Pilar Barrero de los Reyes

Las técnicas inmunológicas son útiles desde no hace mucho para la detección y el
seguimiento de muchas enfermedades a partir de muestras pequeñas. En esta práctica
se han utilizado dos técnicas concretas:

Por una parte, la técnica de aglutinación, la cual, es una técnica inmunológica que
involucra la interacción antígeno-anticuerpo. Se ha realizado concretamente la
hemaglutinación de los glóbulos rojos para determinar el grupo sanguíneo, en la cual,
se observa un cambio físico a simple vista, pero además de los glóbulos rojos hay más
pruebas para agentes aglutinantes concretos como para la bacteria brúcela, el
Trypanosoma Cruzi o el Toxoplasma Gondii
(aglutinación). La ventaja de las reacciones
de aglutinación es que son pruebas muy
rápidas y sencillas de realizar, no requieren
de ningún equipamiento para su lectura,
son rápidas y fáciles de interpretar.

Y, por otra parte, la técnica de precipitación, en el que, al mezclar cantidades suficientes

de Antígeno soluble con anticuerpos específicos, la interacción Ag-Ac puede dar lugar a
una red capaz de ser visualizada como un precipitado. Se agregan concentraciones
crecientes de antígeno a una cantidad fija de anticuerpos específicos, los antígenos
reaccionan directamente con anticuerpos, mientras más concentrado mayor será la
reacción. Al igual que en las técnicas de aglutinación, en las técnicas de precipitación se
necesitan concentraciones equivalentes de antígenos y anticuerpos, si existe
desequilibrio, se produce un fenómeno de zona y el resultado podría ser un falso
negativo.

La inmunodifusión radial es una técnica basada en la reacción de precipitación. Esta

técnica permite cuantificar de manera sencilla y económica Igs (M, G y A) o antígenos
solubles, por medio de un agar con el anticuerpo específico e introduciendo, en cilindros
excavados en el agar, las diferentes concentraciones de antígeno difundiéndose de
forma radial, permitiendo la formación de precipitados visibles.
Objetivo 1: Utilizando la técnica de hemaglutinación directa, identificar el grupo
sanguíneo
Objetivo 2: Utilizando la técnica de inmunodifusión radial, detectar la presencia y la
cantidad de un antígeno.

Inmunodifusión Radial
1. Vaso de precipitado
Hemaglutinación directa 2. Gel de agarosa
1. Portaobjetos 3. Varilla agitadora
2. Palillos 4. Microondas
3. Algodón 5. Baño maría
4. Lanceta 6. Antígeno desconocido
5. Anti-A 7. Antígeno de concentración conocida
6. Anti-B 8. Tampón
7. Anti-AB 9. Placa de Petri
8. Anti-D 10. Sorbete
11. Pipeta automática
12. Tubos Eppendorf

Hemaglutinación directa:
En primer lugar, es necesario colocar 2 portaobjetos.
En el primero se tienen que poner bien separadas 2 gotas de reactivo, una de Anti – A y
la otra de Anti – B, mientras que, en el otro, se depositará una gota de Anti – AB y otra
de Anti – D.
Seguidamente, se realizará una extracción de sangre capilar y se pondrá una cantidad
proporcional en cada una de las gotas del portaobjetos, intentando que los reactivos no
se mezclen entre sí.
Posteriormente, con un palillo de dientes se mezclará la sangre con la disolución y se
ampliará la gota, de tal forma que, si se aglutina, será positivo, mientras que, si no, será
negativo.

Inmunodifusión radial:
Preparación de las placas
1. Colocar la plantilla debajo de la placa para que el patrón esté centrado.
2. Realizar los pocillos utilizando el sorbete con delicadeza, retirando los tapones
de agarosa con un palillo o una espátula, sin romper el gel.
Preparación de las diluciones seriadas
1. Marcar cuatro tubos eppendorf. FD=2, FD=4, FD=8, FD=16.
2. Utilizando una micropipeta, añadir 50 μl de Tampón (Tubo marcado con T) a cada
tubo.
3. Con una punta de pipeta nueva, añadir 50 μl de solución de antígeno estándar
(Tubo marcado con E) al tubo FD=2 y mezclar.
 4. Con una punta de pipeta nueva, transferir 50 μl de la dilución FD=2 al tubo
etiquetado con FD=4 y mezclar.
5. Con una punta de pipeta nueva, transfiera 50 μl de la dilución FD=4 al tubo
marcado con FD=8 y mezclar.
6. Con una punta de pipeta nueva, transfiera 50 μl de la dilución FD=8 al tubo
marcado con FD=16 y mezcla.
7. Ahora hay cinco muestras de antígeno para la curva estándar, como se muestra
en la siguiente tabla:
DILUCIÓN CONCENTRACIÓN
Sin diluir 2 mg/ml
FD=2 1 mg/ml
FD=4 0,5 mg/ml
FD=8 0,25 mg/ml
FD=16 0,125 mg/ml

Carga de las muestras

1. En la parte inferior de la placa, numerar los pocillos del 1 a 5. Dejar el pocillo del
centro sin marcar.
2. En el pocillo 1, cargar 5 μl de la dilución de antígeno FD=2. La muestra debe cubrir
toda la superficie del pocillo extendiéndolo cuidadosamente con la punta de la
pipeta.
3. En el pocillo 2, cargar 5 μl de la dilución de antígeno FD=4.
4. En el pocillo 3, cargar 5 μl de la dilución de antígeno FD=8.
5. En el pocillo 4, cargar 5 μl de la dilución de antígeno FD=16.
6. En el pocillo 5, cargar 5 μl del antígeno no diluido.
7. Con una punta de micropipeta nueva o una pipeta de transferencia, cargar 5 μl
de la solución de antígeno desconocido en el pocillo central.
8. Marcar la cubierta de la placa de Petri. Colocar la tapa sobre placa, colocar la
placa hacia arriba dentro de la cámara de incubación sobre las toallas de papel
húmedas. Cubrir la cámara de incubación y colocarla en una estufa de incubación
a 37°C o a temperatura ambiente durante 24 a 48 horas.

Lectura de los resultados

- Con una regla, medir el diámetro del anillo de precipitación en milímetros. Para
trazar la curva estándar, elevar al cuadrado el valor del diámetro, para realizar la
gráfica indicar la concentración del antígeno en el eje X y el diámetro al cuadrado
en el eje Y. Dibujar la línea que mejor se ajuste entre estos puntos. Calcular el
valor de la concentración de antígeno desconocido de esta gráfica.

V0= 50 μl V0= 50 μl V0= 50 μl V0= 50 μl

vv

FD = Vf/V0 = 100/50 = 2
Vf= 100 μl Vf= 100 μl Vf= 100 μl Vf= 100 μl

2 mg/ml 1 mg/ml 0,5 mg/ml 0,25 mg/ml 0,125 mg/ml

FD=1 FD=2 FD=4 FD=8 FD=16
Hemaglutinación directa:

Anti-A Anti-B Anti-AB Anti-D

Determinamos que el paciente es de grupo sanguíneo A ya que la aglutinación, la cual

indica un resultado positivo, se encuentra tanto en Anti-A como en Anti-AB, pero no en
Anti-B y Rh – ya que no tiene aglutinación en Anti-D indica un resultado negativo. Esto
se debe a que se ha creado un inmunocomplejo, formando una red si es positivo.

Inmunodifusión radial:
FD= 1
2 mg/ml

FD= 16
0,125 mg/ml
FD= 2
1 mg/ml

FD= 8
FD= 4 0,25 mg/ml
0,5 mg/ml

Antígeno - Anticuerpo

Se identifica como resultado negativo ya que el pocillo central no se ha formado el

complejo antígeno-anticuerpo. El diámetro de los anillos de los distintos factores de
dilución es proporcional, a más concentración mayor es el diámetro.

Al medir los diámetros de las distintas concentraciones podemos realizar una recta de
calibrado con los resultados.

Se observa que no hay

tendencia en los puntos y
corresponden con los
pocillos: 5, 4 y 3
CONCENTRACIÓN DIÁMETRO DE ANILLO
2 1,4
0,125 0,6