Estudio Cinético de la

Bromelina
Juan Felipe Amaya Luna y Julián Camilo Vargas
 Unidad de digestión de Caseina
• Una Unidad de Caseína (CDU) es definida como la cantidad de enzima
necesaria para liberar 1 µg de L-tirosina luego de un minuto de digestión de
caseína estándar como sustrato a pH 7.7 y 60°C
 Reacción a Estudiar

Bromelina L- Tirosina

Caseína

Ilaria B, Marco E, Katia L, Maria Vittoria GA. Pineapple stem bromelain immobilized on different supports: catalytic properties in model wine, Journal Biotechnol Prog. 2012 Nov-
Dec;28(6):1472-7. doi: 10.1002/btpr.1639. Epub 2012 Nov 1.
 Extracción Y Purificación
Método Propuesto Método Empleado
Pesar y lavar 25 g de la Pulpa y Corazón de la piña
Pesar y lavar 100 g de la Pulpa de la piña

Macerar y almacenar a -4°C durante 60 minutos

Obtener el jugo a través de Licuado

Tratar muestra con Solvente Acetona 75% v/v en relación 1:1

Añadir Buffer Fosfatos 0,1M ,15 mM Cisteina

Centrifugar a 6000 rpm durante 10 minutos y EDTA 2mM pH 7.7 en relación 1:1 p/p

Descartar Precipitado (Fracción de azucares de bajo peso molecular) Centrifugar a 6000 rpm durante 10 minutos
(Dos veces)
Añadir Acetona en Relación 1:0,5 y almacenar durante 7 días a -4°C
Descartar Precipitado (Fracción de azucares de bajo
Centrifugar a 8500 rpm durante 10 minutos, El precipitados disolver en agua
peso molecular)
desmineralizada y llevar a un volumen de 30 mL
 Cuantificación de la enzima
Curva de Calibración método U.V Cálculos
Abs vs Concentracion Caseina 0.506 𝑈𝐴 + 0.0522 𝑈𝐴 𝑚𝑔
= 0.43 𝑒𝑥𝑡𝑟𝑎𝑐𝑡𝑜 𝑑𝑖𝑙𝑢𝑖𝑑𝑜
1,2 1.3047 𝑈𝐴 ∗ 𝑚𝐿 𝑚𝐿
1
𝑚𝑔

0,8 Dilución: 150µL → 3mL

Abs

0,6
y = 1.3047x - 0.0522
0,4 0.43 𝑚𝑔 3000µL
𝑒𝑥𝑡𝑟𝑎𝑐𝑡𝑜 𝑑𝑖𝑙𝑢𝑖𝑑𝑜 ∗
0,2
𝑚𝐿 150µL
0 8.56 𝑚𝑔
0,00 0,10 0,20 0,30 0,40 0,50 0,60 0,70 0,80 0,90 = 𝑑𝑒 𝑏𝑟𝑜𝑚𝑒𝑙𝑖𝑛𝑎
Concentracion (mg/mL) 𝑚𝐿
 Inmovilización
• Inmovilización de la enzima Bromelina
La inmovilización de la Bromelina se llevara a cabo sobre Alginato. 5 ml del extracto de enzima serán
adicionados sobre la solución de alginato y se dejaran en agitación vigorosa durante 30 minutos
Posteriormente se pasara la mezcla a una probeta y se adicionara gota a gota a una solución de Cloruro
de calcio en presencia de agitación suave

Muestra de cálculo A

5𝑚𝑙 𝐸𝑥𝑟𝑎𝑐𝑡𝑜 𝑔 𝑏𝑟𝑜𝑚𝑒𝑙𝑖𝑛𝑎 0,167𝑔 𝑏𝑟𝑜𝑚𝑒𝑙𝑖𝑛𝑎

= 0,00198 𝑚𝑙 ∗ 8,56 =
253 𝑝𝑒𝑟𝑙𝑎𝑠 𝑃𝑒𝑟𝑙𝑎 𝑚𝑙 𝑒𝑥𝑡𝑟𝑎𝑐𝑡𝑜 𝑝𝑒𝑟𝑙𝑎
 Efecto Concentración de la Enzima

Enzima sin inmovilizar Enzima inmovilizada

Efecto Concentracion de La enzima Efecto concentracion Enzima
1,200 0,8
0,7
1,000
0,6
0,800
0,5
Abs

Abs
0,600 0,4

0,400 0,3
0,2
0,200
0,1
0,000 0
0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1 1,1 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18
mL extracto Crudo Numero De Perlas

Perlas Perlas reutilizadas

 Tiempo Optimo de Reacción
Enzima sin inmovilizar
Enzima sin Inmovilizar (Literatura)
Abs vs tiempo de reacción (min)
1,05
1,04
1,03
1,02
abs

1,01
1
0,99
0,98
0,97
0 10 20 30 40 50 60 70
tiempo (min)
 Tiempo Optimo de Reacción

Enzima sin Inmovilizar Enzima Inmovilizada

Abs vs tiempo de reacción (min) Abs vs tiempo de reacción
1,05 0,245
1,04 0,24
1,03 0,235
0,23
1,02
0,225
abs

abs
1,01
0,22
1
0,215
0,99 0,21
0,98 0,205
0,97 0,2
0 10 20 30 40 50 60 70 0 5 10 15 20 25
tiempo (min) tiempo (min)
 PH optimo de Reacción
Enzima sin inmovilizar
Enzima Sin Inmovilizar (Literatura)
Abs vs pH optimo
1,050
1,000
0,950
0,900
0,850
abs

0,800
0,750
0,700
0,650
0,600
0 2 4 6 8 10 12
pH

Grafica tomada de Corzo.C, Waliszewski.K, Welti-Chanes.J, Pineapple fruit bromelain affinity to different protein substrates, 2011 Journal Food Chemistry
133 (2012) 631–634
 PH optimo de Reacción

Enzima Sin Inmovilizar Enzima Inmovilizada

Abs vs pH optimo Abs vs pH optimo
1,050 0,300
1,000
0,250
0,950
0,900 0,200
0,850

ABS
abs

0,150
0,800
0,750 0,100
0,700
0,050
0,650
0,600 0,000
0 2 4 6 8 10 12 0 2 4 6 8 10 12
pH pH
 Temperatura Optima de Reacción
Enzima sin Inmovilizar
Enzima sin inmovilizar (Literatura)
Abs vs temperatura de reacción
1,600
1,400
1,200
1,000
abs

0,800
0,600
0,400
0,200
0,000
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
temperatura °C

Grafica tomada de Corzo.C, Waliszewski.K, Welti-Chanes.J, Pineapple fruit bromelain affinity to different protein substrates, 2011 Journal Food Chemistry
133 (2012) 631–634
 Temperatura Optima de Reacción

Enzima sin inmovilizar Enzima Inmovilizada

Abs vs temperatura de reacción Abs vs Temperatura de reaccón
1,600 0,500
1,400 0,450
0,400
1,200
0,350
1,000 0,300
abs

abs
0,800 0,250
0,600 0,200
0,150
0,400
0,100
0,200 0,050
0,000 0,000
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
temperatura °C temepratura °C
 Efecto Concentración de Sustrato

Enzima sin inmovilizar Enzima inmovilizada

1/v vs 1/[S] 1/v vs 1/s
12,000 80
70
10,000
60
8,000
50
1/V

1/v
6,000 40
30 y = 4,862x + 0,9784
4,000 y = 0,156x + 6,821
20
2,000
10
0,000 0
0,000 5,000 10,000 15,000 20,000 25,000 0 2 4 6 8 10 12 14 16
1/[s] 1/[s]

Km = 0,023 ; Vm = 0,147 Km = 4,95 ; Vm = 1,022

 Conclusiones
• La inmovilización de bromelina le confiere una mayor estabilidad acondiciones de pH y
tiempo de reacción además de la posibilidad de reutilizar la enzima, pero teniendo como
desventaja una disminución de la actividad y afinidad por el sustrato en comparación a la
libre
• La separación utilizando el buffer de extracción 0.1M tampón fosfato, 15mM de cisteína y
EDTA 2mM, pH 7, resulto poco selectivo para extraer bromelina a partir de una muestra de
fruto de la piña, dado las evidencias de presencia de proteínas no enzimáticas
• El pH y tiempo óptimo de reacción para la enzima libre es de 7.7 y 10 minutos
respectivamente. La condición de temperatura no pudo ser determinada al estar la proteínas
no enzimáticas del extracto desnaturalizándose y absorbiendo a 280nm