PR CTICA 8.

PCR
• AMPLIFICACI N Y DETECCI N POR PCR DEL
• DETECCI N DE COVID LOCUS HUMANO D1S80 19 POR RT qPCR

PREPARACI N MASTER MIX

— A partir de los reactivos que se te han proporcionado y las concentraciones finales que
deben tener cada uno deber s prepara una muestra maestra.
• Recuerda:
— Debes trabajar en condiciones de seguridad y libre de contaminantes, por lo
que llevar s a cabo todas las medidas que consideres oportunas, a tal fin.
— Deber s seguir los pasos con el debido orden y limpieza, conforme a lo que hemos
visto en clase.
— Deber s elegir las pipetas adecuadas y llevar a cabo un pipeteo de forma precisa para
que la concentraci n y volumen final sea el adecuado.
— Debes trabajar de manera individual.

DISPONES DE LOS SIGUIENTES REACTIVOS (1 KIT POR BANCADA)

REACTIVOS:
— Tamp n de reacci n 10x:
Tubo eppendorf de 1 ml
— DNTPs 15 mM:
Tubo eppendorf de 1 ml
— MgCl2 50 mM:
Tubo eppendorf de 1 ml
— Cebador F 15 pmol/µl:
Tubo eppendorf de 1 ml
— Cebador R 15 pmol/µl:
Tubo eppendorf de 1 ml
— Taq ADN pol 4 U/µl:
Tubo eppendorf de 1 ml
— Agua grado PCR:
Bote de 10 ml
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 PR CTICA 8. PCR
FUNDAMENTO TEÓRICO

Método de laboratorio que sirve para hacer muchas copias de un trozo determinado de
ADN a partir de una muestra que tiene cantidades diminutas de este ADN. Con la
reacción en cadena de la polimerasa se amplifica (multiplica) ese trozo de ADN para que
se pueda detectar.

OBJETIVO

— Introducir a los estudiantes en los principios y pr ctica de la Reacci n en Cadena de la

Polimerasa (PCR) mediante el estudio del polimorfismo D1S80 entre individuos utilizando
para ello la t cnica de la PCR.

AMPLIFICACI N Y DETECCI N POR PCR DEL

LOCUSHUMANO D1S80
LOS POLIMORFISMOS DE ADN

— Se refieren a regiones de cromosomas que var an ampliamente de un individuo a otro.

Examinando varias de estas, se puede determinar el “DNA fingerprinting” de un individuo.
— ADN tiles para an lisis : VNTRs (Variable Number of Tandem Repeats) o minisat lites,
y STRs o microsat lites.
— VNTR: Secuencias que oscilan desde 7 a 100 pb de longitud.
— STR: Secuencias de 2-6 pb de longitud.
— Est presente en el cromosoma 1 y contiene un VNTR consenso de 16 pb
(AGGACCACCAGGAAGG).
— El alelo con menor no de repeticiones contiene 14 repeticiones.
— El alelo con m s repeticiones presenta hasta 72 repeticiones.
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 — El alelo m s com n contiene 18 y 24 repeticiones, mientras que el m s raro contiene

14 y 38.
— No existe un fenotipo conocido asociado con el locus D1S80, haciendo ideal su estudio
para distinguir personas s lo por su secuencia del ADN.

MATERIAL

Termociclador, centrífuga, microcentrífuga, vórtex, vasos de precipitados, gradillas, tubo

eppendorf, micropipetas, muestras de adán de saliva, control negativo, tampón, gel de
agarras, cubeta de electroforesis, kit master mix.

PROCEDIMIENTO

Pie de foto

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 CALCULOS
1g · 150ml / 100ml = 1’5g agarosa

UTILIDAD
Los polimorfismos del ADN se utilizan para la determinaci n de paternidades/
maternidades, identificaci n de restos humanos, y la base gen tica de enfermedades.
La aplicaci n m s usual ha sido en el campo forense para la identificaci n de posibles
criminales.

— Realizar la extracci n de ADN mediante el kit para saliva.

— La Master Mix est preparada. Se deben pipetear las siguientes cantidades de
reactivos y muestra en cada tubo de reacci n:

REACTIVOS VOLUMEN
MIX PCR 22,5 ul
ADN (100-250 ng). 2,5 ul
Volumen total 25 ul
1 por alumno

IMPORTANTE
— Mezclar bien, el colorante rojo incluido en la polimerasa facilita el proceso.
— Para la activaci n de la Polimerasa “HOT STAR” es necesario programar un paso de
desnaturalizaci n inicial de 10 minutos a 95oC
— Preparar un control negativo de amplificaci n, para ello colocar 2.5 ml de agua libre de
nucleasas en lugar del ADN
— Sirve para saber si los reactivos o micropipetas y puntas pueden estar contaminados
con ADN, no se ha de amplificar nada.
S lo un alumno

PROGRAMA D1S80
PASOS Tª TIEMPO
Desnaturalizaci n HOT STAR 95ºC 10 minutos
Ciclos PCR: Realizar 35 ciclo. 95ºC 67ºC 72ºC 30 segundos 30 segundos 60 segundos
Extensi n final 72ºC 10 minutos
Final 4ºC
1 por alumno
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 DETECCI N DE COVID-19 POR RT-qPCR

La RT-PCR retrotranscripci n es una PCR que se utiliza para generar fragmentos de
DNA, en este caso llamado cDNAa partir de muestras de RNA.
RESULTADOS
— Andrea: 2
—Dani: 1
— Cristina: 1
— Ana: 1
— María: 1
— Vanesa: 1
—Fuyundan: 1
—Víctor: 1
— Sandra: 0
— Marlon: 0

· 1: 2 bandas +
· 2: 1 banda no concluyente
· 3: 0 bandas -
· 4/1: 2 bandas +
· 5/2: 0 bandas -
· 6/3: 0 bandas -
· 7/1: 2 bandas +
· 8/2: 1 banda no concluyente
· 9/3: 0 bandas -
· 10/1: 2 bandas +
· 11/2: 1 banda no concluyente
· 12/3: 0 bandas -
· 13/1: 0 bandas -
· 14/3: 0 bandas -
· 15/1: 2 bandas +
· 16/3: 0 bandas -

Se realiza en el caso de virus RNA (se necesita previamente este paso).

Dado que las ADN polimerasas termoestables utilizan ADN como molde, para amplificar
ARN mediante PCR es necesario realizar:
1. Un paso de s ntesis de ADNc mediante una retrotranscriptasa (RT) o transcriptasa
inversa.
2. Un segundo paso en el que una ADN polimerasa termoestable utiliza el ADNc como
molde y lo amplifica.
Estos 2 pasos se pueden realizar en 2 tubos independientes o en el mismo tubo.

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 — En esta pr ctica se har una simulaci n de la t cnica de detecci n de Covid19

mediante la t cnica de PCR convencional.
— Para ello se suministrar n tres muestras de pacientes a los cu les se les realizar la
t cnica de PCR para poder ver si son positivos o no a Covid19.
— No es necesario realizar el paso previo para obtenci n de ADNc

COMPONENTES DEL KIT

• La Master Mix est preparada. Se deben pipetear las siguientes cantidades de reactivos
y muestra en cada tubo de reacci n:
REACTIVOS VOLUMEN
MIX PCR 22,5 ul
ADN (100-250 ng) 2,5 ul
Volumen total 25 ul
3 por alumno (Muestras 1, 2 y 3)

AMPLIFICACI N Y DETECCI N POR PCR DEL

LOCUSHUMANO D1S80
IMPORTANTE
— Mezclar bien, el colorante rojo incluido en la polimerasa facilita el proceso.
— Para la activaci n de la Polimerasa “HOT STAR” es necesario programar un paso de
desnaturalizaci n inicial de 10 minutos a 95ºC.
— El producto de la PCR puede ser sembrado directamente en un gel de agarosa al 1%,
ya que el colorante rojo act a como tamp n de carga.

DETECCI N DE COVID-19 POR RT-qPCR

PROGRAMA PCR Covid-19
PASOS Tª TIEMPO
Desnaturalizaci n HOT STAR 95ºC 10 minutos
Ciclos PCR: Realizar 35 ciclos 95ºC 62ºC 72ºC 30 segundos 30 segundos 45 segundos
Extensi n final 72ºC 10 minutos
Final 4ºC
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 PR CTICA 9: BIOINFORM TICA

FUNDAMENTO TE RICO

Con el t rmino “bioinform tica” nos referimos a un grupo de herramientas inform ticas
que han surgido a partir de los descubrimientos cient ficos y t cnicos y que son de gran
utilidad a la hora de realizar estudios en Biolog a Molecular.
Existen bases de datos donde los investigadores adjuntan informaci n relativa a sus
descubrimientos y que son de libre difusi n para que puedan ser utilizadas por otros
investigadores y t cnicos.
Existen varias categor as:

— Bases de datos primarias: informaci n bruta obtenida por ejemplo a partir de

una ultrasecuenciaci n.
— Bases de datos secundarias: resultan de la filtraci n de la informaci n para
facilitar el trabajo. Ej. Cat logos de mutaciones descritas para un tumor concreto.

Existen muchos tipos de bases de datos:

- De bibliograf a: “pubmed”
- De nucle tidos: “nucleotide”
- De genomas completos
- De prote nas
- Cl nico-gen tico: de mutaciones

Existen varios organismos que se encargan de crear y actualizar bases de datos. Deellos,
los m s importantes son:
- NCBI: National Center of Biotechnology Information (USA)
- EMBL: European Molecular Biology Laboratory (Heidelberg, Alemania) - DDBJ: DNA
Data Bank of Japan

OBJETIVO DE LA PR CTICA

En esta pr ctica buscaremos secuencias de genes en diferentes bases de datos. Para

ello disponemos de varias herramientas:
- Base de datos Nucleotide-GenBank de NCBI
- Base de datos ENSEMBL de EMBL
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 A TENER EN CUENTA

LAS SECUENCIAS APARECEN SIEMPRE ESCRITAS EN DIRECCI N 5’-3’ POR

CONVENIO. LA COMPLEMENTARIA LA TENEMOS QUE DEDUCIR NOSOTROS O CON
LA AYUDA DE ALGUNAS HERRAMIENTAS INFORM TICAS.

Vamos a realizar b squedas de secuencias de nucle tidos que tengan relaci n con la
Protein Kinase que son un tipo de prote nas que intervienen en la fosforilaci n de otras
prote nas en la especie Mus musculus.

1. Utilizando la columna de filtros, filtrar los resultados de la base de datos RefSeq y

cuya revisi n ha sido realizada a partir del a o 2019.

a. ¿Cu ntos resultados aparecen?

Aparecen 2360.

2. Eliminar los filtros aplicados y entrar en el registro con n mero de acceso

a. ¿De qu tipo de mol cula se trata, ADN o ARN? ¿Cu l es su longitud?

ARN mensajero, 1510 pares de bases.

b. ¿Cu ntos amino cidos tiene la prote na que codifica?

480 aminoácidos.

Ahora realiza una b squeda con el n mero de acceso AH002844.2.

1. ¿Cu l es el t tulo del registro?

INS, gen complete.

2. ¿De qu tipo de secuencia se trata, ADN o ARN?¿Cu l es su longitud?

ADN copia y tiene 4960 pares de bases.

3. ¿Qu posici n ocupa el gen de la insulina en la secuencia?

Entre 2100 y casi 5000 par de bases.

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 4. ¿Cu ntos exones tiene el gen de la insulina?¿Qu posiciones ocupan en la
secuencia?

Posee una cantidad de dos expones, el 1º en el sitio 2180 hasta la 2230.

Posee una cantidad de dos expones, el 2º en el sitio 3400 y 3600.

5. ¿Cu ntos amino cidos tienen la prote na de la insulina?

110 aminoácidos posee la insulina eucariota/humana.

Realizamos una b squeda de la insulina humana en la base de datos “protein”.

1. ¿Cu ntos amino cidos tiene la insulina humana?

110 aminoácidos posee la insulina eucariota/humana.

Entra en el n mero de identificaci n que aparece en el campo DBSOURCE para

entrar en la ficha del gen de la insulina y responde:

2. ¿Cu ntos nucle tidos tiene el gen de la insulina humana?

Posee una cantidad de casi 5000 nucleótidos.

3. Teniendo en cuenta que la prote na se obtiene de la regi n codificante (CDS),

¿c mo averiguar as a partir de esta fiche el n mero de amino cidos que tiene la insulina?

2610 — 2424 / 186 + 145/331 (nº de pares de bases que corresponde al gen de la
insulina).
3313 110 (cantidad de aminoácidos del gen de la insulina)

Utilizamos ahora la base de datos PDB (Protein Data Bank) para visualizar la estructura
tridimensional de la insulina. Buscamos insulin human y pinchamos en la ficha “3I3Z”.

1. ¿Cu les la longitud de la secuencia de la cadena A y de la B?

A = 21
B = 30

2. Utiliza el visor 3D para visualizar la estructura tridimensional de la insulina.

3. ¿En qu cromosomas se encuentra el gen de la insulina?

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 Por ltimo vamos a dise ar primers para PCR con la herramienta Primer Blast.
Buscamos un registro con n mero de acceso NW_004057899.1.
Copiamos el archivo el formato Fasta.

1. Dise a unos primers atendiendo a las siguientes caracter sticas:

— El amplic n ha de tener entre 100 y 500 nucle tidos.

— El programa nos ha de devolver un m ximo de 5 resultados. o La Tm ptima de los
primers ha de ser de 62±3oC.
— La base de datos ser Refseq Representative Genomes de o Canis familiaris.
— El tama o de los primers ser de 22±5 nucle tidos.
— El porcentaje de GC estar entre 40 y 60%

2. ¿Con qu par de primers obtenemos el amplic n m s largo?

Primeros primers

3. ¿En qu posiciones empiezan y acaban los primers del par n mero 5?

Empezando en el 3740 y finalizando en el 3760.

4. ¿Qu par de primers muestra la mayor diferencia en porcentaje GC?

Los primeros primers por el forward que poseen siendo así un 55% y al contrario un 50%.
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 PR CTICA OBTENCIÓN DE UN
CARIOTIPO HUMANO
• CULTIVO EN MEDIO PARA LINFOCITOS (FITOHEMAGLUTININA)
• SINCRONIZACI N
• FIJACI N DE CROMOSOMAS Y EXTENSI N EN PORTA
• TINCI N BANDEO G

FUNDAMENTO TEÓRICO
Crecimiento de microorganismos como las bacterias y la levadura, o de células humanas,
vegetales o animales en el laboratorio. Los cultivos celulares pueden usarse para
diagnosticar infecciones, para probar medicamentos nuevos y para la investigación.

OBJETIVO
Crecimiento de microorganismos como las bacterias y la levadura, o de células humanas,
vegetales o animales en el laboratorio. Los cultivos celulares pueden usarse para
diagnosticar infecciones, para probar medicamentos nuevos y para la investigación.

CULTIVO EN MEDIO PARA LINFOCITOS

(FITOHEMAGLUTININA)
DISPOSICI N CULTIVO
1. En esterilidad a adir hasta 0,5 ml de sangre a un tubo de cultivo o poner 5 ml de
medium en un matraz T-25 y a adir el muestra.
2. Cerrar la tapa del tubo de cultivo o del matraz.
3. Resuspender adecuadamente la suspensi n e incubar a +37°C poniendo el tubo
horizontalmente (en la porci n lisa). No se necesita a adir CO2

SINCRONIZACI N
SINCRONIZACI N CULTIVO
1. Despu s de 48 - 72 horas de cultivo, a adir 0.1 ml de soluci n A e incubar toda la
noche.
2. Despu s de la incubaci n, a adir 0.1 ml de soluci n B e incubar durante 5 horas (no es
necesario lavar las c lulas).
3. A adir 50 µl de Colcemid (10 µg/ml) e incubar a +37°C durante 1 hora
aproximadamente. La incubaci n se puede reducir a 15 minutos para obtener un alto
n mero de prometafases.
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 FIJACI N DE CROMOSOMAS Y EXTENSI N EN PORTA

1. Despu s de la incubaci n, si necesario transferir la suspensi n en un tubo de 15 ml y
centrifugar 3 - 4 minutos a 2.000 rpm (alta velocidad de centrifugaci n no da a las
c lulas).
2. Retirar el sobrenadante, prestando atenci n a no perder parte del pellet celular (se
recomienda conservar aproximadamente 0.5 ml de suspensi n en el tubo).
3. Resuspender en rgicamente el pellet.
4. A adir 5 ml de soluci n hipot nica (H2O destilada, 0,56% KCl) y resuspender
adecuadamente.
5. Incubar durante al menos 7 minutos a temperatura ambiente.
6. Centrifugar durante 3 – 4 minutos a 2.000 rpm.
7. Retirar el sobrenadante como en el punto 2.
8. Resuspender en rgicamente el pellet.
9. A adir 5 ml de soluci n de Ibramov (H2O destilada, 5% cido ac tico).
10. Centrifugar inmediatamente durante 3 -4 minutos a 2.000 rpm.
11. Retirar el sobrenadante como en el punto 2.
12. Resuspender en rgicamente el pellet.
13. A adir 5 ml de soluci n de fijaci n fresca (metanol o etanol: cido ac tico, 3:1) y
resuspender adecuadamente.
14. Repetir puntos 10-13.
15. Centrifugar inmediatamente durante 3 -4 minutos a 2.000 rpm.
16. Con atenci n retirar la mayor parte del sobrenadante.
17. Resuspender el pellet en algunas gotas de soluci n de fijaci n fresca, para obtener
una concentraci n celular adecuada.
18. Echar algunas gotas en una peque a parte de suspensi n celular en un cristal limpio y
h medo.
19. Proceder al secado en condiciones adecuadas y constantes de temperatura y
humedad relativa empleando Optichrome

CULTIVO Y SINCRONIZACI N DE C LULAS DE SANGRE

PERIF RICA
0,5 ml SANGRE + 5 ml MEDIO
0,1 ml REACTIVO SINCRONIZACI N A
0,1 ml REACTIVO SINCRONIZACI N B
48 - 72 horas
1 noche
+ 50 ml COLCEMID (17:30 h.)
FIJACI N CROMOSOMAS Y PREPARACI N CRISTAL
SACRIFICIO DEL CULTIVO
5 horas
1 hora
45 min.
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 FIJACI N DE LOS CROMOSOMAS Y EXTENSI N EN PORTA
POR GOTA
3-4 min. A 2.000 rpm
A ADIR 5 ml KCL 0,56%
Eliminar sobrenadante con pipeta dejando 0,5 ml y resuspender

CHOQUE HIPOT NICO

3-4 min. A 2.000 rpm
Eliminar sobrenadante con pipeta dejando 0,5 ml y resuspender
A ADIR 5 ml de soluci n Ibramov y resuspender
3-4 min. A 2.000 rpm
Eliminar sobrenadante con pipeta dejando 0,5 ml y resuspender
INCUBAR A Tª AMBIENTE
7 minutos

FIJACI N DE LOS CROMOSOMAS Y EXTENSI N EN PORTA

POR GOTA
A ADIR 5 ml SOLUCI N DE CARNOY FRESCA Y RESUSPENDER
3-4 min. A 2.000 rpm
REALIZAR EXTENSI N MEDIANTE LA T CNICA GOTA SOBRE PORTA:
Dejar caer 1 o 2 gotas sobre porta mantenido en Metanol y humedecido previamente con
agua fr a
(Realizar el mayor nº posible de extensiones)
ELIMINAR LA MAYOR PARTE DE SOBRENADANTE Y RESUSPENDER EN UNAS
GOTAS DE CARNOY
SOLUCI N DE CARNOY: Fijador Metanol: cido ac tico (3:1)
REPETIR 2 VECES

ENVEJECIMIENTO DE LAS EXTENSIONES

DEJAR SECAR LAS EXTENSIONES DURANTE 4 D AS A TEMPERATURA AMBIENTE
ELIMINACI N DE RESTOS DE FIJADOR Y HUMEDAD RESIDUAL
TINCI N Y BANDEO CROMOS MICO

PROCEDIMIENTO DE BANDEO G (GTG)

1. Sumerge las preparaciones envejecidas en una soluci n de tripsina al 0,1% en PBS
durante 10-15 segundos. (*)
2. Lava dos veces en PBS.

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 3. Sumerge las preparaciones en una soluci n de giemsa al 3% en tamp n fosfato a pH

6,7 durante 5 minutos. (**)
4. Lava con agua y deja secar.

*El tiempo de digesti n con tripsina depende del grado de envejecimiento de las
preparaciones, por lo que se puede aumentar gradualmente si no se obtiene un buen
resultado hasta conseguir bandas n tidas.
** El tiempo de tinci n con giemsa se puede aumentar hasta conseguir un buen contraste.

TINCI N Y BANDEO CROMOS MICO

REACTIVO PBS
• NaCl10gKCl0,25g
• Na2HPO4 1,44 g KH2PO4 0,25 g • Agua destilada hasta 1000 ml
Tamp n fosfato pH 6,7
• Soluci n A:
• Na2HPO4946mg
• Agua destilada hasta 100 ml
• Soluci n B:
• KH2PO4907mg
• Agua destilada hasta 100 ml
• Soluci n de trabajo:
• 43 ml de soluci n A + 57 ml de soluci n B

TINCI N:
(Por parejas, primero un alumno y luego otro).
• Tinci n por inmersi n en una cubeta de tinci n de vidrio con soluci n de giemsa: 5 min.
• Se introducen los portaobjetos en las cubetas y se sumergen.
• Se sacan de la cubeta y se sumerge en una cubeta con agua destilada varias veces
para su lavado por inmersi n
• Preparar 2 cubetas con agua
• Se dejan secar.

DIGESTI N CON TRIPISINA Y LAVADO EN PBS:

• Cada alumno recoge sus preparaciones.
• Sumerge las preparaciones en soluci n de tripsina (0,05%) durante 10-15 segundos.
• Pasar de UNO a UNO para realizar la digesti n de tripsina por inmersi n.
• A continuaci n realiza el lavado mediante inmersi n en PBS por 2 veces.
• 4 preparaciones por alumno

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 OBTENCI N DEL CARIOTIPO

VISUALIZACI N AL MICROSCOPIO:
• EMPEZAMOS POR EL OBJETIVO DE 4X 10X HASTA LOCALIZAR UN CARIOTIPO
ADECUADO.
• FINALMENTE PASAMOS AL OBJETIVO 100X (inmersi n).
• ENFOCAMOS Y REALIZAMOS FOTOGRAF A.
• SE IMPRIME LA IMAGEN DE LAS MEJORES METAFASES FOTOGRAFIADAS.
• SE RECORTAN Y SE ORDENAN POR PAREJAS PARA ELABORAR EL CARIOTIPO

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