1 UFC /mL (Productos líquidos)

12. CONTROLES ANALÍTICOS

MÉTODO HORIZONTAL PARA LA ENUMERACIÓN DE COLIFORMES –TÉCNICA

13. REPORTE DE RESULTADOS