Guía Trabajos Prácticos Biología Celular I. 1sem 2022

TRABAJOS PRÁCTICOS
BIOLOGÍA CELULAR I
CARRERA DE BIOQUÍMICA
Profesoras:
Dra. Sophía Mejías

Dra. Denise Riquelme
Dra. Deborah Vargas
1er Semestre 2022
Coordinadora Dr. María Pertusa

NORMAS Y EVALUACIÓN
La asistencia al laboratorio es obligatoria, si no asiste, debe presentar un justificativo

apropiado (certificado médico o de asistente social), en los tiempos oportunos, y por los
canales determinados por la universidad. Inasistencias no justificadas son causal de
reprobación de los trabajos prácticos.
1. Si justificadamente no asiste un práctico, debe contactarse inmediatamente con el

profesor a cargo. De no poder recuperarse la instancia, al final de semestre deberá
presentarse a un examen escrito donde se le interrogará sobre el contenido del
práctico no realizado.
2. Deberá respetar el horario de ingreso a las actividades de laboratorio, si llega
después de 15 minutos del horario del laboratorio no podrá ingresar y deberá
presentar justificativo.
3. Toda actividad práctica lleva asociado un informe de las actividades realizadas. El
cual deberá ser entregado al inicio de la actividad práctica siguiente. Retrasos en su
entrega llevarán un descuento en la nota obtenida.
4. Para aprobar el laboratorio el promedio de las presentaciones e informes deberá
tener una nota ≥ 4,0 por separado.
5. En caso de no cumplir con este requisito deberá presentarse a un examen escrito
que abarcará todo el contenido de los laboratorios.
6. Para aprobar el ramo el laboratorio debe ser aprobado con una nota ≥ 4.0
Las evaluaciones a realizar en laboratorio y sus respectivas ponderaciones son:
Presentación Oral Asincrónica 20%

Presentación Oral Sincrónica 20%
Informes (evaluado por el profesor a cargo): 50%
Trabajo Colaborativo (evaluado por los compañeros del grupo): 10%
La nota del laboratorio corresponde a un 30% de la nota final del ramo.

Cátedra: 70%
Laboratorio: 30%
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CALENDARIO DE ACTIVIDADES
Grupo A: Denise Riquelme Lunes 9:40-12:00

Grupo B: Sophia Mejías Viernes 8:00-10:20
Grupo C: Deborah Vargas Viernes 10:30-12:50
Grupo D: Denise Riquelme Lunes 9:40-12:00
Grupo E: Sophia Mejías Viernes 8:00-10:20
Grupo F: Deborah Vargas Viernes 10:30-12:50
Grupo A
Actividad Fecha
Práctico Introducción 28 de marzo
Práctico 1. Biomoléculas 4 de abril
Práctico 2. Microscopía 18 de abril
Práctico 3. Mitocondrias 2 de mayo
Práctico 4. Citoesqueleto 16 de mayo
Práctico 5. Ósmosis 30 de mayo
Práctico 6. Ruta Secretora 13 de junio
Grupo B- Grupo C
Actividad Fecha
Práctico Introducción 1 de abril
Práctico 5. Ósmosis 10 de junio
Grupo D
Actividad Fecha
Práctico Introducción 28 de marzo
Grupo E-Grupo F
Actividad Fecha
Práctico Introducción 1 de abril
Práctico 2. Microscopía 6 de mayo
Práctico 4. Citoesqueleto 3 de junio
Práctico 6. Ruta Secretora 1 de julio
3
Pauta para la confección de informes de laboratorio de Biología Celular
El informe de laboratorio es un reporte detallado y claro de los experimentos realizados

durante el trabajo práctico. Se usa para describir los procedimientos seguidos, los datos
obtenidos, y posteriormente analizar estos resultados en base al marco teórico y los
objetivos planteados.
En general, el informe debe:

I. Ser escrito en tamaño carta (no se aceptarán informes en tamaño oficio), utilizando
letra Arial o Times New Roman de tamaño 11, con espacio 1.5, márgenes
predeterminados, paginas numeradas y justificado.
II. Ser escrito en pretérito indefinido, en tercera persona singular, impersonal, y en
correcto castellano, es decir, con la adecuada redacción, sintaxis, puntuación y
ortografía.
III. Deberán ser entregados una semana después de la realización del práctico.
IV. El informe debe contener las siguientes secciones:
1. Portada
2. Introducción (Marco teórico)
3. Objetivos
4. Materiales y Métodos
5. Resultados:
a. Datos y/o observaciones
b. Gráficos y sus descripciones
c. Cálculos y resultados
6. Discusión
7. Conclusiones
8. Bibliografía
Las copias textuales de cualquier tipo de fuente serán motivo de reprobación del informe.
A continuación, se detalla cada ítem.
1. Portada:
Corresponde a la primera página y debe contener el nombre de la institución y
logotipo, la carrera, el ramo al cual corresponde el práctico, el título, los autores, la
fecha de entrega, y el profesor a cargo.
2. Introducción
Debe ser breve y entregar la información que se encuentra en la literatura sobre el
tema en estudio, comenzando desde lo general y finalizando con lo específico según
4
el objetivo del laboratorio. En ella se espera encontrar el marco teórico suficiente para
exponer la pregunta abordada en el práctico, y su relevancia dentro del campo de la
biología celular, y en base a esta información, poder describir y discutir los resultados
obtenidos. La redacción debe ocupar oraciones claras, escritas con sus propias
palabras, y de ninguna forma debe ser una copia fiel y exacta de libros, guías,
artículos o páginas de internet o revistas. El texto deberá incluir la fuente de donde se
obtiene la información. (Máximo 1 página)
3. Objetivos (General y específicos)

La guía de cada uno de los prácticos llevará explícito el objetivo general, que deberá
ser mencionado de igual manera en el informe. Además, el informe debe contener los
objetivos específicos desarrollados durante el práctico que permitieron el
cumplimiento del objetivo general. En caso de que sea pertinente, deberán
distinguirse aquellos objetivos experimentales de los operacionales. (Máximo 1/2
pagina).
4. Metodología/Materiales y métodos
Esta sección debe ser un fiel relato de las actividades que cada grupo realizó durante
el práctico, y suponer una transcripción del cuaderno de laboratorio donde se detallan
soluciones, volúmenes, pesos, tiempos de incubación, u otros utilizados en cada uno
de los procedimientos.
Puede, además, utilizar diagramas de flujo o describir en forma narrativa lo que se
realizó en el laboratorio. Deberá detallar los reactivos específicos y los equipos
utilizados, estos últimos con su debida marca de fabricante, modelo y ciudad de
origen, por ejemplo “se utilizó un espectrofotómetro UV-Visible (Agilent 7453, Palo
Alto, CA, EUA)”. Sin embargo, considere que materiales de uso común como
micropipetas, puntas, tubos, matraces y vasos no deben ser explícitamente
nombrados, ni se debe indicar su marca, ni modelo (Máximo 1 página).
5. Resultados
Los resultados de cada una de las actividades planteadas por la guía deberán ser
detallados por escrito, e individualizados por subtítulos. En el caso de que
complemente esa información con imágenes (digitales o dibujadas), debe recordar
que éstas son un apoyo de lo que en el texto se describa, pero no se considerarán
válidas como único reporte. En caso de que sea pertinente, se deben mostrar todas
las mediciones experimentales y los cálculos obtenidos durante el trabajo práctico.
Cada resultado se debe presentar de manera precisa y ordenada, y en caso
requerido deberá elaborar tablas o gráficos, siempre acompañadas de párrafos
explicativos que incluyan los detalles de las observaciones realizadas en cada
experimento. Para elaborar estos textos apóyese en las preguntas que aparecen en
la sección “Procedimiento experimental” de las guías.
Las tablas, imágenes o gráficos deberán contener un “pie de figura” con título y la
descripción de la imagen mostrada, por ejemplo, para una imagen al microscopio
debe indicar el objetivo utilizado, el aumento alcanzado e indicar brevemente lo
observado. Tanto las figuras, ya sean imágenes, gráficos o tablas deben poseer un
número único (para todo el informe) y correlativo en su rótulo, que las individualice
inequívocamente (“Tabla1” o “Figura 1”). Las tablas deben llevar el número y título
sobre ésta y las figuras, bajo éstas. En esta sección sólo se deben informar los
resultados, el análisis y discusión de éstos no debe estar incluida en este ítem.
(Máximo 4 hojas)
5
6. Discusión.
En la discusión de resultados se debe incluir el análisis de los experimentos llevados
a cabo, realizando una interpretación biológica de cada resultado. Se deberá,
además, comparar los datos obtenidos con lo descrito en la bibliografía y se debe
citar la fuente de donde se obtiene la información. También se debe aprovechar esta
sección para describir resultados inesperados y posibles razones por las cuales se
obtuvieron dichos resultados. Se puede incluir cualquier error en los datos, y discutir
las razones por las que estos podrían ser erróneos y comentar los cambios que se
podrían introducir en el protocolo para mejorar el resultado en base al objetivo del
práctico. Para ayudarle en la elaboración de la discusión, la guía contendrá
reflexiones y preguntas que deberán ser abordadas en esta sección. (Máximo 2
páginas)
7. Conclusiones.
Se debe escribir en forma resumida y en base a los resultados obtenidos que se
deduce de cada objetivo planteado y que se concluye del trabajo experimental
realizado. Puede ser un párrafo en narrativa o bien un punteo. (Máximo 1/2 pagina)
8. Bibliografía.
Debe colocar el listado de referencias utilizado, no se aceptará el uso de páginas web
en ningún caso, la aparición de una página web en esta sección implicará
invalidez total de la sección. Utilice la forma estándar para citar (abajo se
presentarán ejemplos), en caso de usar números, deberán ir en orden de aparición
en el informe de forma progresiva (1, 2,3…); si utilizó apellidos para citar, use orden
alfabético.
Para el uso de publicaciones:

Apellidos en orden como aparecen en la publicación, seguidos del año entre
paréntesis, el título de la publicación, el nombre de la revista abreviado en
cursivas, el número (si tiene volumen se debe incluir entre paréntesis) y dos
puntos, seguido de los números de páginas.
Verdonk J, Ric de Vos C.H, Verhoeven H.A, Haring M.A, van Tunen A.J,
Schuurink R.C. (2003). Regulation of floral scent production in petunia
revealed by targeting metabolomics. Phytochemistry 62: 997-1008.
Para libros:
Apellidos en orden, año de la publicación, título del libro, edición, editorial,
ciudad entre paréntesis, pagínas (pp:) y el número de las páginas.
Futuyma D.J. (1986). Evolutionary biology. 2ª Ed. Sinauer associates Inc.

Publishers (Sunderland, MA). pp: 325-401.
6
Práctico de Introducción. Normas de Bioseguridad1
NORMAS DE SEGURIDAD EN EL LABORATORIO
Esta guía entrega parte de los conocimientos básicos que deberían manejar los estudiantes
universitarios de las carreras del área de biología de la Facultad de Química y Biología antes
de iniciar las actividades de laboratorio de biología celular.
Normas personales en los laboratorios de Biología Celular
1. No se debe comer, masticar chicle, ni beber en los laboratorios de docencia.

Tenga en cuenta que en los mesones se trabajan con ratones, con microorganismos
y otras muestras biológicas.
2. Debe usar una bata, delantal o cotona, la cual debe ser de manga larga y debe
cubrir el completamente el torso y casi la totalidad de los muslos (siempre se debe
utilizar abotonada). Tenga en cuenta que esta será su principal protección frente al
contacto accidental con reactivos sólidos y líquidos y salpicaduras de soluciones.
3. Usar pantalón y zapato cerrado (evite el uso se zapatillas de lona), que cubra la
totalidad de las piernas, en lo posible jeans, ya que protegerán sus piernas de
derrames accidentales de reactivos o soluciones peligrosas y parcialmente del fuego.
4. Usar el pelo amarrado, evitando que caiga por los hombros (de lo contrario en caso
de trabajar con fuego se puede quemar).
5. Usar guantes que se ajusten a sus manos y protejan de la mayoría de los solventes.
Existen distintos materiales como látex, vinilo, neopreno, pvc, nitrilo, siendo estos
últimos lo que mejor protegen para los propósitos de estos laboratorios. El propósito
de usar guantes es o bien protegerse del contacto directo con la muestra o los
reactivos, si es que estos suponen un riesgo a la salud, o bien para proteger a la
muestra, ya que la piel tiene enzimas como DNAasas y RNAsas u otras moléculas
que podrían comprometer la estabilidad de la muestra. Si la muestra es segura y su
manipulación sin guantes no implica su degradación, no es necesario su uso. Por
último, recuerde jamás utilizar guantes bajo mechero, ya que si se incendia puede
adherirse a su piel provocando quemaduras graves.
6. Lavarse las manos y quitarse el delantal antes de salir del laboratorio.
7. No lleve a su boca ningún producto químico, para conocer su sabor, ni tampoco
tocarlos.
Normas adicionales a tener en cuenta para otros laboratorios.
8. No se debe usar lentes de contacto. Tenga en cuenta que algunas sustancias
pueden corroer el material de los lentes y dañar sus ojos.
9. Usar antiparras para proteger sus ojos de la salpicadura de soluciones irritantes,
como el etanol, fenol, entre otras.
10. Usar mascarillas para evitar contaminar las muestras, por ejemplo, en los análisis
microbiológicos y cultivos celulares.
1
Esta sección de la guía fue desarrollada por la Dra. Marisol Pizarro
7
Normas para la manipulación de sustancias
1. Antes de manipular una sustancia peligrosa, revise y analice la hoja de Datos de

Seguridad.
Aquí se presentan algunos de

los iconos para que pueda
reconocer con qué tipo de
sustancia está trabajando
También existe la nomenclatura basada en el Rombo NFPA 704

de la Asociación nacional de protección contra el fuego (National
Fire Protection Association) permite identificar según el color la
peligrosidad de cada sustancia, adicionalmente cada grupo
posee una numeración que indica el grado de peligro, riesgo de
incendio y grado de reactividad.
La clasificación según el riesgo es la siguiente:
Azul Salud Rojo Inflamabilidad Amarillo Reactividad Blanco Casos Especiales

4 Mortal 4 Debajo de 25 °C 4 Puede explotar con OX Materiales oxidantes
facilidad
3 Muy peligroso 3 Debajo de 37 °C 3 Puede explotar en W Materiales que
caso de golpe o reaccionan
calentamiento explosivamente con
agua.
2 Peligroso 2 Debajo de 93 °C 2 Inestable en caso de SA Materiales gaseosos
cambio químico asfixiantes simples.
violento.
1 Poco peligroso 1 Sobre 93 °C 1 Inestable si se
calienta
0 Sin riesgo 0 No se inflama 0 Estable
Gestión de residuos
Durante el trabajo en el laboratorio se generan residuos. Antes de comenzar, haga una

revisión de los desechos que va a generar, y localice los diferentes contenedores donde
deberán ser depositados. No dude en consultar a su profesor o ayudante si tiene alguna
duda al respecto.
8
Contenedores de sólidos no peligrosos: Papel, material de plástico y otros elementos
que no contengan sustancias peligrosas.
Material cortopunzante: Agujas, bisturís, pipetas de vidrio u otros similares deben ser
retirados a parte del resto de sólidos, en un recipiente rígido convenientemente señalizado.
Contenedores para material biológico: Los restos de material biológico deberán ser
depositados en contenedores con bolsas especiales que permitan su posterior esterilización.
Contenedor de líquidos:
En función de la naturaleza del residuo líquido, deberá ser clasificado y desechado en uno
de los siguientes contenedores.
Soluciones inorgánicas: tampón bicarbonato, tampón fosfato, etc.
Halogenados: cloroformo, tricloroetilino, etc.
Disolventes orgánicos no Halogenados: Metanol, etanol, propanol, éter, etc.
Contenedores especializados:
Como los que se usan para el material contaminado con bromuro de etidio, o
paraformaldehido.
Buenas prácticas de laboratorio
1. Debe limpiar su espacio asignado en los mesones de trabajo, no debe dejar con
restos de goma, ni material de desecho
2. Debe verificar el estado del material y lavarlo luego de utilizarlo. Primero

abundantemente con agua de la llave, para finalizar con un lavado con agua
bidestilada.
3. Debe revisar las micropipetas antes y después de utilizarlas, dejándolas en el mayor

volumen y en el soporte de plástico. Tenga en cuenta que de lo contrario se puede
dañar el engranaje y descalibrarlas.
4. Debe utilizar el material volumétrico adecuado, para evitar cometer errores que
puedan afectar sus resultados.
5. Antes de utilizar cualquier instrumento con el que no está familiarizado, asegúrese de

recibir las explicaciones y entrenamiento necesario para su correcto uso. Acuda al
manual del aparato, o al profesor a cargo.
6. Antes de comenzar cualquier actividad realice un esquema teniendo en cuenta los

reactivos que va a necesitar y la secuencia de los diferentes procedimientos,
asegurándose de aclarar cualquier duda que le pueda surgir. Esta planificación, que
debe ser realizada antes de asistir al práctico, le ayudará a mejorar su desempeño
durante el laboratorio.
7. Debe dejar el mesón de trabajo limpio después del uso.
9
Cuaderno de laboratorio
El uso de un cuaderno de laboratorio es obligatorio. Este es un elemento importante

que deben poseer los estudiantes de ciencias. Permite tener un registro de todas las
actividades realizadas en el laboratorio, con las modificaciones de los protocolos y
observaciones de los experimentos. Generalmente se utilizan cuadernos empastados
o tipo college, esto evita que se salgan las hojas (no olvide poner sus datos como
nombre, dirección de email y/o teléfono, para que alguien lo pueda contactar en caso
de extraviar su cuaderno). En esta ocasión el cuaderno de laboratorio estará
integrado en la guía, en las páginas convenientemente marcadas para este
propósito.
a. Se escriben con lápiz pasta o mina, les recomendamos lápiz de mina.
Se recomienda este último ya que algunos solventes como el etanol
pueden borrar protocolos y resultados importantes.
b. Lo primero que debe hacer es registrar la fecha y la actividad a
realizar.
c. Cuando escriba sus protocolos y observaciones debe detallar cada
uno de los pasos que realizó y no solo los resultados. Debe considerar
que el cuaderno se escribe con el objetivo de que alguien pueda
replicar lo experimentos realizados (debe indicar los materiales y
métodos), no olvide incluir el cálculo para la preparación de soluciones
y diluciones.
El cuaderno de laboratorio también corresponde a un documento válido legalmente

para defender sus datos en contra de las acusaciones de fraude y para respaldar
patentes, cuando usted ya se esté desempeñando como científico. Por esto es
importante que usted comprenda cuales son los elementos esenciales que le
permitirán llevar un buen cuaderno de laboratorio.
Por otro lado, el cuaderno jamás debe ser sacado del laboratorio donde usted se
desempeña, pues no es de su propiedad sino del investigador principal. En este caso
y como corresponde a un laboratorio de docencia, sí es de su propiedad ya que es
esencial para el desarrollo de los informes de trabajo.
10
Instrumentación del laboratorio
Micropipetas
Permiten transferir pequeños volúmenes que van desde los 0.2 µL-
10.000 µL. La mayoría de pipetas que utilizará durante su formación son
pipetas de desplazamiento de aire, y requieren puntas de plástico
desechables para tomar el volumen
Las más comunes y que encontrarán en los laboratorios son:
Pipeta Volumen Puntas

P10 0-5 blancas
P20 2-20 amarillas
P100 10-100 µL amarillas
P200 20-200 µL amarillas
P1000 200-1000 µL azul
Figura 1. Pipetas de desplazamiento de aire
Precauciones:
1. Jamás exceda el volumen máximo de la
micropipeta y tampoco utilice volúmenes
inferiores al mínimo indicado, pues esto
daña los pistones del instrumento y lo
descalibrará.
2. Jamás golpee las micropipetas ya que
se descalibran y nunca las voltee cuando
la punta tenga liquido en su interior.
3. En caso de que entre líquido al tip holder
séquelo inmediatamente y remueva el
contaminante con isopropanol.
4. Cada vez que cambie la punta debe
cerciorarse de que quedó bien
ensamblada sino se le derramará el
contenido
Figura 2. Partes de una pipeta
11
Modo de empleo
Figura 3. Etapas del proceso de pipeteo
1. Aspiración. Se aprieta el émbolo (push button) hasta el primer tope para la aspiración del líquido,
hazlo fuera del solvente sino puede salpicar o generar burbujas.
2. Estabilización. Se introduce la punta en el recipiente con solvente y aspira el contenido
previamente ajustado en la micropipeta. Con cuidado de no generar burbujas.
3. Dispensado. Coloque la parte inferior de la punta contra la pared del recipiente en un ángulo
aproximado de 40º. Presione el botón hasta e primer tope para expeler la muestra.
4. Purga. Presione hasta el segundo tope para soltar el volumen completamente.
5. Apriete el eyector, y deseche la punta.
Cuando se pipetean líquidos que tienen una viscosidad y densidad diferentes a la del agua,
como por ejemplo solventes orgánicos, se forma una película de líquido sobre las paredes internas de
la punta. Esta película puede crear error y puede ser evitado mediante la formación de la película
antes de transferir la primera muestra. Para esto se debe realizar un prelavado que consiste en
aspirar el volumen deseado de líquido y descartarlo, con el objetivo de formar una película de solvente
en el interior de la punta. Cuando ésta ya se ha formado los pipeteos posteriores tendrán mejor
exactitud y reproducibilidad. Esta operación deberá ser repetida cuando el volumen a ser aspirado
cambia o cuando se usa una nueva punta.
Cuando la muestra tiene una viscosidad alta, como es el caso del glicerol, el Triton X-100, el
aceite, etc. tras introducir la punta en la muestra, se debe aspirar lentamente y retirar la micropipeta
del contenedor, cuidando limpiar la punta en la orilla de este, pues Ud. observará que la pared externa
de la punta arrastrará un considerable volumen del líquido aspirado. Cambie la punta si debe volver a
pipetear, si no lo hace observará que tras cada pipeteo, acumula muestra en la punta, haciendo
inexacto el volumen expulsado.
Cuando la muestra tiene una baja viscosidad, como es el caso del alcohol, el ácido acético,
fenol, cloroformo, etc., debe cuidar no pipetear enérgicamente pues el volumen puede pasar al interior
de la micropipeta. Una vez tomado el volumen, tenga la precaución de trasladarlo de inmediato al
recipiente que lo contendrá, pues debido a su baja capilaridad comenzará de inmediato a caer a gotas
desde la punta. Para evitar ésto, pipetee varias veces (3-4) el volumen de líquido (aspirar-dispensar)
antes de tomar la alícuota definitiva.
12
Espectrofotómetro
Los espectrofotómetros tienen una fuente lumínica que puede ser una lámpara de tungsteno (rango
Visible) o una lámpara de deuterio (rango UV). La luz de la fuente pasa por un colimador (lente)
permitiendo que los haces de luz pasen de manera paralela a través de un monocromador que
seleccionará la longitud de onda determinada a la que queremos realizar la medida. La luz de la
longitud de onda seleccionada (Io) atravesará la muestra, y se medirá la luz que logre llegar al
fotodetector (I). La transmitancia, es decir (I/Io) nos permite calcular la concentración en una solución
a través de la ley de Lambert-Beer.
Figur
a 4.
Esqu
ema
del
funci
ona
mient
o de
un
espe
ctrof
otóm
etro
Balanza de precisión
Permite masar cantidades pequeñas menores en el rango de los miligramos.
Debe fijarse que esté bien balanceada, ya que cualquier movimiento alterará
el resultado de la medición.
Se debe utilizar con las puertas de la caja transparente cerrada, para evitar
las corrientes de aire y la entrada de polvo.
Recuerde limpiarla antes y después de su uso, ya que algunos materiales
pueden corroer el platillo
pHmetro
El pHmetro es un sensor electroquímico para medir el pH de una
solución, basándose en la diferencia de potencial entre el electrodo de
referencia y el electrodo de medida.
Debe calibrarlo cada vez que lo utilice con soluciones tampón de pH 4,

7 y 10
El electrodo del pHmetro debe ser lavado luego de su uso con agua
MilliQ o bidestilada y guardado en una solución de KCl 3 M.
13
Baño termorregulado
Es un sistema que utiliza agua para calentar soluciones o incubarlas
a determinadas temperaturas, ya que algunas reacciones necesitan
temperatura controlada. Existen flotadores de distintos tamaños
para los tubos. Nunca debe dejarlo destapado ya que puede
sobrecalentar el sistema. Evite utilizar gradillas para incubar ya que
algunas tienden a deformarse.
Centrífuga
Es un instrumento que genera movimientos de rotación a alta velocidad permitiendo la separación de

componentes celulares en función de su coeficiente de sedimentación. Al exponer una muestra a la
fuerza centrífuga experimentará la separación de sus componentes, en donde, las partículas más
densas migran al fondo del tubo y las de menor densidad quedan en la parte superior del pellet
(precipitado en el tubo), existe una fracción que permanece en solución como las proteínas, ácidos
nucleicos, entre otras moléculas, las cuales posteriormente pueden ser recuperadas para su análisis.
Recuerde nunca utilizar la centrífuga sin su tapa de seguridad, esto evita que se ensucie el equipo en
caso de que los tubos se abran.
Figura 5. Posición de los tubos en la centrífuga. La bisagra del tubo siempre debe estar orientada hacia afuera
como se muestra en la imagen, esto asegura la sedimentación correcta del pellet, luego de la centrifugación, el
tubo se debe inclinar levemente para la extracción del sobrenadante y la punta se debe poner en contacto con el
tubo en el lado opuesto al pellet, ya que esto previene su disgregación.
Es mandatorio balancear teniendo en cuenta la posición de los tubos en el rotor, y el volumen y

viscosidad de la muestra dentro de ellos, de lo contrario puede dañar el rotor y su eje. En la siguiente
figura se muestran ejemplos para su correcto uso
14
Figura 5. Balance de la centrifuga. Tres ejemplos de cómo colocar correctamente los tubos en una centrífuga.
Los círculos amarillos representan espacios ocupados y los negros representan espacios desocupados.
Recuerde que los tubos enfrentados deben tener el mismo volumen y peso.
Actividades
1. Tome una pipeta (da igual el volumen) y reconozca las partes tanto de punta como
de pipeta que ve en la figura. Según el fabricante las pipetas pueden ser ligeramente
diferentes.
2. Familiarícese con la rutina del pipeteo. Elija una pipeta, mira el volumen que está
fijado, ajústelo al valor que más le guste (observando los límites para cada una de
ellas), ajuste la punta adecuada, y pipetee el volumen deseado de un vaso/tubo con
agua, siguiendo los pasos de la guía (aspiración, estabilización, dispensado y purga).
Haga el ejercicio unas 20 veces, cambiando los volúmenes de trabajo, y fijándose
cuanto volumen de la punta plástica es ocupado por el agua pipeteada.
3. Elija la pipeta adecuada, y dispense en los tubos de plástico eppendorf de 1,5 mL los
siguientes volúmenes 750 µL, 200 µL, 140 µL, 75,5 µL, 4 µL de
a. agua
b. etanol
c. aceite
Recuerde:
1000 µL equivalen a 1 mL
100 µL equivalen a 0,1 mL
10 µL equivalen a 0,01 mL
4. Revise la calibración de la pipeta, pesando el volumen en una balanza de precisión.

Elija una pipeta y un volumen entre 100 µL- y 1000 µL. Vaya a la sala de pesado, y
después de tarar el recipiente donde pondrá el volumen, pese el volumen
dispensado. Haga este ejercicio tres veces, y apunte el peso. ¿Qué diría sobre la
calibración de las pipetas después de haber hecho este ejercicio?
15
5. Resuelva los siguientes ejercicios sobre preparación de soluciones
Siempre que vaya a preparar una solución debe considerar:

1. El volumen de solución a preparar
2. El peso molecular del compuesto
3. REVISAR siempre la hoja de seguridad
4. Verificar que todos los valores estén en las mismas unidades
Ejercicios
5.1 ¿Cuántos mg de NaCl deberá pesar para preparar 500 mL de una solución 10 mM de
NaCl (PM=58,44 g/mol)?
Puede utilizar la siguiente formula
g soluto
Molaridad=
Peso Molecular * Volumen
• Ojo: si la masa necesaria es muy poca le conviene preparar una solución 10 veces
concentrada y luego diluir.
5.2 ¿Cuántos gramos de NaCl necesitaré para preparar una solución de 2 L de NaCl
al 5% p/v (cada 100 mL debo tener 5g de NaCl)?
5.3 ¿Cuánto volumen de una solución concentrada de 5M de NaCl se deberán usar

para preparar 10 mL de una solución 25 mM?
En este caso le es útil la fórmula:
C1 x V1 = C2 x V2
• Ojo: si el volumen es inferior a los 10 µL, le conviene una dilución previa, para evitar el error volumétrico
que puedan tener las micropipetas.
16
Práctico 1. DETECCIÓN DE SALES Y MOLÉCULAS EN MUESTRAS BIOLÓGICAS; USO
ADECUADO DE CONTROLES.
OBJETIVO
En este trabajo se identificarán moléculas y sales utilizando reactivos que

interaccionan de forma específica con cada una de ellas, evaluando además los
controles positivos y negativos correspondientes.
INTRODUCCIÓN
Las muestras biológicas e inorgánicas están formadas por distintos tipos de moléculas que
pueden ser identificadas utilizando reactivos (generalmente específicos) capaces de
reaccionar con cada una de ellas, dando como resultado un color, un precipitado u otro tipo
de señal que puede ser observada o cuantificada.
Las muestras biológicas están compuestas principalmente de proteínas, lípidos e hidratos de
carbono y cada una de estas macromoléculas reacciona de forma particular con algunos
reactivos debido a sus propiedades fisicoquímicas.
Una proteína está formada por aminoácidos, mientras que los lípidos suelen estar formados
por largas cadenas de carbono apolares unidas a moléculas con cierto grado de polaridad.
Un ejemplo de estos últimos son los fosfolípidos, componentes principales de las
membranas biológicas. Por otro lado, los hidratos de carbono suelen ser cadenas cíclicas de
5 o 6 carbonos con grupos funcionales que reaccionan fácilmente con otros azúcares.
Ejemplos clásicos de hidratos de carbono son la glucosa (monomérica), la sacarosa o azúcar
común (un disacárido formado por glucosa y fructosa), o el polímero de almidón en las
plantas (formado por monómeros de glucosa unidos por enlaces específicos, permitiendo
ramificaciones).
Para detectar la presencia de moléculas como estas en muestras biológicas es necesario
disponer de los reactivos específicos, pero además, realizar un diseño experimental que
incluya los controles necesarios para asegurar que la detección es efectiva.
El uso de controles experimentales implica la preparación de reacciones químicas
adicionales que aseguren que lo que se está evaluando o cuantificando es real y no un
artefacto. Un experimento puede tener varios controles que permiten interpretar lo que
observamos de forma correcta. Por otro lado, estos deben ser considerados cada vez que
realizamos alguna experiencia ya que no es válido usar controles preparados con
anterioridad, aunque las condiciones experimentales sean similares.
Tipos de controles (modificado de 1)
Control experimental: indica si el procedimiento básico que se realiza trabaja de forma

correcta. Ejemplos de esto son los estándares de peso molecular en geles usados en
electroforesis de proteínas o estándares de DNA en electroforesis en gel de agarosa, etc. En
estos casos, la correcta migración de los estándares, por ejemplo, nos mostrará que la
polimerización de los geles fue homogénea, que las soluciones usadas están correctamente
preparadas, etc.
Control de tratamientos: estos pueden ser positivos o negativos y muestran si la

manipulación experimental utilizada está teniendo los efectos esperados. Por ejemplo, si
disponemos de un cultivo de células tratadas con factores A y B al mismo tiempo, es
necesario evaluar el efecto de cada factor de forma independiente en cultivos paralelos.
17
Control positivo: es un control experimental que muestra cómo serían los datos (o
resultados) si el tratamiento utilizado tuviera efecto. Por ejemplo, nosotros podríamos
introducir material genético externo en una célula eucarionte (transfección) que codifica para
una proteína fluorescente. ¿Cómo sabemos si nuestras células fueron transfectadas?
¿Cómo se verían nuestras células transfectadas en un microscopio? Para contestar estas
preguntas, una metodología sencilla sería utilizar la misma línea celular pero que sabemos
con anterioridad que efectivamente expresa la proteína fluorescente. Por lo tanto, se podría
observar en un microscopio confocal o de fluorescencia esta línea celular (control positivo)
para determinar cómo se ve una célula que expresa la proteína fluorescente y luego
observar con los mismos parámetros, las células transfectadas por nosotros. Si realmente se
logró transfectar el material genético que codifica para la proteína fluorescente, deberíamos
observar un patrón de fluorescencia muy similar al control positivo.
Control negativo: muestra que el efecto del “no tratamiento”. Siguiendo con el ejemplo
anterior, en este caso debiésemos utilizar células que sabemos que no expresan la proteína
fluorescente (control negativo). De esta forma sabremos cómo se ve una muestra al
microscopio cuando no expresa esta proteína. Si en nuestro cultivo transfectado vemos un
50% de células sin señal o fluorescencia, estas debiesen ser muy similares a las células
utilizadas como control negativo (y viceversa, el otro 50% que presenta fluorescencia,
debiesen verse como las células usadas como control positivo). También podría ocurrir que
no logramos transfectar ninguna célula en nuestro experimento, por lo tanto, se verían todas
como el control negativo, y completamente distintas al control positivo.
El control negativo es uno de los más olvidados y muchas veces omitido. Este error
metodológico puede pasar desapercibido al principio, sin embargo, en algún momento lo
necesitaremos para validar nuestros resultados.
Continuando con el ejemplo anterior: Las células transfectadas presentan fluorescencia

débil, pero de forma homogénea. Si no analizamos el control negativo (células que no
expresan la proteína fluorescente), nuestra primera conclusión será que las células estarían
transfectadas pero que expresan débilmente nuestra proteína fluorescente. Esto podría ser
una interpretación incorrecta ya que muchas veces las células presentan un fenómeno
llamado auto fluorescencia. El uso del control negativo nos mostrará que las células no
transfectadas podrían presentar auto fluorescencia y que la señal que vemos en nuestras
células transfectadas corresponde a este fenómeno, y no a la expresión de nuestra proteína.
Control de tiempos: Si se evalúa el efecto de un factor sobre un cultivo celular a 0, 1, 2, 3 y

4 horas, el control de tratamiento (células no tratadas con el factor) debe ser evaluado al
mismo intervalo de tiempo. Este control también se utiliza con los otros tipos de controles.
Control de tiempo cero: se refiere a la muestra que colectaremos inmediatamente después

de un tratamiento. Lógicamente, el tiempo cero al agregar un factor a un cultivo será de
algunos segundos (dependiendo del experimento), pero puede considerarse como tiempo
cero si se colecta de la forma más rápida posible.
En este trabajo se identificarán moléculas y sales utilizando reactivos que interaccionan de

forma específica con cada una de ellas, evaluando además los controles positivos y
negativos correspondientes.
18
PRE-PRÁCTICO
El día antes del práctico preparar estas soluciones:

5M NaCl
1M AgNO3
Agua destilada
Agua de mar
Glucosa 50 % p/v
Sacarosa 50 % p/v
Reactivo de Benedict
Lugol
Jugo de papa*
Huevo*
Reactivo de Bradford
1 mg/mL Seroalbúmina
*Este material deberá ser conseguidos por el profesor a cargo. El resto lo podrán encontrar
en los laboratorios de docencia.
Materiales y equipamiento:
Tubos de ensayo
Tubos de 1,5 mL
Baño termorregulado
PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
Consideraciones antes de partir:
• El alumno deberá anotar en su cuaderno de protocolo las condiciones experimentales

que utilizó para cada detección y cualquier detalle que considere importante en la
realización de las actividades. Los controles y muestras que utilizará deben realizarse
en las mismas condiciones experimentales, de lo contrario las comparaciones no
serán válidas
• Además, cada reacción química realizada deberá ser explicada en detalle en el
informe correspondiente.
• El alumno deberá anotar los cambios de color, turbidez, formación de precipitado,
que observe en cada una de las reacciones realizadas. El informe deberá contener
una descripción por escrito de estas observaciones.
19
Apartado I. Sal común
1. Prepare las siguientes reacciones en un tubo de 1,5 ml
NaCl.
Control positivo: 100 µL de NaCl 5M + 850 mL de agua + 50 µL de AgNO3 1M.
Control negativo: 950 µL de agua destilada + 50 uL de AgNO3 1M.
Muestra: 100 µL de agua de mar + 850 µL de agua + 50 µL de AgNO3 1M.
Apartado II. Carbohidratos
2. Prepare las siguientes reacciones en un tubo de ensayo
Glucosa.
Control positivo: 100 µL de glucosa 50% p/v + 400 µL de agua + 500 µL de reactivo de
Benedict.
Control negativo: 500 µL de agua destilada + 500 µL de reactivo de Benedict.
Muestra: 100 µL de una solución de sacarosa + 400 µL de agua + 500 µL de
reactivo de Benedict.
Calentar todas las muestras a 90ºC durante 5 minutos y observar.
3. Prepare las siguientes reacciones en un tubo de 1,5 mL
Almidón.
Control positivo: 50 µL de almidón 0,5% p/v + 900 µL de agua + 50 µL de Lugol.
Control negativo: 950 µL de agua destilada + 50 µL de Lugol.
Muestra: 50 µL de jugo de papa + 900 µL de agua + 50 µL de Lugol.
Apartado III. Proteínas
4. Prepare las siguientes reacciones en un tubo de 1,5 mL
Proteínas.
Control positivo: 10 µL de seroalbúmina + 490 µL de agua destilada + 500 µL de
reactivo de Bradford.
Control negativo: 500 µL de agua destilada + 500 µL de reactivo de Bradford.
Muestra: Solución de 10 µL de clara de huevo diluida en agua destilada + 490
µL agua destilada + 500 µL de reactivo de Bradford.
20
GUÍA DE DISCUSIÓN
Utilice este cuestionario para elaborar la discusión del práctico:

• Si se usara agua de la llave en el primer experimento ¿qué cree usted que pasaría?
Relacione el resultado esperado para el agua de la llave, con los obtenidos por el
control negativo y positivo y el agua de mar.
• Justifique si el uso de reactivo de Benedict daría positivo con el jugo de papa.
Comente cuáles son las limitaciones de esta reacción para la detección de
carbohidratos.
• Nombre algún disacárido que se comporte de manera diferente a la sacarosa y
justifiqué su respuesta.
• ¿Qué componente del jugo de papa es imprescindible para el cambio del color que
se observa cuando se añade lugol?
• Si se hace reaccionar el lugol con una solución de glucosa, ¿qué cree usted que
pasará? ¿Por qué?
• Si la misma solución de seroalbúmina utilizada fuera digerida formando péptidos muy
pequeños, ¿cómo cree usted que afectaría eso al cambio de color observado con el
reactivo de Bradford?
BIBLIOGRAFÍA
- At the Bench, a laboratory navigator. Updated edition. Kathy Barkwer. 2005, pag. 73-
75
21
CUADERNO DE LABORATORIO PRÁCTICO 1
22
23
24
25
Práctico 2. VISUALIZACIÓN DE CÉLULAS AL MICROSCOPIO ÓPTICO
OBJETIVO
El objetivo general de este práctico es la comparación de distintos tipos celulares eucariotas

y procariotas a través de su visualización utilizando el microscopio óptico
INTRODUCCIÓN
1. La célula
La célula es la unidad viva mínima capaz de existir en forma independiente y

replicarse. Todos los organismos vivos están formados por células, por unas pocas, incluso
una sola, o por millones de ellas. Todas las células poseen una membrana plasmática
semipermeable que las delimita, constituida por una bicapa de fosfolípidos y por proteínas
integrales y superficiales. Dentro de esta, se encuentra un citoplasma que es una solución
tipo gel que contiene pequeñas y grandes moléculas derivadas del metabolismo celular,
partículas en suspensión de naturaleza ribonucleoproteica denominadas ribosomas, en
donde ocurre la síntesis de proteínas, y por un nucleoide o núcleo que contiene material
genético (ADN), y que puede estar rodeado o no por una membrana nuclear.
Las células procariontes (eubacterias, archaebacterias, mycoplasmas y rickettsias)

poseen un nucleoide donde se concentra el material genético y que no está separado por
una membrana nuclear, además este tipo de células no presentan un sistema de
membranas internas que defina compartimentos subcelulares. Muchos procariontes tienen
una pared o envoltura que es externa a la membrana plasmática. La mayoría de los
procariontes son organismos unicelulares y microscópicos (microorganismos) y sólo algunos
forman filamentos o racimos de unas pocas células, ej. filamentos en el género Bacillus,
racimos de Staphylococcus aureus y diplococos en el género Neisseria.
Las células eucariontes poseen una membrana nuclear que rodea al material
genético, la cual contiene poros que comunican al nucleoplasma con el citoplasma, un
sistema de membranas y de compartimentos subcelulares, como por ejemplo mitocondrias,
cloroplastos, lisosomas y vesículas, y un citoesqueleto formado por microtúbulos,
microfilamentos y filamentos intermedios. Algunas células eucariontes como las vegetales y
algas poseen una pared celular polisacarídica. Muchos eucariontes son unicelulares y
microscópicos, tales como levaduras, protozoos y algas unicelulares, aunque la mayor parte
son pluricelulares como las macroalgas marinas y acuáticas, musgos, helechos, plantas
vasculares, artrópodos, vertebrados, etc.
La mayoría de las células no se puede ver a ojo desnudo, y es necesario un

microscopio, el cual puede ser óptico (luz visible) o electrónico (haz de electrones). En este
trabajo práctico se utilizará un microscopio óptico.
2. El microscopio
La microscopía óptica se basa en la magnificación de una muestra por medio de

lentes, y aprovechando los cambios en propiedades físicas que sufre la luz cuando ésta
pasa por una muestra particular.
26
La luz visible es una pequeña parte del espectro electromagnético (Figura 1) y
contiene el rango de colores que podemos observar.
Figura 1. El espectro electromagnético.
Si estudiamos la luz como una onda, se pueden caracterizar algunas propiedades

que la definen (Figura 2):
Figura 2. Esquema y propiedades de una onda
1. Longitud de onda: distancia entre dos puntos sucesivos de una onda que se
comportan de igual forma. La longitud de onda determina el color.
2. Amplitud: En una onda se pueden identificar crestas y valles (Figura 2). La distancia
vertical entre el máximo de una cresta y el eje central de una onda se denomina
amplitud. Esta propiedad se relaciona con la intensidad de la energía de una onda y
determina el brillo.
3. Frecuencia: Numero de ciclos (crestas o valles) en un intervalo de tiempo,
generalmente 1 segundo. A partir de la frecuencia se puede calcular el periodo (T),
que se define como el tiempo necesario para completar una oscilación, y es
calculado como 1/F.
4. Velocidad: La velocidad a la que se desplaza una onda se puede calcular con la
longitud de onda y la frecuencia (o el periodo)
v=λxf
v=λ/T
Por otra parte, hay que considerar que la luz al pasar por un medio distinto al aire sufre
cambios de dirección y velocidad. A partir de estos cambios se pueden describir 3
fenómenos:
27
1. Refracción: Si la luz incide de forma oblicua en un medio, sufrirá un desvío en su
dirección y un cambio de velocidad.
2. Dispersión: Todas las radiaciones se desplazan a la misma velocidad en el vacío. En

otros medios, la velocidad será distinta y dependerá de la longitud de onda.
3. Reflexión: Es el fenómeno clásico observado cuando un rayo de luz incide sobre una
superficie muy pulida (o un espejo). Los rayos incidentes en superficies como estas no
entrarán en el medio, si no que serán reflejados en el mismo ángulo en el que incidieron
respecto a la recta normal.
2.1 Principio de formación de una imagen
Cuando se hace pasar luz a través de una muestra (asumiendo que es una muestra
que absorba luz), parte de esta pasa sin distorsiones, lo que se conoce como luz directa o no
desviada. Sin embargo, algo de luz es desviada por partes de la muestra. Esta luz desviada
se encuentra fuera de fase y causa un fenómeno llamado interferencia destructiva sobre la
luz no desviada, o en fase. Tanto la luz directa (no desviada) como la difractada (resultado
de la interferencia destructiva) llegan a un diafragma y posteriormente a lentes que
magnifican la imagen la que podremos observar con nuestros ojos, cámaras fotográficas,
etc. Como la luz difractada causa interferencia destructiva, reduce la intensidad y se
observan zonas más o menos oscuras. El patrón de luz y oscuridad obtenido finalmente
puede ser observado por nuestros ojos, ya que estos son sensibles a pequeñas variaciones
de brillo (Figura 3).
Figura 3. A: Espectro de difracción generado en un objetivo por luz no desviada y difractada.

B:diagrama esquemático de luz no desviada y difractada. Modificado de Optical microscopy,
Michael W. Davidson and Mortimer Abramowitz.
2.2 Concepto de resolución.
Se entiende por resolución la capacidad de diferenciar dos puntos que parecieran

estar en el mismo plano, como puntos separados, y por ende, en planos distintos. Según la
teoría de Ernst Abbe, los detalles de un espécimen o muestra se pueden resolver solo si el
objetivo es capaz de capturar la mayor cantidad de luz difractada. Considerando que
generalmente entre la muestra iluminada y el objetivo hay aire (un medio de bajo índice de
refracción), gran parte de los rayos difractados no serán captados por el objetivo. Por otro
lado, si se utiliza un medio con un índice de refracción mayor al aire en el espacio entre la
muestra y el objetivo (como el aceite de inmersión), el ángulo de los rayos difractados será
menor y se capturarán más por el objetivo, permitiendo una mayor resolución (Figura 4).
28
Figura 4. Efecto de distintos medios sobre la luz
difractada capturada por un objetivo. A: Espectro
de difracción cuando se usa aire como medio
entre la muestra y el lente frontal del objetivo. B:
espectro de difracción cuando se usa aceite de
inmersión (que tiene un índice de refracción
similar al vidrio) entre la muestra y el lente frontal
del objetivo. Modificado de Optical microscopy,
Michael W. Davidson and Mortimer Abramowitz
Ecuación de Rayleigh y su relación con la apertura numérica de los objetivos.
En todos los objetivos siempre se indica el valor de apertura numérica (AN, o NA en inglés)
determinado por el fabricante (cuando tenga oportunidad, mire los objetivos en el
microscopio que se le haya asignado). Este valor corresponde a la capacidad de captación
de luz por un objetivo.
Considerando el concepto de resolución, apertura numérica y que además determinadas
longitudes de onda difractan más o menos, se llegó a la siguiente ecuación:
d = 0.61 ( / NA)
Donde:
d: es la distancia entre dos puntos adyacentes observados como separados.
 longitud de onda de la iluminación
NA: apertura numérica del objetivo
Esto nos muestra que, a igual longitud de onda, un objetivo con mayor apertura numérica,
disminuirá la distancia a la que se consigue observar dos puntos como separados,
aumentando la resolución de la imagen. Aumentar el índice de refracción del medio entre la
muestra y el objetivo, para captar más rayos difractados, también disminuye la distancia a la
que se pueden observar dos puntos como separados. Considerando que la de los lentes es
<1 en los objetivos secos, y <1.4 en los objetivos de inmersión, y la longitud de onda de onda
del espectro visible (0.4 nm – 0.7 nm), las mitocondrias y bacterias, cuyo tamaño es
aproximadamente 0.5 µm de longitud, son las estructuras más pequeñas que pueden
visualizarse con un microscopio óptico.
2.3 Partes que componen un microscopio óptico.
Un microscopio óptico (Figura 5) consta de las siguientes partes: mecánica, óptica y fuente
de iluminación
2.3.1 Los elementos que constituyen la parte mecánica son:
• El pie sobre el cual descansa el aparato que debe tener una base suficientemente
amplia y pesada para asegurar la estabilidad del instrumento.
• La columna o brazo que sustenta el sistema óptico y el sistema de enfoque
• La platina sobre la cual se deposita la preparación
• Las pinzas que permiten fijar la preparación a la platina
• Los tornillos para desplazar la preparación hacia la derecha e izquierda
• El tubo que sostiene el lente ocular en la parte superior del microscopio
• El revólver giratorio que sostiene los lentes objetivos
29
• Los tornillos para enfocar, estos son un macrométrico que permite realizar
movimientos rápidos y groseros y un micrométrico para efectuar movimientos lentos y
precisos y recorrer la preparación
2.3.2 Los elementos que integran la parte óptica son:
• el ocular: su función es aumentar la imagen producida por el objetivo y sobre él está

grabado el aumento que proporciona, ej. 10X
• los objetivos: su función es amplificar la imagen del objeto aumentando la resolución.
Los objetivos se distinguen y se nombran por sus aumentos, los cuales están
grabados en cada objetivo. El objetivo más pequeño entrega el menor aumento,
generalmente 4X, el objetivo que sigue en tamaño permite un aumento mayor,
generalmente 40X, y el objetivo de mayor tamaño (objetivo de inmersión) entrega el
mayor aumento, generalmente 100X. Para utilizar el objetivo de inmersión debe
utilizarse aceite de inmersión el cual se deposita como una gota sobre la preparación
y luego se introduce suavemente el objetivo en la gota de aceite.
• el condensador: es un sistema de lentes cuya función es concentrar el haz de luz
visible sobre un punto de la preparación de manera que exista una iluminación
uniforme sobre el campo visual. Generalmente, el condensador es móvil y puede ser
desplazado de manera vertical mediante un tornillo o palanca situada junto al soporte
del condensador.
• el diafragma: su función es graduar la entrada de luz que llega al condensador
porque un exceso de luz disminuye el contraste y calidad de la imagen. Cerrando
más o menos el diafragma se consigue la cantidad de luz adecuada para cada
objetivo. Bajo el diafragma generalmente hay un filtro azul, con el cual se obtienen
mejores imágenes.
2.3.3 Por último, la fuente de luz.

Esta se ubica en el pie aparato de manera que la luz emitida coincida
exactamente con el eje óptico del microscopio. En algunos microscopios existe un
dispositivo que permite regular la intensidad luminosa.
A Oculares
B Revólver
C Objetivos
D Platina
E Tornillos
F Condensador
G Tornillo macrométrico
H Tornillo micrométrico
I Diafragme
J Tornillo para regular la altura del condensador
K Interruptor
L Regulador de la intensidad de luz
Figura 5. Partes del microscopio

óptico
30
Tipos de microscopios ópticos
Existen distintos tipos de microscopios ópticos, aunque todos se basan en el mismo

principio de funcionamiento. Diversos objetos de estudio en biología requieren distintos tipos
de microscopios según sea su tamaño y el tipo de estructura que se quiere observar.
Algunos de ellos son:
• Microscopio binocular: este instrumento consta de dos oculares lo que permite la

observación utilizando los dos ojos ya que puede ajustarse a la distancia entre ambos
oculares según sea la distancia interpupilar del observador de manera a obtener la
imagen del ojo derecho y la del ojo izquierdo sobrepuestas.
• Microscopio estereoscópico o lupa: este instrumento permite que la distancia entre el
objeto a observar y el objetivo sea grande y se utiliza para manipulación fina de
muestras. La muestra puede ser observada en tres dimensiones, aunque el aumento
que se obtiene con este instrumento es limitado.
• Microscopio de proyección: este instrumento funciona anexado a una cámara de
video lo que permite que la imagen observada pueda ser proyectada sobre una
pantalla y analizada simultáneamente por varios observadores.
• Microscopio invertido: este instrumento tiene los objetivos debajo de la platina y el
condensador y fuente de luz sobre ella, lo que permite células y muestras contenidas
en recipientes translúcidos como placas Petri, placas y botellas de cultivo, etc.
Normalmente se utiliza para observar y analizar cultivos celulares.
• Microscopio de contraste de fases: este instrumento se utiliza normalmente para
observar células vivas que son más bien transparentes y que necesitarían ser fijadas
y teñidas para ser visualizadas en un microscopio óptico convencional. Su
funcionamiento se basa en detección de los desfases de los haces luminosos que
atraviesan medios de diferentes grosor e índice de refracción en las células. Estos
desfases dan lugar a interferencias que se observan como contrastes entre las partes
del objeto. Las células vivas presentan distintas tonalidades de gris según el índice
de refracción y el grosor de las estructuras internas.
PRE-PRÁCTICO
Reservar el uso de microscopios ópticos al responsable del laboratorio de docencia, como

mínimo tiene que haber uno cada dos personas
Asegurarse cinco días antes del práctico de que las siguientes muestras y reactivos están
disponibles para el día del práctico:
Aceite de inmersión
Portaobjetos y cubreobjetos
Catafilo de cebolla*
Pinzas
Mondadientes
Solución 0,1 % de azul de metileno
Cubeta o vidrio de reloj
Mechero o encendedor
Cuentagotas
Agua destilada
Agua de charco*
31
Muestra de papel impreso
Muestra de papel milimetrado
Muestras de bacterias teñidas
Muestras de tejido hepático teñidas
*Este material deberá ser conseguidos por el profesor a cargo. El resto lo podrán encontrar
en los laboratorios de docencia.
Procedimiento general de observación
1. Comprobar que esté colocado el objetivo más corto y la platina en lo más distante
posible de éste. Maximice el espacio para manipular su preparación sobre la platina.
2. Encender la luz y aumentar la intensidad hasta el nivel apropiado
3. Abrir el diafragma hasta el máximo de luz
4. Empujar el condensador, si es posible, hasta que toque la platina (luz máxima)
5. Colocar la preparación sobre la platina de manera que el cubreobjeto quede mirando
hacia el objetivo, es decir, orientado hacia la parte superior. Si no se coloca de esta
forma, no es posible enfocar con los aumentos más altos y existe peligro de romper
la preparación.
6. Con el objetivo de menor aumento, enfocar la preparación mediante movimientos del
tornillo macrométrico. Perfeccionar el enfoque mediante el tornillo micrométrico.
7. Regular la apertura del diafragma hasta que la luminosidad del campo proporcione
las mejores condiciones de observación.
8. Inspeccionar todo el corte que se esté observando, desplazando si es necesario la
preparación.
9. Escoger la zona que se quiere observar con al aumento más grande y colocarla al
centro del campo.
10. Pasar al objetivo de mediano aumento y enfocar con el tornillo micrométrico.
Observar todo el campo centrando la zona que se ha escogido para pasar a aumento
mayor.
11. Pasar al objetivo de mayor aumento. Enfocar con el micrométrico. Tener en cuenta
que la distancia de trabajo entre el objetivo y la preparación es muy corta, por lo que
si se mueve el tornillo macrométrico podría romperse la preparación.
12. Al terminar la observación de una preparación, sin mover la platina se tiene que
colocar nuevamente el objetivo de aumento menor antes de retirarla.
13. Al terminar, bajar la intensidad de la luz, cerrar el interruptor y tapar el microscopio.
El aumento total es el resultado del producto del aumento del objetivo por el del ocular.
Por ejemplo si el ocular entrega un aumento de 10X y el objetivo un aumento de 40X el:
Aumento total = aumento del objetivo x aumento del ocular = 40 x 10 = 400X
32
Apartado I, familiarización con el microscopio óptico
1. En primer lugar, se les entregará un microscopio óptico en el cual deberán identificar los
distintos componentes (ocular, objetivos, aumentos de cada lente, platina, pinzas, revólver,
condensador, diafragma y fuente de luz).
2. Se le entregará una muestra de papel impreso que deberá depositar sobre la platina del
microscopio para observar utilizando los distintos objetivos. Enfoque siempre utilizando el
objetivo de menor aumento, ajuste la imagen con el macrométrico y luego con el
micrométrico, luego pase al aumento superior y utilice el micrométrico para volver a enfocar.
Observe que ocurre si varía la intensidad de luz y cómo se mueve la imagen si la mueve
hacia la derecha y luego hacia la izquierda.
3. Se le entregará una muestra de un cuadrado de 1x1 cm de papel milimetrado que

depositar sobre la platina del microscopio.
Enfoque con los objetivos de 4x, de 10x y de 40x, y rellene esta tabla:
Objetivo Aumento Diámetro campo Dibujo

total visual (aprox.)
4x
10x
40x
33
Apartado II, visualización de células
4. Separe una de las capas internas de la cebolla, desprendiendo con una pinza la
membrana adherida de la cara interior de una de sus capas, y deposítela en vidrio de reloj
para humedecerla con un poco de agua destilada. Traspásela a un portaobjetos, y cúbrala
con el cubreobjetos. En paralelo, prepare una muestra teñida con azul de metileno. En este
caso, después de depositar la muestra en el portaobjeto, añada una gota de azul de metileno
(lo suficiente para que quede cubierta), espere dos minutos y lave con agua destilada el
exceso del colorante. Añada una gota de agua sobre la muestra, y coloque el cubreobjetos.
Observe ambas muestras bajo el microscopio con los objetivos de 4x, 10x y 40x. Haga
anotaciones y dibujos de cómo se observa la muestra. Utilizando los datos del cuadro
anterior, haga una estimación de cuanto mide cada célula. En la sección de resultados, por
cada muestra observada debe aparecer una descripción escrita y un dibujo o fotografía.
5. Raspe con un mondadientes la mucosa interna de la mejilla de la boca de un voluntario,

depositando el producto extraído en el centro de un portaobjetos con una gota de agua. Con
ayuda del mismo palillo, una aguja u otro portaobjetos, realice una extensión uniforme, y
cubra la muestra con un cubreobjetos.
En paralelo, prepare otro frotis, pero esta vez, seque la muestra, puede ayudarse con la
llama de un mechero. Ponga el portaobjetos en una cubeta o vidrio de reloj, y añada una
gota de azul de metileno, espere dos minutos, y lave el exceso de tinción con agua destilada.
Retire el exceso de agua con un poco de papel secante, dejando que empape el agua, sin
arrastrar, y añada el cubreobjetos. Observe ambas muestras con los objetivos de 4x, 10x y
40x. Haga anotaciones y dibujos de cómo se observa la muestra. Utilizando los datos del
cuadro anterior, haga una estimación de cuanto mide cada célula.
6. Optativo. El profesor o el ayudante de laboratorio durante el desarrollo del práctico,

analizará diferentes muestras del agua de charco disponible, y en caso de que la
observación sea exitosa, les avisará para que realicen una observación directa. En esta
ocasión se utilizará el microscopio óptico que tiene acoplada una cámara digital para tomar
fotografías, tanto para mostrarles su funcionamiento, como para facilitar el reporte de
resultados. Recuerde que el informe no es un álbum de fotos, cada imagen debe ir
acompañada de una descripción, y ayudándose de la literatura de la identificación de los
organismos que se consigan observar.
7. Se le entregarán muestras teñidas de diferentes bacterias. Observe la preparación con el

microscopio utilizando el objetivo 10X y 40x, enfocando en cada paso con el macrométrico y
luego del micrométrico. Deposite una gota de aceite de inmersión (aceite de cedro) sobre el
cubreobjeto, cambie al objetivo 100X y enfoque con el micrométrico (ahora no utilice más el
macrométrico para enfocar porque puede quebrar la preparación y el objetivo del
microscopio). Observe y dibuje las bacterias. Describa la tinción, y haga una estimación del
tamaño que tienen.
Apartado III, visualización de muestras histológicas
8. Se le entregará una preparación histológica permanente de tejido hepático que deberá

observar con aumentos de 10x, 40x y 100X. Dibuje lo que observa en este tejido y trate de
identificar las estructuras subcelulares que resulten visibles.
34
GUÍA DE DISCUSIÓN
En la discusión de este práctico deben encontrarse reflexiones sobre los siguientes puntos.
Este punteo no debe tomarse como un cuestionario, sino más bien como una pauta de las
ideas importantes que deben aparecer en la discusión.
• ¿Qué rangos de tamaño nos permite observar el microscopio óptico, que estructuras
u organismos podemos ver, y cuales son indistinguibles?
• ¿Cómo varía la resolución dependiendo del objetivo usado?
• ¿Qué diferencias en tamaño muestran los diferentes tipos de células observados?
• ¿Cómo y por qué varía la observación de las muestras dependiendo de si se aplica
una tinción o no?
• Diferencias observadas entre bacterias y células eucariotas
• Diferencias observadas entre células animales y células vegetales
BIBLIOGRAFÍA
- Optical microscopy, Michael W. Davidson and Mortimer Abramowitz.
- Lodish, 2015. Biología Celular y Molecular, 7ª edición. Editorial Panamericana.

(versión digital) pp:480-483
35
36
37
38
39
Práctico 3. RESPIRACIÓN MITOCONDRIAL
OBJETIVO
Analizar el fenómeno de transporte de electrones en mitocondrias de hígado de rata.
INTRODUCCIÓN
En este trabajo práctico se purificarán mitocondrias de hígado de pollo. Este órgano es una
de las mejores fuentes de mitocondrias animales ya que entrega un alto rendimiento de
estos organelos fisiológicamente activos. Cabe mencionar, que de un hígado que pesa sólo
algunos gramos, se obtienen por lo menos 10 veces más mitocondrias que de 8 kg de
tubérculos de papa, que es una de las mejores fuentes de mitocondrias vegetales. El hígado
tiene mayor cantidad de tejido conectivo que el bazo por lo que debe utilizarse un mortero o
un homogenizador para ser aisladas. El tejido será homogenizado en un tampón de igual
osmolaridad que las mitocondrias (0,3 M manitol) para conservar la integridad de los
organelos.
El homogenizado será filtrado a través de una gasa para retirar los restos de tejido. Las
mitocondrias serán purificadas por centrifugaciones sucesivas a 10.000 x g en una
microcentrífuga Eppendorf. El pellet mitocondrial aparecerá de color café claro, debido al
color de los citocromos mitocondriales. Bajo el pellet mitocondrial se observará un pellet de
color rojo oscuro que corresponde a glóbulos rojos intactos. Los glóbulos rojos son células
de mayor tamaño que las mitocondrias, por lo que sedimentan más rápido. Se retirará
cuidadosamente el pellet superior, que corresponde a las mitocondrias, resuspendiendo en
tampón de homogenización y se volverá a centrifugar a 10.000 x g. Se volverá a
resuspender el pellet en tampón de homogenización y se centrifugará nuevamente. De esta
manera, se separarán lo más posible las mitocondrias de los glóbulos rojos.
Las mitocondrias purificadas serás resuspendidas en tampón de homogenización y se

agregará resazurina. Este colorante que tiene la propiedad de captar electrones y cambiar
desde el color azul (forma oxidada) a un color rosado intenso (forma reducida). La estructura
química de la resazurina es la siguiente:
Figura 1. Reducción de la Resazurina
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Asimismo, se ensayará el efecto del cianuro de sodio (NaCN) sobre la respiración
mitocondrial.
PRE-PRÁCTICO
Placa de Petri
Bisturí y tijeras
Vaso de precipitados
Tubos eppendorf
Tubos de ensayo y gradilla
Hígado de pollo (carnicería)
Microscopio óptico
Aceite mineral
500 µg/mL Resazurina (en agua bidestilada)/ MitoTracker
100 mM de NaCN (en agua bidestilada) o 1 M azida sódica
Solución de homogenización: 0,3 M manitol, 20 mM Na4P2O7 , 20 mM NaH2PO4, 1 mM

EDTA, 1 mM -mercaptoetanol, ajustar a pH= 7,5
Succinato de sodio 0.1 M en tampón Tris/HCl pH 7.0
Azul de metileno 0.1%
TRABAJO EXPERIMENTAL
Se les entregará un trozo de hígado, que servirá para dos grupos de trabajo.
Apartado I. Aislamiento de mitocondrias
1. Deposite el hígado sobre una placa Petri grande y córtelo en pequeños pedazos con
ayuda de un bisturí (sea cuidadoso (a)).
2. Traspase los trozos de hígado a un mortero. Agregar 10 mL de tampón de

homogenización (0,3 manitol, 20 mM Na4P2O7 , 20 mM NaH2PO4 pH= 7,5, 1 mM
EDTA, 1 mM -mercaptoetanol) y homogenizar enérgicamente con el pistilo del
mortero.
3. Filtre el homogenizado a través de una gasa y traspase el filtrado libre de restos de

tejido a un vaso precipitado de vidrio. Reserve 1 mL para el Apartado III (HT).
4. Traspase el filtrado a 6 tubos plásticos de 1,5 mL (tubos Eppendorf).
5. Centrifugue a 14.000 rpm (aprox. 10.000 x g) a 4ºC en una centrifuga Eppendorf

durante 10 minutos.
6. Resuspenda el pellet de mitocondrias (pellet superior de color café claro) en 500 µL

tampón de homogenización por cada tubo. Reserve 1 mL del sobrenadante para el
Apartado III (S1).
7. Repita la etapa de centrifugación una o dos veces más, hasta que el pellet
mitocondrial se observe mucho más grande que el pellet de glóbulos rojos.
41
8. Resuspenda las mitocondrias en un volumen final de 3 mL con tampón de
homogenización.
Apartado II. Evaluación de la funcionalidad de las mitocondrias.
9. Coloque una gota de la muestra en un portaobjetos, realice la tinción con azul de

tripán y observe al microscopio usando el objetivo de 40X.
· En el cuaderno debe existir una descripción de la preparación, acompañada
de una foto o dibujo.
10. Tome una alícuota de 200 µL de suspensión de mitocondrias y agregue 1800 µL de

tampón de homogenización hasta 2 mL finales utilizando un tubo plástico. Agregue
100 µL de resazurina 500 µg/mL.
· Documentar los resultados, y apuntar el tiempo en los que se observan los
cambios de color. ¿Va aumentando el color a medida que va pasando el
tiempo?
· A la hora de documentar los resultados es importante contar con un buen
control negativo. Considere esto a la hora de escribir el informe.
11. Espere algunos minutos y observe el cambio de coloración debido a la reducción del
colorante.
12. Tome otra alícuota de 200 µL de suspensión de mitocondrias y agregue 1740 µL de

tampón de homogenización utilizando un tubo plástico y 60 µL de ázida sódica. En
caso de no disponer de azida sódica, añadir a 200 µL de suspensión de
mitocondrias, 1700 µL de tampón de y 100 de NaCN 100 mM (¡Cuidado! el cianuro
de sodio es muy tóxico, solo el profesor a cargo debe manipular la solución).
Incubar a 37ºC durante 30 minutos. Añada 100 µL de resazurina 500 µg/mL.
· Documentar los resultados, y apuntar los tiempos en los que se observan
los cambios de color.
42
·
Apartado III. Evaluación de la actividad de la enzima succinato deshidrogenasa.*
1. Marque 7 tubos de ensayo y agregue los siguientes componentes en el orden indicado:

Tubo Tampón de Succinato Fracción (µL) Azul de
homogenización (µL) metileno (µL)
1 1 0 500 Mitocondrial 125
5 1000 500 0 - 125
6 500 500 500 Homogenizado 125
total (HT)
7 500 500 500 Sobrenadante 125
(S1)
2. Una vez realizadas las mezclas, agregue lentamente unas gotas de aceite mineral de
manera de formar una delgada capa sobre el contenido de cada tubo. Luego incube
los tubos en un baño de agua a 37ºC durante 20 minutos y observe cambios
eventuales de color.
3. Registre el color de los tubos antes y después de la incubación. Recuerde que el azul
de metileno es un colorante que al estado oxidado es azul y al estado reducido es
incoloro.
GUÍA DE DISCUSIÓN
En la discusión de este práctico deben encontrarse reflexiones sobre los siguientes puntos:
• Cómo la composición del tampón de trabajo permite que sigamos teniendo
mitocondrias funcionales.
• Comente los principios en los que se basa el fraccionamiento subcelular como
herramienta para aislar organelos.
• Explique qué tipos de experimentos realizaría para evaluar la pureza, es decir la
ausencia de otros organelos, en la muestra.
• Describa el rendimiento obtenido en cuanto a la cantidad y la funcionalidad de las
mitocondrias aisladas.
• Justifique el por qué la preparación de mitocondrias permite el cambio de color de la
resazurina, ¿cambiaría de color si la integridad de las mitocondrias estuviera
comprometida?
• Explique por qué esta molécula es ampliamente utilizada en ensayos de viabilidad
celular.
• Comente y justifique los resultados obtenidos con NaCN.
• Interprete las observaciones obtenidas con el ensayo de actividad de la succinato
deshidrogenasa.
BIBLIOGRAFÍA
– Lodish, Berk, Matsudaira, Kaiser, Krieger, Scott, Zipursky and Darnell (2003).
Molecular Cell Biology. 5th Ed. W.H. Freeman & Co. New York, USA.
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Práctico 4. VISUALIZACIÓN DE COMPONENTES DEL CITOESQUELETO MEDIANTE
MICROSCOPÍA DE FLUORESCENCIA
OBJETIVO
El objetivo de este práctico es observar mediante microscopía de fluorescencia

componentes del citoesqueleto de neuronas en cultivo.
INTRODUCCIÓN
El citoesqueleto corresponde a una red tridimensional conformada por tres tipos de

proteínas: microfilamentos de Actina, Microtúbulos y filamentos intermedios, que entregan
soporte interno a las células, organiza sus estructuras e interviene en procesos celulares
como el transporte.
Los microfilamentos de actina están conformados principalmente por monómeros de
β-actina, encontrándose en forma globular (G-Actina) o filamentosa (F-Actina). El paso entre
G-Actina y F-Actina, está determinado por su actividad ATPasa y su asociación con ATP o
ADP. De esta forma, F-Actina, que está asociado a ATP, pasa a G-Actina por su actividad
ATPasa, convirtiendo su ATP en ADP + P. El equilibrio entre F-Actin y G-Actin, está
determinado por proteínas nucleadoras de Actina, dentro de ellas se encontramos las
cortactinas, forminas y el complejo Arp2/3. La activación de estas proteínas permite la
formación de estructuras tales como filopodios (cortactinas y forminas) y lamelipodios
(Arp2/3). La formación de filopodios y lamelipodios es importante para procesos de movilidad
celular o cambio en la forma de la célula, y en el caso de las neuronas en la formación del
cono de crecimiento neuronal.
Los microtúbulos se encuentran formados por heterodímeros de α y β tubulina que se
alinean para formar protofilamentos, que luego se unen para formar cilindros de 25 nm de
diámetro. El ensamblaje de los microtúbulos depende la actividad GTPasa y su asociación
con GTP o GDP. La organización de los microtúbulos en las neuronas difiere de lo descrito
en otros tipos celulares. Los microtúbulos presentes en las dendritas y axones no tienen una
continuidad con los del soma y varían en su composición. Los microtúbulos ejercen distintos
roles en las neuronas, permiten el transporte desde la membrana a los organelos, participan
en la extensión de las neuritas durante el desarrollo y permiten mantener la integridad de los
compartimientos intracelulares.
En este práctico nos vamos a centrar en el proceso de neuritogénesis, formación de
neuritas, en neuronas en cultivo. Las neuronas en cultivo una vez sembradas se adhieren al
sustrato y comienzan a adquirir su forma característica y extienden sus neuritas que
posteriormente conformarán el axón y las dendritas. Este proceso requiere de una rápida
reorganización del citoesqueleto particularmente, depende de la nucleación de la actina y la
formación del cono de crecimiento y después de la estabilización de los microtúbulos. La
organización del citoesqueleto es fundamental para el funcionamiento de las neuronas.
Para poder estudiar la neuritogénesis podemos marcar los componentes del
citoesqueleto. La actina puede identificarse utilizando faloidina, toxina que se une a la actina
y anticuerpos que reconozcan proteínas de los microtúbulos, como la β-tubulina. Estas
moléculas se pueden conjugar con fluoróforos lo que permite que puedan ser visualizadas
en un microscopio de fluorescencia.
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Microscopio de fluorescencia.
Si bien el microscopio de luz puede identificar con buen detalle algunas estructuras
celulares, como núcleo y proyecciones membranosas, es necesario utilizar otra fuente
lumínica para poder aumentar la resolución y visualizar elementos más pequeños.
La resolución es la capacidad del microscopio de mostrar dos puntos adyacentes o

muy cercanos, separados uno del otro. El límite de resolución (d) (Figura 1a), es la
distancia mínima teórica entre dos puntos que nos permite observarlos como separados y
distintos, depende directamente de la longitud de onda de la radiación electromagnética
empleada en el microscopio (Figura 1b), de manera que a menor longitud de onda menor
será el límite de resolución y mayor el poder de resolución. El límite de resolución es
inversamente proporcional a la apertura numérica (AN) del objetivo. La AN es una medida de
cuanta luz puede canalizar un objetivo para resolver eficientemente un objeto, ponderando el
índice de refracción entre la muestra y el objetivo (aire, agua o aceite de inmersión), y la
apertura angular del objetivo. Como regla se tiene que un mayor número de apertura es
capaz de resolver objetos cercanos de mejor manera, disminuyendo el límite de resolución
(Figura 1c).
b c
Figura 1. a. Límite de Resolución. b. Espectro electromagnético (rango visible 400nm a 750nm). c.

Apertura numérica de distintos objetivos.
49
Dado que la longitud de onda determina la capacidad de resolver una imagen, el
desarrollo de la fluorescencia permite analizar estructuras de menor tamaño a una mayor
resolución, debido a que, mediante el uso de fluorocromos, se puede controlar la longitud de
onda que ilumina la muestra. La fluorescencia es la emisión de luz por una sustancia tras
absorber luz u otra radiación electromagnética de menor longitud de onda. El proceso de
fluorescencia está dado por la excitación de electrones que captan la energía y pasan a un
estado excitado. Para volver a su estado basal deben perder energía mediante la emisión de
luz (Figura 2a).
Las moléculas que emiten fluorescencia se denominan fluorocromos y cuando están
asociadas a otras macromoléculas se denominan fluoróforos. Existen componentes celulares
que emiten fluorescencia de manera natural cómo la clorofila o proteínas, como el caso de la
proteína fluorescente verde (GFP) (Figura 2b). También podemos asociar fluorocromos a
moléculas de anticuerpos para poder detectar componentes celulares mediante
inmunofluorescencia.
a b
Figura 2. a). Fenómeno de fluorescencia. b) Estructura proteína fluorescente verde.
Para poder observar el fenómeno de fluorescencia necesitamos un microscopio de

fluorescencia, el cual requiere de elementos adicionales a los presentes en el microscopio
óptico. Estos elementos permiten filtrar la luz de excitación y de emisión del fluoróforo
(Figura 3). La luz va desde la fuente lumínica al filtro de excitación, donde pasarán sólo
algunos fotones de luz de un rango de longitud de onda determinado, luego pasarán por el
espejo dicroico que direccionará la luz hacia la muestra, la muestra absorberá la luz y emitirá
fluorescencia, la cual será captada por el objetivo, pasando por el espejo dicroico al filtro de
emisión, el cual limpiará la luz de la muestra de otras longitudes de onda que puedan
contaminar, para finalmente llegar al ocular.
Figura 3: Diagrama del paso

de la luz en un microscopio de
fluorescencia. 1. Filtro de
excitación, 2. Espejo dicroico, y
3. Filtro de emisión.
50
Existen distintos tipos de microscopios de fluorescencia, el microscopio de
fluorescencia básico se denomina microscopio de epifluorescencia
El microscopio Confocal utiliza una óptica fluorescente, pero en lugar de iluminar

toda la muestra a la vez, como lo hace el microscopio de fluorescencia, en cada instante el
sistema óptico enfoca un pequeño punto luminoso en una profundidad determinada de la
muestra. El confocal utiliza un laser como fuente de iluminación y permite la discriminación
de distintos planos focales. Los componentes principales son la iluminación tipo point
scanning (pointwise-illumination), y el pinhole, el cual es un filtro que impide la detección de
la emisión de otros planos focales adyacentes (Figura 4).
Figura 4. Esquema
Microscopio Confocal.
Detección de Proteínas mediante Inmunofluorescencia.
La inmunofluorescencia es una técnica que permite identificar distintos componentes

celulares utilizando anticuerpos, proteínas que reconocen de forma específica una molécula
diana. A los anticuerpos se les conjugan o acoplan moléculas fluorescentes por lo que la
señal puede observarse en el microscopio de fluorescencia. Existen métodos de detección
por inmunofluorescencia directos e indirectos. En el método directo (Figura 5a) el anticuerpo
específico para la molécula blanco (anticuerpo primario) se conjuga directamente con la
molécula fluorescente. En el método indirecto (Figura 5b) el anticuerpo primario no se marca
y se detecta utilizando un anticuerpo secundario, que reconoce al anticuerpo primario, el cuál
está conjugado con una molécula fluorescente.
Figura 5. Técnica de
Inmunofluorescencia.
Método directo y Método
indirecto.
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PRE-PRÁCTICO
Inmunofluorescencia de neuronas corticales en cultivo.
Cultivos primarios de neuronas corticales se sembraron en cubreobjetos recubiertos con

Poli-d-lisina a una densidad de 105 células.
- Se estimularon cubreobjetos con cafeína 5 µM en medio Neurobasal por 24 horas.

- Como control se dejaron las células en medio de cultivo Neurobasal.
1. Las células se fijaron con paraformaldehído al 4% en PBS a 37°C por 10 minutos

a temperatura ambiente, se lavaron 3X en PBS.
2. Se permeabilizó con Tritón x-100 al 0.1 % en PBS 10 min a temperatura ambiente,
se lavó 3x en PBS.
3. Las células se bloquearon con suero de cabra al 10% en PBS por 1 hora a
temperatura ambiente.
4. Se incubó con el anticuerpo primario de conejo anti β-tubulina III en dilución 1:300
en suero de cabra al 10%, toda la noche a 4°C.
5. Se lavaron los cubreobjetos 3X en PBS, 10 min c/u.
6. Se incubó con el anticuerpo secundario con anticuerpo secundario de burro anti-
conejo 546 en dilución 1:2000 en Suero de cabra al 10% por 1 hora 30 min en
oscuridad.
8. Se incubó con Faloidina 488 en dilución 1:1000 en BSA al 3%, 30 min en
oscuridad.
10. Se montaron los cubreobjetos usando ProLong Gold.
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ACTIVIDAD PRÁCTICA
Muestra de cultivo neuronal control con inmunofluorescencia anti- β tubulina III y faloidina.
Muestra de cultivo neuronal tratada con cafeína con inmunofluorescencia anti- β tubulina III y
faloidina.
Microscopio de epifluorescencia.
PROCEDIMIENTO DE OBSERVACIÓN EN EL MICROSCOPIO DE FLUORESCENCIA.
1. Para esta actividad se utilizará un microscopio de epifluorescencia, su profesora le

orientará en el uso del microscopio y cómo obtener imágenes en el computador.
Usted deberá ser capaz de identificar los componentes del microscopio, en particular,
los filtros tanto de excitación como emisión.
2. Antes de comenzar, chequear que el microscopio esté conectado a la red eléctrica.

Encender la lámpara de mercurio; deberá esperar aproximadamente 15 minutos
antes de que el microscopio entregue la máxima iluminación. Si la cámara del
microscopio está conectada a un computador, encenderlo e iniciar el programa de
adquisición de imágenes.
3. Deberá colocar la preparación con el cubreobjeto orientado hacia el objetivo,

encienda la luz visible y proceda a enfocar las células con el aumento menor,
haciendo uso de los tornillos macrométrico y micrométrico. Una vez enfocada
cambiar al objetivo 40X para comenzar la visualización de las muestras con
fluorescencia.
4. Seleccione el filtro de emisión y de excitación apropiado para la visualización de su

fluoróforo. Comience visualizando la señal de β- tubulina marcada con 546,
seleccione el filtro de excitación para 546 nm (TRITC) y el filtro de emisión apropiado
(570 nm). Deje pasar la fluorescencia a la muestra y visualice la marca de β- tubulina
en las neuronas. Adquiera una imagen utilizando el software de la cámara acoplada
al microscopio.
5. Cambie los filtros para poder visualizar la señal de actina, para esto cambie el filtro
de excitación al de 488 nm (FITC) y el de emisión apropiado (520 nm). Adquiera una
imagen utilizando el software de la cámara acoplada al microscopio.
Repita el procedimiento adquiriendo imágenes de 3 campos visuales por condición.
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ANÁLISIS DE DATOS
Apartado I. Software de análisis de imágenes Fiji.
Para poder generar las figuras de sus resultados descargue el programa FIJI
(https://imagej.net/Fiji). Descargue la versión de 64 bit compatible con su sistema operativo.
1- Ejecute la aplicación haciendo click en el archivo ImageJ-win64.exe.

2- Abra las imágenes en FIJI.
3- En el menú “Image” →Color→Split channels, separe los canales obtenidos en las
imágenes.
4- En el menú “Image” →Color→Merge channels, combine los canales con marca para
β-tubulina y falodina. Para esto seleccione la imagen de β-tubulina como C1 y la
imagen de faloidina como C2. Elimine el ticket en “Create composite” y haga clic en
OK.
5- Guarde la imagen en formato tiff.
Apartado II. Cuantificación del número de neuritas en las muestras de neuronas en cultivo.
1- Utilizando las imágenes que generó en el apartado uno, cuantifique el número de

neuritas por células. Si la imagen tiene poco contraste en el menú
Image→Adjust→Brigthness/Contrast→ Click en Auto→Apply.
2- Para realizar la cuantificación, haga clic en Plugins → Seleccione Analyze →
Seleccione Cell Counter, CellCounter → Haga clic en Initialize → En Counters Type,
cambiar el nombre seleccionando Rename (Cambiar los nombres a 0, 1, 2, 3, 4, 5
dependiendo del número de neuritas) → Comenzando con el 0, cuente las neuronas
que no tengan neuritas y luego seleccione los otros números (1 a 5) y continué
contando las neuronas que presentan esos números de neuritas.
3- Una vez contabilizadas todas las células de la imagen hace clic en Results y copie
los datos de la tabla.
4- Grafique sus resultados, comparando ambas condiciones experimentales.
Apartado III. Identificación de las diferencias morfológicas de las neuronas entre las
condiciones
1- Describa la morfología de las neuronas en ambas condiciones, describa el patrón de

expresión de tubulina y actina. Identifique si observa una señal más marcada de
actina en alguna región particular de las neuronas.
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GUÍA DE DISCUSIÓN
En el apartado de discusión deberá referirse a sus resultados y debe considerar las

respuestas a las siguientes preguntas:
• ¿Qué diferencias apreciaron entre las 2 condiciones experimentales?

• De acuerdo con sus resultados comente el efecto de la cafeína en la neuritogénesis.
Averigüe como podría ocurrir el efecto.
• En la introducción se habla de la microscopia de fluorescencia. Explique, que
ventajas tienen el uso de la microscopia de fluorescencia en el estudio del
citoesqueleto. Justifique su respuesta y comente si existen mejores metodologías.
BIBLIOGRAFÍA
• Molecular Biology of the Cell. 6th edition. Alberts B, Johnson A, Lewis J, et al. New
York: Garland Science. Chapter 9: Visualizing Cells. 2015.
• Fundamentals of light microscopy and electronic imaging. 2nd edition. Murphy DB and
Davidson MW. Wiley-Blackwell. 2013.
• Inmunología de Kuby. 6a edición. Kindt TJ, Goldsby RA, Osborne BA. McGraw-Hill.
2007.
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Práctico 5. PERMEABILIDAD DE SOLUTOS A TRAVÉS DE LA MEMBRANA CELULAR
OBJETIVO
El objetivo general de este práctico es evaluar la permeabilidad de la membrana

plasmática a algunos solutos, observando el proceso de ósmosis en glóbulos rojos.
INTRODUCCIÓN
Las células de nuestro organismo están delimitadas por una membrana plasmática que la
comunica con su entorno. Una propiedad importante de esta membrana es la permeabilidad
diferencial a ciertas moléculas. Por ejemplo, algunos gases pueden difundir libremente a
través de ella, en cambio, iones, grandes moléculas cómo azúcares, aminoácidos y otras
moléculas cargadas, requieren de proteínas específicas que se encarguen de su transporte.
La membrana plasmática de las células define dos compartimentos: el medio
intracelular y el medio extracelular. Esta membrana actúa de barrera semipermeable,
dejando pasar el solvente (el agua), pero es selectiva en cuanto al transporte de algunos
solutos. La diferencia de concentración entre ambos compartimentos determinará el
movimiento neto del agua hacia aquel que esté más concentrado. Este fenómeno puede ser
fácilmente observado al mantener células animales, como los eritrocitos presentes en la
sangre, en soluciones que contengan diferentes concentraciones de un determinado soluto.
Las soluciones pueden ser clasificadas en función de la osmolaridad, que compara la
concentración de solutos entre dos soluciones separadas por una barrera semipermeable. Si
tomamos la concentración del medio intracelular como referencia, podemos definir una
solución hiperosmótica, si es que la concentración de soluto es mayor que la del medio
intracelular, isosmótica, si es igual, e hiposmótica si es menor. Otro concepto importante
es la tonicidad, que es el efecto de una solución sobre el volumen celular, pudiendo definir
soluciones hipertónicas, cuando las células pierden agua y se encogen (crenación en
células animales), soluciones hipotónicas, cuando entra agua a las células y se hinchan, y
soluciones isotónicas, cuando el flujo de agua neto es cero, y las células no cambian de
volumen.
Tonicidad y osmolaridad están relacionadas, pero ¿todas las soluciones hiperosmóticas son
hipertónicas? Reflexione en torno a esta pregunta antes de entrar al laboratorio.
Figura 1. Representación esquemática e

imágenes en células animales y vegetales de
una condición hipotónica, isotónica e
hipertónica.
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PRE-PRÁCTICO
Preparar soluciones
0,1% NaCl
0,9% NaCl
2% NaCl
NaCl 2.5M
Urea 0.3M
Etanol 0.3 M
Glicerol 0.3 M
Sacarosa 0.3M
Glucosa 0.3 M
Reactivos y Material de Laboratorio

Microscopios
Tubos 1,5 ml
Sangre humana heparinizada
Puntas amarillas
Catáfilo de cebolla
Azul de metileno
Por cada una de las actividades propuestas en los apartados I y II, la sección de
resultados del informe debe incluir:
a) El cálculo de la osmolaridad de cada solución.
b) La fórmula de cada uno de los solutos utilizados (para los compuestos
orgánicos se requiere la fórmula desarrollada)
c) Descripción de la morfología, indicando si se aprecia algún cambio en la forma
y volumen de las células (Puede ayudarse de una fotografía o dibujo).
Apartado I
Transfiera 20 µl de sangre a un tubo que contenga 80 µl de la solución deseada. Coloque
una gota por cada tubo en el portaobjetos y cubra la muestra con un cubreobjetos. Observe
al microscopio (10X y 40X)
1. NaCl 0,9%
2. NaCl 0,1 %
3. NaCl 2 %
Apartado II
4. Urea 0.3M
5. Etanol 0.3M
6. Glicerol 0.3M
7. Glucosa 0.3M (Observar inmediatamente, y a los 5 minutos de haber preparado la
mezcla)
8. Sacarosa 0.3M (Observar inmediatamente, y a los 5 minutos de haber preparado la
mezcla)
En el apartado de resultados de este informe se debe incluir una tabla que incluya
todas las soluciones usadas, su osmolaridad en relación al interior celular y su
tonicidad.
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Apartado III 1
Las células vegetales, a diferencia de las células animales, poseen grandes vacuolas y una
gran presión de turgor. Si bien están rodeadas de una pared de celulosa que la aisla
parcialmente del medio externo, están sujetas a cambios morfológicos productos de la
tonicidad u osmolaridad del medio. La propiedad que permite analizar el movimiento del
agua se denomina potencial hídrico (Ψ) y mide la tendencia del agua para moverse a través
de un sistema, tal como el suelo, atmósfera y células. Si existe un equilibrio osmótico, la
variación el potencial hídrico es cero (∂Ψ = 0), por ende, no hay presión de turgencia en el
tejido (Ψp = 0), por lo que el potencial osmótico del líquido intracelular puede ser igual a la
presión osmótica de la solución en que está contenida. Si disolvemos una solución salina en
el medio, hacemos que el potencial se haga más negativo en el medio externo y por lo tanto
el agua tiende a salir desde el intracelular al extracelular, alterando el turgor y volumen del
protoplasto (célula sin pared), pero no de la pared de celulosa.
1. Coloque dos catáfilos de cebolla en agua destilada y manténgalas en dicha

solución por cinco minutos.
2. Transfiera uno de los catáfilos a una solución de NaCl 2.5 M
3. Agregue dos o tres gotas de azul de metileno sobre el catafilo y tiña por 2
minutos.
4. Observe al microscopio óptico a aumento de 10X y 40X.
GUÍA DE DISCUSIÓN
Las siguientes reflexiones y preguntas deberán ser abordadas durante la discusión de los
resultados del práctico.
¿Cuál es la osmolaridad de la célula? ¿Qué soluciones utilizadas durante el práctico son
equivalentes en cuanto osmolaridad?
Las observaciones realizadas durante este práctico corresponden al transporte de agua a
través de la membrana. Profundice a través de la literatura en qué consiste: ¿Qué
propiedades de la membrana y de la molécula lo permiten? ¿Qué moléculas de la membrana
participan en este transporte?
Comente, además, por cada una de las actividades, cuál era el resultado esperado y si
coincidió con lo observado.
Los resultados del apartado II nos sugieren que hay solutos que son capaces de cruzar la
membrana plasmática. Explicite cuales, e investigue sobre los mecanismos de entrada.
Diferencie entre tonicidad y osmolaridad ¿Todas las soluciones isosmóticas son isotónicas?
Haga hincapié en aquellos resultados que ilustren su respuesta.
¿Por qué los deportistas profesionales consumen bebidas isotónicas en vez de agua
corriente o mineral? O ¿Por qué el suero que se administra en hospitales posee un 0,9% de
NaCl?
Compare la osmolaridad del agua mineral con la de nuestras células. Comente los
resultados.
Compare cómo se observa el fenómeno de ósmosis en células vegetales y animales. ¿Es
necesaria la tinción con azul de metileno?
1Esta sección de la guía fue desarrollada por el Dr. Rodrigo Contreras
62
BIBLIOGRAFÍA
- Silverthon, 2016. Human physiology, 7ª edición. Editorial Pearson Education Inc (San
Francisco, CA). pp:125-131
- Lodish, 2015. Biología Celular y Molecular, 7ª edición. Editorial Panamericana.
(versión digital) pp:480-483
- Sadava, 2009. Life, 9ª Edición. Editiorial Sinauer Associates (Sunderland, MA)
63
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Práctico 6. N-GLICOSILACIÓN EN PROTEÍNAS DE MEMBRANA
OBJETIVO
Este laboratorio tiene como objetivo estudiar el proceso de N-glicosilación que se da

en algunas proteínas, identificando los diferentes procesos que ocurren co-
traduccionalmente en el retículo endoplasmático, y postraduccionalmente en el aparato de
Golgi.
INTRODUCCIÓN
En este práctico se utilizará como proteína modelo un canal de potasio dependiente

de voltaje, introducido establemente en la línea de HEK293. La síntesis de esta proteína,
constituida por cuatro subunidades iguales, comienza y transcurre en el citoplasma, hasta
que del ribosoma emerge el péptido señal. Este péptido es detectado por la partícula de
reconocimiento de la señal que media la translocación del ribosoma a la membrana del
retículo endoplasmático. Una vez empieza a emerger la proteína a través del translocador
proteico, todas las asparaginas contenidas en la secuencia consenso NXS/T que queden
orientadas a la cara luminal serán N-glicosiladas. Esta modificación cotraduccional ocurrida
en el retículo, y llamada N-glicosilación inmadura, consiste en la adición de un oligosacárido
que contiene 2 residuos de N-acetil-glucosamina, 9 manosas y 3 glucosas. Una vez
finalizada la síntesis y el plegamiento de la proteína, ésta será llevada al aparato de Golgi
mediante transporte anterógrado. Durante su estancia en este compartimento, las diferentes
enzimas presentes en las cisternas cis, medial y trans, alterarán la N-glicosilación inmadura
mediante la eliminación de azúcares y adición de otros mososacáridos hasta darle su forma
final. En el último paso, la proteína será empaquetada en el trans-golgi y llevada a la
membrana plasmática, donde realizará su función. Para estudiar la N-glicosilación en las
proteínas de membrana, una de las estrategias es estudiar los cambios en el peso molecular
de la proteína que ocurren a medida que esta modificación postraduccional va madurando.
Para detectar estas diferencias una de las técnicas más usadas el western blot (o
inmunoblot) que permite diferenciar las tres formas de esta proteína: la proteína sin N-
glicosilar, la proteína con la N-glicosilación inmadura, y la proteína con la modificación final.
El western blot se divide en dos fases: en la primera llamada electroforesis, se
separan las proteínas en base a su masa, y en la segunda, la transferencia, se inmovilizan
esas proteínas en una membrana de nitrocelulosa, permitiendo la identificación de proteínas
específicas usando anticuerpos.
Figura
1.
Esquema de las etapas de un western blot
68
La electroforesis de proteínas se desarrolla en una matriz de un gel formado por un
polímero entrecruzado de poliacrilamida, el cual retrasa la migración de las proteínas en un
gradiente proporcional de acuerdo a su cociente de carga/masa, es decir, entre más grande
es una proteína, más carga posee, y más cuesta su entrada en los poros del tamiz. Para
homogenizar la carga eléctrica total y hacerla proporcional al tamaño de la proteína, se
utiliza generalmente el detergente iónico dodecilsulfato de sodio (SDS), que se une
proporcionalmente a la masa molecular de la proteína, confiriendo a la proteína una carga
negativa proporcional a su tamaño. En una segunda etapa, las proteínas separadas durante
la electroforesis son transferidas a una membrana de nitrocelulosa donde quedan
inmovilizadas. Una vez acabado este proceso, se realiza la inmunodetección de las
proteínas de interés. Para ello, primero se incuba la membrana con un anticuerpo primario,
específico para nuestra proteína de interés. Posteriormente, se lava el exceso de anticuerpo
no unido específicamente, y se prosigue con una incubación con un anticuerpo secundario
que reconoce al primario, y que además contiene adherida una enzima que cataliza una
reacción quimioluminiscente, generando una señal lumínica que en contacto con un film
fotográfico permite detectar la actividad enzimática.
Figura 2. Esquema de la etapa de inmunodetección en western blot
PRE-PRÁCTICO:
72 horas antes del práctico

Sembrar 1 placa de 6 pocillos con células de la línea estable HEK-Kv1-myc, previamente
polilisinadas. Medio DMEM, 10% de suero y geneticina (IR: María Pertusa, Laboratorio de
Neurociencia)
48 horas antes
Añadir a dos pocillos tunicamicina a una concentración de 5g/ml a partir de una solución de
5mg/ml en DMSO
24 horas antes
Preparar los siguientes tampones:
Tampón salino PBS (pH 7,4): 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 4,3 mM Na2HPO4, 1,4 mM
KH2PO4.
69
Tampón de carga 2x: 50 mM Tris-Cl, pH 6,8, 4% (w/v) SDS, 10% (v/v) glicerol, 4 % (v/v) de
2-−mercaptoetanol, 0,001% (w/v) de azul de bromofenol.
Gel superior o apilador (4% Acrilamida): 130 mM Tris-Cl, pH 6,8, 4% solución comercial
de Acrilamida (30%Acrilamida/0,8%bis-Acrilamida), 0,1% (w/v) SDS, 1:50 Solución
Persulfato de Amonio en H2O 10% (w/v), 1:500 Solución comercial TEMED (N,N,N’,N’-
Tetrametiletilendiamina).
Gel inferior o separador (7,5% Acrilamida): 375 mM Tris-Cl, pH 8.8, 7,5% solución
comercial de Acrilamida (30%Acrilamida/ 0,8 %bis-Acrilamida), 0,1% (p/v) SDS, 1:50
Solución Persulfato de Amonio 10% (p/v), 1:500 Solución comercial TEMED.
Tampón de electroforesis: 25 mM Tris-base, 192 mM Glicina, 1 % (p/v) SDS.
Tampón de Transferencia: 25 mM Tris-base, 192 mM Glicina.
T-PBS: PBS, 1% (v/v) Tween 20 (Sigma-Aldrich).
Tampón bloqueo: PBS, 10% (p/v) leche en polvo.
12 horas antes
Añadir a dos pocillos Brefeldina A a una concentración final de 5 g/ml, a partir de una
solución concentrada de 1 mg/ml en etanol.
Apartado I
1. Cada grupo deberá observar en el microscopio invertido de contraste de fase las

células con cada uno de los tratamientos:
HEK sin transfectar (control-)
HEK-kv1 (control)
HEK-Kv1+tunicamicina (Tunic)
HEK-Kv1+BFA (BFA)
En el informe deberá incluir una breve descripción del aspecto morfológico que
presentan las células después de cada uno de los tratamientos, y si en alguno de los
tratamientos se observa mayor muerte celular (muchas células en el sobrenadante).
En caso de haber diferencias, en la discusión se deberán comentar las posibles
causas.
2. Se procederá a la extracción proteica, en hielo. Primero realice un lavado con PBS

frío, y posteriormente resuspenda cada pocillo con 500 µl de tampón de carga 2x.
Transfiera la muestra a un tubo eppendorf 1,5 mL, tenga cuidado ya que ésta podría
estar viscosa. Si ese es el caso cortar la punta de plástico.
3. Caliente la muestra a 95 ºC durante 5 minutos en un termobloque.
4. Centrifugue los tubos a 10.000 rpm durante 30 segundos
5. Siguiendo las indicaciones del profesor, cargue entre 15 a 30 µL de cada una de las
muestras en un gel.
6. Conecte el sistema de geles a una fuente de poder y realice la electroforesis a 90 V.

7. 10 minutos antes del final de la electroforesis, cortar las membranas y papel de filtro
para montar el sistema de transferencia siguiendo las indicaciones del profesor a
cargo.
70
8. Realizar la transferencia a 70V durante 2 horas.
9. El profesor a cargo y el ayudante se encargarán del bloqueo, incubación y posterior

revelado. Una vez finalizado el procedimiento les hará llegar la imagen obtenida. En
el informe deberá detallar que muestras cargó en cada uno de los carriles, y el peso
molecular de las bandas que aparecen en cada uno de ellos
GUÍA DE DISCUSIÓN
• Compare los carriles procedentes de células control, el tratamiento con tunicamicina

y brefeldina A, observe como los tratamientos alteran las bandas que aparecen en el
western blot. Investigue cuál es el mecanismo de acción de estas dos moléculas, y
utilice esa información para justificar el efecto observado. Relacione también cada
banda con un estado de maduración de la proteína, y el compartimento donde ocurre.
• En los westerns blots a veces se detectan bandas inespecíficas. Comente si en su

caso aparecen, y la razón de cargar un control negativo correspondiente a células
HEK sin transfectar. Investigue a qué se refiere la guía cuando habla de línea
estable.
• Comente por qué cree que las células después de los tratamientos con BFA A y
tunicamicina, tienen diferencias en cuanto a la morfología y la adhesión.
• Justifique cuál es la función de cada uno de los componentes del tampón de carga
utilizado en este laboratorio, que nos permite la solubilización, y posterior separación
por electroforesis de las proteínas procedentes de un cultivo celular.
POST-PRÁCTICO
1. Bloquear la membrana. 5% leche en PBS

2. Incubar toda la noche con una solución anti-myc 1:3000 en T-PBS
3. Lavar la membrana 3 veces 10 minutos
4. Incubar secundario anti-conejo 1:5000 y revelar
BIBLIOGRAFÍA
- Lodish, BerK, Matsudaira, Kaiser, Krieger, Scott, Zipursky and Darnell (2003).
Molecular Cell Biology. 5th Ed. W.H. Freeman & Co. New York, USA.
- Lehninger (2004). Principles of Biochemistry, 4th Ed W.H. Freeman & Co. New York,
USA.
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Guía Trabajos Prácticos Biología Celular I. 1sem 2022

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TRABAJOS PRÁCTICOS

Dra. Sophía Mejías

1er Semestre 2022

Coordinadora Dr. María Pertusa

La asistencia al laboratorio es obligatoria, si no asiste, debe presentar un justificativo

1. Si justificadamente no asiste un práctico, debe contactarse inmediatamente con el

Las evaluaciones a realizar en laboratorio y sus respectivas ponderaciones son:

Presentación Oral Asincrónica 20%

La nota del laboratorio corresponde a un 30% de la nota final del ramo.

Grupo A: Denise Riquelme Lunes 9:40-12:00

El informe de laboratorio es un reporte detallado y claro de los experimentos realizados

En general, el informe debe:

A continuación, se detalla cada ítem.

3. Objetivos (General y específicos)

Para el uso de publicaciones:

Futuyma D.J. (1986). Evolutionary biology. 2ª Ed. Sinauer associates Inc.

NORMAS DE SEGURIDAD EN EL LABORATORIO

Normas personales en los laboratorios de Biología Celular

1. No se debe comer, masticar chicle, ni beber en los laboratorios de docencia.

1. Antes de manipular una sustancia peligrosa, revise y analice la hoja de Datos de

Aquí se presentan algunos de

También existe la nomenclatura basada en el Rombo NFPA 704

La clasificación según el riesgo es la siguiente:

Azul Salud Rojo Inflamabilidad Amarillo Reactividad Blanco Casos Especiales

Durante el trabajo en el laboratorio se generan residuos. Antes de comenzar, haga una

Soluciones inorgánicas: tampón bicarbonato, tampón fosfato, etc.

Halogenados: cloroformo, tricloroetilino, etc.

Disolventes orgánicos no Halogenados: Metanol, etanol, propanol, éter, etc.

Buenas prácticas de laboratorio

2. Debe verificar el estado del material y lavarlo luego de utilizarlo. Primero

3. Debe revisar las micropipetas antes y después de utilizarlas, dejándolas en el mayor

5. Antes de utilizar cualquier instrumento con el que no está familiarizado, asegúrese de

6. Antes de comenzar cualquier actividad realice un esquema teniendo en cuenta los

7. Debe dejar el mesón de trabajo limpio después del uso.

El uso de un cuaderno de laboratorio es obligatorio. Este es un elemento importante

El cuaderno de laboratorio también corresponde a un documento válido legalmente

Las más comunes y que encontrarán en los laboratorios son:

Pipeta Volumen Puntas

Figura 1. Pipetas de desplazamiento de aire

Figura 2. Partes de una pipeta

Figura 3. Etapas del proceso de pipeteo

Debe calibrarlo cada vez que lo utilice con soluciones tampón de pH 4,

Es un instrumento que genera movimientos de rotación a alta velocidad permitiendo la separación de

Es mandatorio balancear teniendo en cuenta la posición de los tubos en el rotor, y el volumen y

4. Revise la calibración de la pipeta, pesando el volumen en una balanza de precisión.

Siempre que vaya a preparar una solución debe considerar:

Puede utilizar la siguiente formula

5.3 ¿Cuánto volumen de una solución concentrada de 5M de NaCl se deberán usar

En este trabajo se identificarán moléculas y sales utilizando reactivos que

Tipos de controles (modificado de 1)

Control experimental: indica si el procedimiento básico que se realiza trabaja de forma

Control de tratamientos: estos pueden ser positivos o negativos y muestran si la

Continuando con el ejemplo anterior: Las células transfectadas presentan fluorescencia

Control de tiempos: Si se evalúa el efecto de un factor sobre un cultivo celular a 0, 1, 2, 3 y

Control de tiempo cero: se refiere a la muestra que colectaremos inmediatamente después

En este trabajo se identificarán moléculas y sales utilizando reactivos que interaccionan de

El día antes del práctico preparar estas soluciones:

Consideraciones antes de partir:

• El alumno deberá anotar en su cuaderno de protocolo las condiciones experimentales

1. Prepare las siguientes reacciones en un tubo de 1,5 ml

Apartado II. Carbohidratos

2. Prepare las siguientes reacciones en un tubo de ensayo

Calentar todas las muestras a 90ºC durante 5 minutos y observar.