Práctica 4: Valoración de la integridad del ADN mediante electroforesis

en gel de agarosa

Fundamento

La electroforesis es una técnica mediante la cual las especies cargadas se separan en función
de su velocidad de migración cuando se encuentran sometidas a la acción de un campo
eléctrico.

La velocidad de migración está en función de la densidad de carga y el tamaño y forma de los

fragmentos a separar. En biología molecular se separan ácidos nucleicos en función del
tamaño de sus fragmentos ya que la carga/unidad de masa es la misma en todos ellos.

El movimiento de los fragmentos va a producir un patrón de bandas, en el que cada banda

corresponde a un fragmento de un tamaño particular, siendo importante utilizar marcadores
de tamaño conocido que permitan calcular el tamaño de los fragmentos de ADN de las
muestras.

Si el ADN genómico está íntegro, aparecerá sólo una única banda de ADN perfectamente
definida en la parte superior del gel de agarosa. Una muestra de ADN degradada presentará
una estela o “smear” a lo largo del gel que será más pronunciada cuanto mayor sea la
degradación de la muestra.

Procedimiento

1. Preparación del molde

Coger el molde para hacer los geles y cerrar los extremos con los topes para que no se salga la
agarosa. Después colocar el peine para formar los pocillos.

2. Preparación del gel de agarosa

1. Realizar los cálculos para preparar un gel de agarosa al 1%, teniendo en cuenta la
cantidad de disolución a preparar (según el tamaño del soporte y el grosor del gel).

(emplearemos la cubeta pequeña: 50ml)

2. Preparar buffer TAE al 1X necesario a partir de TAE 10X:

a. Para preparar el gel de agarosa
b. Para realizar la electroforesis
 3. Pesar la cantidad de agarosa necesaria.

4. Añadir la agarosa al buffer TAE 1X y esperar unos 2 minutos antes de calentar.

5. Calentar la mezcla para disolver la agarosa, el método más rápido es la utilización de

un microondas (también puede utilizarse una placa calefactora).

Para que la agarosa se disuelva se ha de llevar la solución a punto de ebullición; para

ello calentamos en el microondas a elevada potencia (1-2 min.). A la mitad del tiempo
sacamos y agitamos para disolver bien la agarosa.
Cuando empiece la ebullición, tras unos segundos, parar el microondas y sacar la
solución.
Observar si la solución está transparente. Si no lo está, mezclar bien y volver a calentar
en el microondas. La solución final debe aparecer clara sin partículas aparentes.

6. Dejar enfriar la solución (tapada) hasta unos 55ºC.

7. Añadir aproximadamente unos 3 µl de GELSAFE Nucleic Acid Stain por cada 50 ml de

gel de agarosa (comprobar la cantidad indicada en el folleto GELSAFE).

3. Añadir la solución de agarosa en el centro de la cubeta formadora de geles evitando la

formación de burbujas. Colocar el peine que corresponda.

4. Permitir que la agarosa se enfríe hasta que solidifique (30-60 min. a T ambiente). Después
que el gel se haya solidificado, con mucho cuidado, sacar los topes y el peine.

5. Añadir el buffer TAE 1X a la cubeta de electroforesis.

6. Colocar el gel en la cubeta y cubrir el gel con buffer (asegurarse que el gel está
completamente cubierto de tampón; mas o menos 1cm por encima).

(El tampón de electroforesis se puede utilizar para 2 experimentos de electroforesis, una

vez terminada la electroforesis guardar este tampón utilizado en un envase diferente al
suministrado para utilizarlo en una nueva electroforesis).

7. Mezclar las muestras con el tampón de carga DNA Loading buffer 6X (teniendo en cuenta
que finalmente su concentración en la muestra será 1X): centrifugar brevemente (spin) las
muestras (antes y después de añadir el tampón de carga).

(en nuestro caso, pocillos: 10 µl)

8. Cargar las muestras en el gel y un marcador de PM (Danamarker Beethoven):

La carga de la muestra en los pocillos es submarina, ya que el gel está sumergido en el

tampón de electroforesis. Para esto, verter la muestra sobre la pared lateral del pocillo
y comprobar que la muestra queda depositada en el fondo del pocillo.
 Comprobar si el marcador viene con tampón de carga incluido; en caso contrario hay
que añadirlo como a las muestras.

9. Después que se han sembrado las muestras, cuidadosamente colocar la cubierta del aparato
de electroforesis en los terminales de los electrodos y conectarla a la fuente de alimentación.

10. Programar la fuente de corriente a 50 V 5 minutos. Después modificar a 100 V durante 35

minutos (vigilar que los colorantes no salen fuera del gel.)

11. Detectar las bandas bajo iluminación UV (en el transiluminador).

Observaciones

1. Valorar la integridad del ADN de la muestra.

2. Explicar la migración de acuerdo con la carga. ¿El ADN hacia qué electrodo migrará?
3. ¿Cuál es la función del tampón de carga?