Departamento de Biotecnología

Licenciatura en Biotecnología
Cátedra: Inmunotecnologías (45B)

PRÁCTICA N° 4: Lisado de plaquetas

Unidad programática: Unidad 7. Potencialidades y líneas de desarrollo de las

inmunotecnologías.

OBJETIVOS
1. Obtener plasma rico en plaquetas (PRP) mediante centrifugación de sangre total.
2. Aplicar la metodología de congelación-descongelación (freeze-thaw) para el lisado de
plaquetas (PL).

MATERIALES Y REACTIVOS
Para la lisis
● Tubos de 5-10ml para colecta de ● Tubos de 1,5 ml estériles
sangre con anticoagulante ● Microcentrífuga
● Sangre fresca ● Congelador de -80°C
● Micropipetas de 10, 200 y 1000uL ● Baño María o placa térmica
● Parafilm ● Guantes de nitrilo y para -80°C

Para la observación
● Aislado de leucocitos ● Agua destilada
● Portaobjetos limpios ● Etanol 70%
● Micropipetas de 10ul ● Microscopio invertido
● Tinciones Giemsa y May-Grûnwald

METODOLOGÍA
1. Colocar 10 ml de sangre en un tubo estéril con tapa conteniendo anticoagulante
(heparina, EDTA o citrato de sodio 3,8%). Mezclar gentilmente por inversión, de 5-10 veces,
para distribuir el anticoagulante.

2. Centrifugar por 5 minutos a 900 ×g, y luego por 10 minutos a 1000 ×g, a temperatura
ambiente. Se obtienen tres capas: la inferior corresponde a eritrocitos, la intermedia
corresponde a leucocitos, y la superior al plasma enriquecido en plaquetas y factores de
crecimiento. Por cada 10 ml de sangre extraída se obtienen entre 1,5-2ml de PRP.

3. El plasma luego es separado mediante extracción con micropipeta (o aguja y jeringa

estéril), de forma muy cuidadosa para no crear turbulencias en las fracciones obtenidas. La
fracción de plasma más rico en plaquetas y factores de crecimiento (PRGF) son los 500 ul
que se encuentran directamente por sobre la fase leucocítica. Alicuotar en tubos de 1,5 ml
(Eppendorf) bien identificados.
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4a. Introducir las alícuotas en congelador a -70°C por 10 minutos. Cumplido el tiempo,
pasar a baño térmico a 37°C por 7,5 minutos. Repetir el ciclo 5 veces. Al terminar,
centrifugar a 1400 ×g por 40 minutos para eliminar restos celulares (debris). Almacenar
300ul del sobrenadante (que contiene el PL sin debris) a -20°C, nombrando a cada
preparado con las letras del alfabeto (Grupo 1 = A; Grupo 2 = B, Grupo 3 = C… hasta F).

4b. En forma paralela al paso 4a, aislar la fase leucocítica cuidadosamente con una
micropipeta de 10ul, y recoger una gota sobre el extremo de un portaobjetos. Aplicar el
protocolo de la Práctica Nº 1 (Caracterización de células sanguíneas) para identificación de
leucocitos por tinción Giemsa/May-Gründwald. Observar en microscopio invertido para
confirmación de la separación.

5. El lisado será utilizado como suplemento en cultivos primarios de leucocitos (cátedra de

Cultivos celulares).

CUESTIONARIO
1. ¿En qué consiste el sistema de aislamiento de células por gradiente de Ficoll?
2. ¿Cuál es la diferencia entre suero y plasma?
3. ¿Qué utilidades posee cada fracción de la sangre (plasma, suero, células blancas y rojas)
para investigación o servicios?