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Electroforesis con geles de poliacrilamida (PAGE)

No la vamos a utilizar hoy, pero la vamos a para que la tengan


clara. Es un gel poroso al igual que la agarosa, el tamao del
poro se puede controlar dependiendo de la cantidad que uno
agregue.
La tcnica ms utilizada es la electroforesis con SDS, que es un
detergente. Este forma complejos, y carga negativamente las
protenas. De tal manera que corren hacia el electrodo positivo.
Al ser un gel poroso se separan por tamao y no por carga.
Migran verticalmente, las grandes quedan arriba y las pequeas
quedan ms abajo. De igual forma con esta tcnica se puede
calcular el tamao.
SDS: Detergente aninico que se asocia a las protenas formando complejos desnaturalizados
con carga negativa.

La cantidad de SDS unido a las protenas es proporcional a su tamao.

La cadena proteica es distendida y solubilizada en el detergente.

Relacin carga/masa constante para todas las protenas (no interviene carga propia).

Separacin basada en la masa molecular de las protenas.

Menor masa = mayor movilidad

Mayor masa = menor movilidad

En el laboratorio de hoy vamos a hacer electroforesis de zona con membranas de poliacetato de


celulosa y inmunoelectroforesis. Las muestras a utilizar son; un suero equino completo,
inmunoglobulinas purificadas con cido caprlico (pool) e inmunoglobulinas obtenidas por
cromatografa de afinidad.
Electroforesis de zona con membranas de poliacetato de Celulosa
Preparacin del sistema
Hidratar la membrana sumergindola en el
buffer de electroforesis. Utilizando los canales
que hay a los lados de la cmara. Mnimo por 10
min.
Manejarla con pinzas. Para no contaminar la
membrana.
Para observar por dnde va la corrida debemos
agregar unos granos de azul de bromofenol.
Llenar la cmara con buffer, en contacto con los electrodos positivos y negativos.
Sacar la membrana y colocarla sobre una hoja de papel secante o papel filtro.
Secar el exceso de lquido del centro de la membrana cuidadosamente, sin que se seque
el medio por completo.
La muestra se aplica sobre la membrana con un aplicador (5 o 6 l), cada muestra en
diferente canal. El aplicador se utiliza bajando suavemente la palanca.

La membrana se coloca en la cmara. Como las membranas son largas no es necesario colocar
papel filtro, la muestra se debe colocar en el centro y se corren a 180 voltios durante 20-30
minutos. Hasta que corra 3-4 cm.
Luego apagamos el equipo, sacamos la
membrana con pinzas, y la colocamos en
colorante Ponceau-S por 30 minutos y
decoloramos con agua. Nota: En el lab lo
dejamos mucho menos tiempo.
Tambin se puede usar negro almidn como
colorante, que se decolora con acido actico.
Inmunoelectroforesis
Se trabaja por lado de mesa.
Para que la agarosa se adhiera bien es necesario hacer una sobre capa, primero se coloca una
capa delgada de agar 0.5% disuelto en agua destilada, que se deja secar en el horno para que
se deshidrate y luego chorreamos una capa ms gruesa.

Primero se prepara la agarosa al 1% con el buffer que tienen en la mesa. Aproximadamente son
10 mL. Que no queden irregularidades en el gel, y que el grosor sea constante.
Luego se abren 3 hoyos para colocar las muestras, y en cada una colocan 30 l de muestra. Esta
corrida dura 30 minutos aproximadamente.
Luego, cuando termina la electroforesis se abre un
canal entre cada dos muestras.
Y en ellos
agregamos aproximadamente 50 l de suero
antiglobulinas.
Luego lo guardamos en una cmara hmeda y lo
vemos el lunes.
El reporte se hace por mesa con los resultados de cada uno, recuerden tomar fotos para pegarlas
en el reporte. Los dos reportes se entregan juntos.