Práctica 5: Determinación del factor Rh por PCR

Fundamento

La PCR ha revolucionado la investigación y diagnóstico basado en la Biología

Molecular. La PCR es un proceso simple, exacto y altamente reproducible que
proporciona la ventaja de empezar con una pequeña cantidad de ADN y ser capaz
de ampli carlo de forma que se tenga su ciente para realizar experimentos.

En esta práctica determinaremos el factor Rh, a partir de una muestra de ADN

extraído de nuestra saliva, mediante la realización de una PCR.

El locus Rh consiste en 2 genes estructurales: D y CcEe, los cuales codi can para
la cadena del polipéptido D y las proteínas C/c y E/e respectivamente. La
presencia o ausencia del gen D en el genoma determina la base genética del
polimor smo de los grupos sanguíneos Rh- positivo/Rh-negativo. Por tanto, los
individuos son clasi cados como Rh+ si contienen el antígeno D en la membrana
de sus eritrocitos. De todas formas, el sistema Rh es mucho más complejo, y
hasta 47 diferentes Rh antígenos han sido descritos.

La base de esta práctica es la ampli cación de un fragmento del gen D. La

ampli cación de este fragmento indicará que la persona es Rh+. Debido a que los
genes D y CcEe son altamente homólogos, es posible diseñar cebadores que se
emparejan en una región del gen D y también a una región del gen CcEe ( gura
1).

De esta forma, todas las muestras de ADN sirven como molde para la
ampli cación.
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 Los individuos Rh+ producirán 2 fragmentos de diferentes tamaños (1200pb y
600 pb) y los individuos Rh- una única banda correspondiente al fragmento del
gen CcEe (1200 pb).

Materiales y reactivos:
-Papel de ltro -Transiluminador
-Equipo para electroforesis (cubeta, -Centrífuga
soporte,peine, molde, cubierta y -Muestras de ADN
fuente de alimentación) -Báscula -Tampón de carga
-Agarosa -Marcador de PM
-Espátula -Mix PCR
-Vidrio de reloj -Control positivo
-Buffer TAE 1x -Reactivo de lisis celular
-Vaso de precipitados -Reactivo precipitante de proteínas
-Probeta -Reactivo hidratante para el ADN
-Agua libre de nucleasas -Isopropanol
-Microondas -Vórtex
-Gelsafe -Baño termostático
-Tubos eppendorf -Termociclador
-Micropipeta y puntas -Hielo

Procedimiento

1. Extracción ADN a partir de una muestra de saliva.

Obtención de diferentes muestras de ADN realizada en prácticas anteriores
(descongelamos las muestras que vamos a utilizar)

2. Preparación del gel de agarosa para el análisis de los resultados de la PCR

mediante electroforesis.
Se utiliza un gel de agarosa 1 % que se tiñe con DanaBlue o Gelsafe para la
detección de los productos de la PCR ampli cados utilizando ADN
genómico de diferentes individuos.

3. Reacción de la PCR:












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 1. Utilizar 2,5 l (100-250 ng) del ADN de cada alumno para cada
reacción de PCR.

2. Preparar un control negativo de ampli cación:

Colocar 2,5 l de agua libre de nucleasas en lugar del ADN, (para
saber si los reactivos o micropipetas y puntas pueden estar
contaminados con ADN). En el control negativo no se ha de
ampli car nada.

3. Preparar un control positivo de ampli cación:

Colocar 2,5 l del control positivo Rh+ en lugar del ADN.
Polimerasa Mix Hot Star(2X): requiere un paso de activación de 10
minutos a 95oC de forma que se eliminen los productos no
especí cos. Además contiene un colorante rojo que permite la fácil
visualización y la siembra directa en el gel sin necesidad de mezclar
con un tampón de carga.

4. Mezclar bien, el colorante rojo incluido en la polimerasa facilita el

proceso.

5. Realizar el proceso de ampli cación:

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 6. El producto de la PCR puede ser sembrado directamente en un gel de
agarosa después de la PCR, ya que el colorante rojo actúa como tampón de
carga.

7. Cargar en el gel las muestras, el control positivo, el control negativo y un

marcador de PM (Danamarker Beethoven).

8. Realizar la electroforesis (5min a 50V y 35 min a 100V).

9. Observación de los resultados:

Detectar las bandas bajo iluminación UV (en el transiluminador).

Valoración de los resultados obtenidos

Se producirán 2 bandas para la determinación del Rh.

Con lo cual, podemos concluir que nuestro resultado no determina el
Rh.