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TITULO
AISLAMIENTO E IDENTIFICACIN DE MICROORGANISMOS
DE LA MATRIZ AMBIENTAL: __________________
Suelo
ASESORA
Dr. ROSA RICO MATA
DATOS DE IDENTIFICACIN DE LOS ANALISTAS
Fecha de inicio del anlisis: 29 DE JUNIO DE 2015
Fecha de trmino: 10 DE JULIO DEL 2015
Nombre
MARTN DEL CAMPO ORTZ ISRAEL
Cargo
Responsable
Administrador
Laboratorista 1
Laboratorista 2
Laboratorista 3
GENERACIN: 2014-2016
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SITIO DE
MUESTREO
Len Gto.
Coordenadas:
21 5'10.97"N
10142'35.19"O
Fecha: 11/06/15
Hora: 10:34 am
2.Parmetros Fisicoqumicos
Color: caf oscuro
pH: 6.5
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AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS
1. Justificacin del proceso para la identificacin bacteriana
A partir de la aplicacin de una marcha bioqumica, es decir, en la identificacin de una bacteria, nos es
posible conocer sus procesos metablicos lo que nos permite obtener un amplio panorama de cmo muchos
microorganismos actan en las diferentes matrices ambientales como lo es el suelo, ya sea degradando
contaminantes o simplemente absorbindolos para que estos tengan un impacto menor al medio ambiente o no
causen daos a la salud pblica.
El proceso realizado para la identificacin de una bacteria en la matriz de suelo se realiz con la finalidad de
poner en prctica la realizacin de una marcha bioqumica que en funcin de la bacteria aislada tendra en los
distintos medios de cultivo un comportamiento especfico del cual es factible interpretar su metabolismo y
conocer su interaccin con el medio ambiente.
2. Dos medios de siembra (Nombre y Receta)
1. Agar Rojo y bilis violeta
(contenido por litro de preparacin)
Extracto de levadura- 3 g
Peptona- 7 g
Lactosa- 10 g
Mezcla de sales biliares- 1.5 g
Cloruro de sodio- 5 g
Agar- 15 g
Rojo neutro- 0.03 g
Cristal violeta- 0.002 g
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Imagen
Imagen
Colonias de Pseudomonas
aeruginosas
Colonias de Pseudomona
aeruginosa
2. Agar E.M.B
(Contenido por litro de preparacin)
Peptona- 10 g
Lactosa- 5 g
Sacarosa- 5 g
Fosfato dipotsico- 2 g
Eosina- 0.4 g
Azul de metileno- 0.065 g
Agar- 13.5 g
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Imagen
Imagen
Colonias de Pseudomonas
aeruginosas
Colonias de Pseudomonas
aeroginosas
4. Procedimiento de Aislamiento
(describir detalladamente la cantidad de materiales y los pasos a seguir)
Materiales/Reactivos/Medios de cultivo/ Equipo a utilizar
2 Cajas Petri
- Agua destilada
1 Isopo estril
Matraz Erlenmeyer de 250 mL
- Agar E.M.B
1 Asa bacteriolgica
-Agar rojo bilis
1 Esptula
violeta
1 Piceta
-Algodn
1 Charola de pesado
-Papel aluminio
1 Agitador
-Tijeras
1 Probeta de 100 mL
1 Mechero Bunsen
-1 Incubadora
- 1 Refrigerador
- 1 Autoclave
- 1 Balanza analtica
- 1 Campana de
flujo laminar
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3. Colocar las cajas Petri con inoculadas de medio Rojo bilis violeta en la incubadora (muestra y blanco) a
una temperatura de entre 35 y 37 C durante 18-48 horas.
4. Observar el crecimiento y morfologa de los microorganismos y elegir la colonia que cumpla con las
caractersticas del microorganismo a aislar.
5. Esterilizar un asa bacteriolgica, tomar un poco de colonia y estriar el medio selectivo agar E.M.B,
esterilizar nuevamente el asa.
6. Cerrar la placa y colocarla nuevamente en la incubadora junto con el blanco durante un intervalo de 1848 horas.
7. Observar el crecimiento microbiano en la placa, llevar a refrigeracin para evitar ms crecimiento hasta
la realizacin de la marcha bioqumica y verificar en la bibliografa el microorganismo aislado.
MICROBIOLOGA AMBIENTAL UTL
ASESORA:
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Bacterias
Gram positivas
Citrato +
Lactosa Sacarosa Glucosa Indol Catalasa +
H2S RM VP -
-Pseudomona
aeruginosa
Gram negativas
Mviles
Capsuladas
No capsuladas
RM +
VP +
-Salmonella
arizonae
Citrato +
Lactosa Sacarosa Glucosa +
Indol Catalasa +
H2S +
RM VP -
No mviles
No capsuladas
Citrato +
Lactosa Sacarosa Glucosa +
Indol Catalasa +
H2S +
RM +
VP -
Capsuladas
Citrato +
Lactosa Sacarosa Glucosa +
Indol - (+)
Catalasa +
H2S +
RM VP +
-Klebsiella
pseudomoniae
-Citrobacter
-Salmonella
gallinarum
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FOTO 1
Morfologa:
Forma: irregular
Superficie: Irregular
Color: rosado-aperlado
Borde: ondulado
Tipo de colonia 2: Descripcin
FOTO 2
Morfologa:
Forma: puntiforme
Superficie: papilada
Color: negro cromado
Borde: circular
FOTO
Morfologa:
Forma: irregular
Superficie: convexa
Color: blanquecino
Borde: Rizoide
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FOTO 2
AGAR E.M.B
AGAR E.M.B
FOTO 3
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1.
Nombre de la
prueba
Medio de cultivo
utilizado
Resultado
obtenido
(positivo/negati
vo)
Tincin de
Gram
Ninguno
Negativo (-)
Evidencia fotogrfica
Aumento: ____100x____
Fundamento de la prueba
El cristal violeta (colorante catinico) penetra en todas las clulas bacterianas (tanto Gram positivas como Gram
negativas) a travs de la pared bacteriana. El lugol es un compuesto formado por I2 (yodo) en equilibrio con KI (yoduro
de potasio) y Sl (Siulterio), los cuales estn presente para solubilizar el yodo, y actan de mordiente, haciendo que el
cristal violeta se fije con mayor intensidad a la pared de la clula bacteriana. El I2 entra en las clulas y forma un
complejo insoluble en solucin acuosa con el cristal violeta.
La mezcla de alcohol-acetona que se agrega, sirve para realizar la decoloracin, ya que en la misma es soluble el
complejo I2/cristal violeta. Los organismos Gram positivos no se decoloran, mientras que los Gram negativos s lo
hacen. Para poner de manifiesto las clulas Gram negativas se utiliza una coloracin de contraste. Habitualmente es
un colorante de color rojo, como la safranina o la fucsina. Despus de la coloracin de contraste las clulas Gram
negativas son rojas, mientras que las Gram positivas permanecen violetas.
Algunos microorganismos retienen el colorante violeta, an despus de tratarlos con un decolorante, y el color no se
modifica al aadir ste; otros pierden con facilidad el primer tinte, y toman el segundo. Los que fijan el violeta, se
califican de Gram positivos, y los que pierden la primera coloracin y retienen la segunda, de gramnegativos.
Basndonos pues, en la reaccin Gram, podemos clasificar a los microorganismos en uno de los dos grupos. Los
colorantes de p-rosanilina son los que mejores resultados dan en la coloracin Gram. Los representantes ms usados
de este grupo son violeta de metilo y violeta cristal o de genciana. En realidad, violeta de metilo es el nombre atribuido
al compuesto tetrametil-p-rosanilina.
El matiz de color de la p-rosanilina se intensifica al aumentar el nmero de grupos metilo en la molcula; por
consiguiente, de los tres grupos, el tono ms oscuro es la hexametil-p-rosanilina, (violeta cristal), y el tinte ms ligero,
la tetrametil-p-rosanilina (violeta de metilo). Los nombres violeta de metilo 3R, 2R, R, B, 2B, 3B, etc., se refieren al
nmero de grupos metilo contenidos. La letra R indica matices rojos, y la letra B, tonos azules. El violeta de cristal
contiene seis grupos metilo, y se considera como el mejor colorante primario para teir por el mtodo de Gram.
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2.
Tincin
de
cpsula (
con tinta
china)
Ninguno
Positivo (+)
Aumento: ____100x____
Fundamento de la prueba
Es la prueba que determina si la bacteria tiene capsula la cual es una capa rgida organizada en matriz impermeable
que excluye colorantes como la tinta china. En cambio, la capa de material extracelular que se deforma con facilidad,
es incapaz de excluir partculas y no tiene un lmite definido.
En esta prueba se puede ver si la bacteria cuenta con cpsula la cual no permite que la tinta china penetre en la
bacteria lo cual se observa como un fondo negro (tinta) y una diferenciacin de las bacterias.
3. Citrato
Agar citrato de
Simmons
Positivo (+)
Fundamento de la prueba
En su formulacin contiene una mezcla de sales en la cual, el citrato de sodio es la nica fuente de carbono. No
posee azcares ni tampoco inhibidores del crecimiento bacteriano. Un microorganismo que es capaz de utilizar
el citrato como nica fuente de carbono, utiliza tambin las sales de amonio como su nica fuente de nitrgeno.
Debido a la utilizacin de sales de amonio, se libera amoniaco, que alcaliniza el medio, y esto produce un viraje
del indicador azul de bromo timol del color verde al color azul.
Los productos obtenidos del metabolismo del citrato dependen del pH del medio:
pH bsico: Citrato ------> CO2 + cido frmico + 2 cido actico
pH cido: 2 Piruvato -----> acetato + CO2 + lactato
2 Piruvato -----> acetona + 2CO2
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Muestra de cultivo
4. Catalasa
Ninguno.
control -
Positivo (+)
Fundamento de la prueba
La catalasa es una enzima perteneciente a la categora de las oxidorreductasas que cataliza la descomposicin
del perxido de hidrgeno en oxgeno y agua. Lo cual produce un desprendimiento de burbujas.
La reaccin que sucede es la siguiente:
2 H2O2 2H2 + 2 O2
Esta enzima se encuentra en algunas bacterias o cocos y se es posible identificar su presencia aplicado esta prueba.
5. Fermentacin
de glucosa
Triple Sugar
Iron Agar (T.S.I)
Negativo (-)
Fundamento de la prueba
En el medio de cultivo, el extracto de carne y la pluripeptona, aportan los nutrientes adecuados para el desarrollo
bacteriano. La glucosa es un hidrato de carbono fermentable, partiendo de la glucosa producida por la
degradacin de la sacarosa, a esta reaccin se le conoce como glucolisis. Se agrega un indicador de pH (rojo fenol)
y cloruro de sodio, el cual mantiene el balance osmtico. El agar es el agente solidificante. Por fermentacin de
azcares, se producen cidos, que se detectan por medio del indicador rojo de fenol, el cual vira al color amarillo
en medio cido.
C6H12O6 (glucosa)+ 2 Pi + 2ATP+ 2NAD+2 cido Pirvico+ 2ATP +2NADH+ 2H+
6. Fermentacin
de lactosa.
Triple Sugar
Iron Agar (T.S.I)
Negativo (-)
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Fundamento de la prueba
En el medio de cultivo, el extracto de carne y la Pluripeptona, aportan los nutrientes adecuados para el desarrollo
bacteriano. La lactosa es un hidrato de carbono fermentable, partiendo del cido pirvico producido por la
fermentacin de glucosa, dando como producto final cido lctico. Se agrega un indicador de pH (rojo fenol) y
cloruro de sodio, el cual mantiene el balance osmtico. El agar es el agente solidificaste. Por fermentacin de
azcares, se producen cidos, que se detectan por medio del indicador rojo de fenol, el cual vira al color amarillo
en medio cido.
cido Pirvico+ NADH+ H+ cido lctico+ NAD+
7. Fermentacin
de sacarosa
Negativo(-)
Fundamento de la prueba
En el medio de cultivo, el extracto de carne y la pluripeptona, aportan los nutrientes adecuados para el desarrollo
bacteriano. La sacarosa es un hidrato de carbono fermentable y asimilado por la enzima sacarasa la cual con una
adicin de agua se degrada en glucosa y fructuosa. El rojo de fenol es el indicador de pH, y el cloruro de sodio
mantiene el balance osmtico. El agar es el agente solidificante. Por fermentacin de azcares, se producen
cidos, que se detectan por medio del indicador rojo de fenol, el cual vira al color amarillo en medio cido.
Sacarosa (C12H22O11)+ H2O Glucosa (C6H12O6)+ Fructosa (C6C12O6)
8. cido
sulfhdrico
Agar SIM
Triple Sugar Iron
Agar (T.S.I)
Negativo(-)
Fundamento de la prueba
En el medio de cultivo, el tiosulfato de sodio es el sustrato necesario para la produccin de cido sulfhdrico, el
sulfato de hierro y amonio, es la fuente de iones Fe3+ , los cuales se combinan con el cido sulfhdrico y
producen sulfuro de hierro, de color negro. El agar es el agente solidificante. El tiosulfato de sodio se reduce a
sulfuro de hidrgeno que reacciona luego con una sal de hierro proporcionando el tpico sulfuro de hierro de
color negro.
La protelisis de las protenas en aminocidos individuales, algunas especies bacterianas son capaces de liberar
azufre enzimticamente de los diferentes aminocidos que las contienen, produciendo el gas cido sulfhdrico
(SH2). La peptona, cistena y tiosulfato, todos son fuentes de azufre, pero las diferentes especies utilizan distintos
compuestos o aminocidos que contienen azufre para producir SH2. La enzima responsable de esta actividad es
la cisteinasa.
MICROBIOLOGA AMBIENTAL UTL
ASESORA:
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El gas incoloro SH2 reacciona con una sal pesada, citrato frrico de amonio para producir un precipitado negro
insoluble, sulfuro ferroso.
Bacteria (medio cido) + tiosulfato de sodio gas SH2
SH2 + iones frricos sulfuro ferroso (pp. Negro)
9. Indol
Agar SIM
Negativo (-)
Fundamento de la prueba
El triptfano es un aminocido que puede ser oxidado por ciertas bacterias para formar tres metabolitos
principales: indol, escatol e indolactico. Diversas enzimas intracelulares que intervienen en ste proceso reciben
el nombre de triptofanasa, lo que implica el sistema completo de enzimas vinculadas con la produccin del indol.
El principal intermediario en la degradacin del triptfano es el cido indolprvico.
La degradacin del triptfano libera indol, cido pirvico, amoniaco y energa. El cido pirvico puede ser
nuevamente metabolizado por medio del ciclo glucoltico o entrar en el ciclo de Krebs para liberar CO2 y H2O y
una gran produccin de energa.
Triptfano + indolpirvico ----> Indol + cido pirvico + amoniaco + energa
10.
Movilidad
Agar SIM
Positivo (+)
Fundamento de la prueba
Determina si un organismo es mvil o inmvil. Las bacterias tienen movilidad por medio de sus flagelos, que se
encuentran principalmente entre los bacilos; sin embargo algunas formas de cocos son inmviles.
Las bacterias mviles pueden contener un solo flagelo o muchos; adems su localizacin vara con su especie
bacteriana y las condiciones de cultivo.
A veces, las bacterias con movilidad producen variantes no mviles que parecen ser estables y raramente se
revierten en formas mviles. Los organismos no mviles carecen de flagelos.
El agar es el agente solidificante y a esta concentracin le otorga al medio la propiedad de ser semislido,
condicin necesaria para detectar movilidad, que se evidencia por el enturbiamiento del medio o por crecimiento
que difunde ms all de la lnea de siembra del microorganismo en estudio.
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11. Voges
MR-VP
proskauer
(Fermentacin
alcohlica)
Negativo (-)
Fundamento de la prueba
Determina la capacidad de algunos organismos de producir un producto final neutro, la acetona a partir de la
fermentacin de glucosa.
La reaccin de VP se basa en la deteccin de acetona como producto final neutro derivado del metabolismo de
la glucosa. Esta es metabolizada en cido pirvico, intermediario clave en la gluclisis. A partir del cido pirvico,
una bacteria puede seguir muchas vas. La produccin de acetona (precursor de la produccin de 2,3-butanediol)
es uno de los ciclos para la degradacin de la glucosa en las bacterias.
KOH
condensacin
Alfa-naftol (catalizador) + Acetona -------------> Diacetilo + Ncleo de guanidina ----------------------> Color rojo
rosado
O2 oxidado
12. Rojo de
MR-VP
metilo
(fermentacin
de la glucosa
Negativo (-)
Fundamento de la prueba
Permite comprobar la capacidad de un organismo de producir y mantener estables los productos terminales
cidos de la fermentacin de la glucosa y vencer la capacidad amortiguadora del sistema. Es una prueba
cualitativa de la produccin de cido (determinacin de pH). Las bacterias que principalmente siguen la va de
fermentacin de cidos mixtos (La fermentacin cido mixta produce cido actico, etanol, H 2, CO2 y
proporciones diferentes de cido lctico o frmico segn las especies. Es un tipo de fermentacin que llevan a
cabo las enterobacterias. En esta ruta de fermentacin se produce ATP adems de la reoxidacin del NADH+H+)
a menudo producen suficiente cido para mantener un pH menor de 4.4.
La prueba de rojo de metilo se basa en el empleo de un indicador de pH para determinar la concentracin de
iones hidrgeno presentes cuando un organismo fermenta glucosa. Las bacterias RM positivas producen cidos
estables manteniendo una alta concentracin de iones hidrgeno hasta alcanzar cierta concentracin y entonces
cesa toda actividad.
Los organismos RM negativo tambin producen cidos pero tienen una menor concentracin de iones hidrgeno
porque hay una reversin hacia la neutralidad debida a la nueva degradacin de los cidos orgnicos en
carbonatos.
Ocurre la fermentacin de la glucosa, mediante la glucolisis que es la ruta metablica mediante la que se degrada
la glucosa hasta dos molculas de piruvato, a la vez que se produce energa en forma de ATP y de NADH.
C15H15N3O2 + fermentacin del carbohidrato ----> cidos orgnicos (viraje a rojo en el medio)
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A continuacin se presentan las tablas comparativas de los perfiles analizados y el que se obtuvo en nuestro
estudio:
Prueba
Bioqumica
Citrato
F. Lactosa
F. Glucosa
F. Sacarosa
Indol
Catalasa
H2s
R.M
VP
Capsula
Tincin de Gram
Movilidad
Perfil
Bioqumico
Salmonella
arizonae
(+)
( -)
(+)
(-)
(-)
(+)
(+)
(+)
(+)
(-)
(-)
(+)
Perfil Bioqumico
Pseudomona
aeruginosa
(+)
( -)
(-)
(-)
(-)
(+)
(-)
(-)
(-)
(+)
(-)
(+)
Perfil
Bioqumico del
microrganismo
a identificar
(+)
(-)
(-)
(-)
(-)
(+)
(-)
(-)
(-)
(+)
(-)
(+)
2.
Caractersticas generales
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Pseudomona aeruginosa es una bacteria Gram-negativa perteneciente a la rama de las proteobacterias, misma
a la que pertenecen las enterobacterias. La P. aeruginosa se encuentra ampliamente distribuida en la naturaleza.
Se puede aislar de muestras de suelo, aguas prstinas y contaminadas, as como de plantas y animales. Esta
bacteria es capaz de utilizar una enorme variedad de compuestos orgnicos como sustrato para crecer, capacidad
que le permite colonizar nichos en los que son escasos los nutrimentos que otros organismos pueden asimilar.
Se ha reportado el aislamiento de P. aeruginosa de ambientes tan inhspitos como son el combustible de avin,
soluciones de clorhexidina y el jabn.
4. Ciclo(s) biogeoqumicos en el(los) que intervienen
Ciclo del carbono y del nitrgeno
5. La funcin que juegan en la transformacin de la materia orgnica a travs
de los ciclos biogeoqumicos
El metabolismo de la Pseudomona aeruginosa puede ser aerobio en el que se usa como aceptor de electrones
al O2 o anaerobio en el que algunos usan NO. Presenta una versatilidad metablica muy grande que se traduce
en su capacidad de utilizar como fuente de carbono substratos muy variados.
La Pseudomona aeruginosa es capaz de llevar a cabo procesos de desnitrificacin (NO3-, NO2-, N2) con lo que
se empobrecen los suelos de nitrgeno utilizable desde el punto de vista agrcola. Este proceso de reduccin del
nitrgeno (que acta como aceptor de electrones en un proceso de respiracin anaerobia) se denomina
reduccin disimilara del nitrgeno.
La versatilidad metablica de la Pseudomona aeruginosa se debe a la presencia de un gran nmero de plsmidos
que contienen operones inducibles para la sntesis de enzimas especficas que permitan catabolizar los
compuestos presentes en el medio. Esto confiere una importancia grande a las bacterias del
gnero Pseudomonas como digestores aerobios de materiales animales y vegetales, lo que contribuye al reciclaje
biolgico de materia orgnica. Las especies de Pseudomonas son utilizadas en birreactores ya que degradan la
materia orgnica y la utilizan como fuente de energa, tambin tienen una importante participacin en la
depuracin de metales pesados ya que al no ser especies exigentes nutrimentalmente tienen la capacidad de
asimilar dichos metales reduciendo su grado de toxicidad o bien degradndolos a un grado en el que ya no se
consideren peligrosos.
cita:
Campos, Vctor, Valenzuela, Cristian, Alcorta, Marcela, Escalante, Guisella, & Mondaca, Mara A. (2007).
AISLAMIENTO DE BACTERIAS RESISTENTES A ARSENICO DESDE MUESTRAS DE ROCAS VOLCANICAS DE LA
QUEBRADA CAMARONES, REGION PARINACOTA: CHILE. Gayana (Concepcin), 71(2), 150-155. Recuperado en 15
de
agosto
de
2015,
de
http://www.scielo.cl/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S071765382007000200003&lng=es&tlng=es. 10.4067/S0717-65382007000200003.
Referencias:
-Anderson, G.,Williams, J. & Hille, R. 1992. The purification and characterization of arsenite oxidase
from Alcaligenes faecalis: a molybdenum containing hydroxylase. J. Biol. Chem. 267: 23674-23682
-Cai, J., Salmon, K. & Dubow, M.1998. A chromosomal ars operon homologe ofPseudomonas aeruginosa confers
increased resistance to arsenic and antimony in Escherichia coli. Microbiol. 144:2705-2713.
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