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ISSN: 1314-6246 Jagadeeswara Reddy y KarunakaranJ. BioSci. Biotecnología.2013, 2(3): 173-179.

ARTÍCULO DE INVESTIGACIÓN

K. Jagadeeswara Reddy1 Purificación y caracterización del ácido

KT Karunakaran2
hialurónico producido porStreptococcus
zooepidemicus cepa 3523-7

Direcciones de los autores:

ABSTRACTO
1Departamento de Biotecnología, Universidad
El ácido hialurónico (HA) es un gel hidratado y comprende unidades repetitivas de ácido
Acharya Nagarjuna, Guntur, India.
glucurónico ynorte-acetilglucosamina. La producción y recuperación de HA ha cobrado gran
2MM Biolabs Private Limited, 274
Fortuna Glade B3/A, VB Layout, importancia debido a sus amplias aplicaciones clínicas. En la búsqueda de obtener HA de alta
Bangalore, India. pureza, hemos desarrollado un proceso de fermentación por lotes utilizandoStreptococcus
zooepidemicusen un biorreactor de 25 L que dio como resultado un rendimiento máximo de
2,3 g/L HA. Además, hemos ideado un método eficaz para la separación y recuperación de
Correspondencia:
ácido hialurónico a partir de un caldo de alta viscosidad mediante el tratamiento con ácido
KT Karunakaran
MM Biolabs Private Limited tricloroacético (0,1 %) y carbón vegetal (1-2 %), pasando por filtración (0,45 μm) y
274 Fortuna Glade B3/A ultrafiltración que dio como resultado en recuperación del 72,2% de HA de grado clínico con
Diseño VB, 5elPrincipal peso molecular de 2,5×106da. También hemos caracterizado nuestro HA purificado mediante
Bangalore, India.
espectroscopia FTIR y NMR. Estos estudios revelaron la similitud tanto en el espectro FTIR
Teléfono: +91 8026484373
correo electrónico: mmbiolabsindia@yahoo.com como en el espectro RMN tanto del estándar de referencia como del HA purificado deS.
zooepidemicusindicando que el proceso reportado es más eficiente en términos de mejor
rendimiento y alta calidad (99.2%).
Información del artículo:

Recibió:7 junio 2013 Aceptado:

15 de agosto de 2013
Palabras clave:Ácido hialurónico, fermentación por lotes alimentados, purificación, análisis
FTIR, análisis NMR,Streptococcus zooepidemicus

cápsula de HA.Estreptococosson cocos grampositivos,

Introducción
El ácido hialurónico (HA) es un carbohidrato, más específicamente
un mucopolisacárido que se encuentra naturalmente en todo el
cuerpo humano. El hialuronano es un polímero de disacáridos. HA se
compone de unidades de disacáridos polianiónicos lineales, no
ramificados, que consisten en ácido glucurónico (GlcUA) ynorte-
acetilglucosamina (GlcNAc) unida alternativamente por enlaces
glucosídicos (β-1,3) y (β-1,4). HA ha sido extraído convencionalmente
de crestas de gallo y humor vítreo bovino. Sin embargo, es difícil aislar
HA de alto peso molecular a una velocidad industrialmente factible a
partir de estas fuentes, porque forma complejos con los
proteoglicanos presentes en el tejido animal. Actualmente es poco
práctico controlar el peso molecular del biopolímero mientras se
sintetiza en tejido animal. Además, el uso de bioquímicos derivados de
animales para la terapéutica humana ha planteado cuestiones éticas y
se encuentra con una resistencia creciente. Para superar estas
desventajas, la tendencia reciente implica el uso del grupo A y el grupo
C de Lancefield.Estreptococos, que naturalmente producen un
mucoide
nutricionalmente exigentes, anaerobios facultativos, inmóviles, no
formadores de esporas, catalasa-negativos que se presentan en pares
o cadenas. Varios estudios también han informado sobre la
producción de HA a partir de Streptococcus zooepidemicus(Johns et
al., 1994; Armstrong y Johns, 1997; Rangasamy y Jain 2008;
Jagadeeswara Reddy et al., 2011).
Las aplicaciones clínicas más significativas de HA se encuentran en el
área de oftalmología, ortopedia y cicatrización de heridas. Los usos
emergentes incluyen la administración de fármacos, recubrimientos,
implantes y aplicaciones relacionadas con la terapéutica. La inyección de
hialuronato de sodio es una solución viscoelástica estéril de hialuronano de
alto peso molecular altamente purificado en solución salina tamponada con
fosfato. Por lo tanto, la mayor parte de la investigación se ha centrado
principalmente en obtener un HA de alta pureza adecuado para
aplicaciones clínicas (Swann & Kuo, 1991). Varias técnicas de separación,
como la digestión con proteasa, la precipitación de pares iónicos de HA (por
ejemplo, con cloruro de acetilpiridinio), la ultrafiltración por membrana, la
precipitación sin disolventes de HA y la liofilización (Mendichi & Soltes,
2002; Soltes & Mendichi,

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2003) se han utilizado para obtener un compuesto puro. Todavía se
necesita un método económico y simple para la producción de HA
pura y de alto grado para aplicaciones médicas.
Anteriormente informamos sobre la optimización de las
condiciones de fermentación para una producción mejorada de HA
(1.89 g/L) porS. zooepidemicuscepa mutante 3523-7 (Jagadeeswara
Reddy et al., 2011). Este estudio describe además cómo mejorar la
producción de HA en un proceso de fermentación por lotes
alimentados y un método simple de purificación para HA de alto peso
molecular y alta calidad y su caracterización.
Materiales y métodos
bacterias y medios
Streptococcus equisubespeciezooepidemicusEn este
estudio se utilizó la cepa mutante 3523-7 derivada de MTCC
3523 (Jagadeeswara Reddy et al., 2011). Ambas cepas se
mantuvieron como cultivos liofilizados y almacenados a 4ºC.
Las bacterias se subcultivaron y cultivaron usando inóculos al
uno por cientoen caldo Todd Hewitt (Difco) oun medio
químicamente definido (CDM) que contiene fuentes óptimas
de carbono y nitrógeno (Jagadeeswara Reddy et al., 2011).
Fermentación de ácido hialurónico utilizando S. zooepidemicus 3523-7
Los experimentos de cultivo por lotes alimentados se realizaron en
un biorreactor de 25 L (Scigenics, India) con un volumen de trabajo de
12 L de medio químicamente definido (CDM). El biorreactor que
contenía CDM se sometió a autoclave a 121°C 15 lb/in2durante 20 min
y se dejó enfriar a temperatura ambiente. Cultivado en CDM de la
noche a la mañanaS.zooepidemicusSe usó 3523-7 como inóculo (1%).
La agitación fue proporcionada por tres turbinas de cuatro palas, el pH
de los medios de cultivo se mantuvo entre 7,2 y 0,2 mediante la
adición automática de 5norte- Hidróxido de sodio y temperatura a
36ºC con regulación automatizada. La velocidad del impulsor (200-400
rpm) y la aireación (0,4 a 0,5 vvm) en cultivos por lotes alimentados del
biorreactor se optimizaron para condiciones de cultivo definidas. En
cuanto a las condiciones establecidas, la concentración inicial de
glucosa se mantuvo mediante la adición de 20 g/L de glucosa a un
caudal de 1 ml/min del stock (220 g/L). Se permitió que la
fermentación continuara en un modo por lotes hasta que el nivel de
azúcar alcance el 0,1 % (casi 8-10 horas) y si la concentración del
azúcar es inferior al 0,1 %, se aumentó la tasa de dilución de la
glucosa. La tasa de dilución se calculó usando la fórmula: D=F/V. Tasa
de dilución de la glucosa (de 13 a 14el
hora del lote) fue F = 60 ml/hr y D = 0.005 hr-1. Se aseguró
que la concentración de azúcar en el lote no debe exceder
el 0,1-0,2% con la tasa de dilución. Casi a las 13-14el
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hora, la tasa de dilución de glucosa se incrementó a 2 ml/min para
mantener el azúcar residual y luego posteriormente en modo alimentado
por lotes con la alimentación de glucosa a una tasa de 1 ml/min. Las células
se recolectaron después de que el calor matara las bacterias al final de las
20 horas de fermentación cuando la OD final530estaba en 4.7.
El crecimiento del cultivo se determinó midiendo la densidad
óptica (OD) en A530nm (Armstrong & Johns, 1997) con
espectrofotómetro UV-Visible (Labomed Inc, EE. UU.) usando el
medio sin inocular como blanco de referencia. Las muestras de
cultivo se diluyeron con agua destilada para dar menos de 1 OD
en A530Nuevo Méjico.
Aislamiento y purificación de ácido hialurónico
HA producido porS. zooepidemicusen caldo de fermentación
se purificó como se describe en la literatura (Brown et al., 1994;
Han et al., 2004; Carlino & Magnette, 2002) y se realizaron algunas
modificaciones en sus pasos de purificación para mejorar la
recuperación y pureza de HA. El HA crudo presente en el caldo de
fermentación se estimó por el método del carbazol (Bitter & Muir,
1962).
El caldo de fermentación (Van de Rijn & Kessler, 1980) que
contenía >2,0 g HA/L se precipitó con alcohol isopropílico (1:3 v/v). El
HA precipitado se redisolvió en una solución de cloruro de sodio 0,15
M para reducir la viscosidad y la concentración de HA (preferiblemente
hasta 0,01 g HA/L). Los ácidos nucleicos y las proteínas derivadas de
bacterias presentes en las muestras crudas se eliminaron reduciendo
el pH del caldo de 6 a 2 mediante la adición de ácido tricloroacético
(0,1 %) y el posterior tratamiento con carbón vegetal (1-2 %) durante 1
h, seguido de centrifugación a temperatura ambiente. 7000 rpm
durante 30 min a 4ºC.
Después de retirar las células y el carbón, la solución de HA se
pasó a través de filtros de 0,45 μm (soporte de casete de 293 mm,
Millipore, EE. UU.). La solución de HA filtrada se diluyó cinco veces
y se purificó adicionalmente mediante ultrafiltración en modo de
diafiltración (Millipore, EE. UU.) usando un casete de corte de 300
kDa (Sartorius). Finalmente, el retenido que contenía la muestra
de HA se concentró al volumen original (un litro y se precipitó con
alcohol isopropílico (1:3 v/v). Este paso de alcohol isopropílico
eliminará los residuos de endotoxinas que quedaron en la etapa
de filtración. Agregados fibrosos blancos de hialuronato de sodio
puro se precipitó y se secó al vacío (Biotron, Corea) Los niveles de
endotoxina se midieron usando el reactivo LAL (Charles River
Laboratories, SC, EE. UU.) de acuerdo con las instrucciones del
fabricante.
El peso molecular (MW) de HA se determinó midiendo
la viscosidad intrínseca [η] con el viscosímetro Cannon-
Ubbelhodes (Cannon Instrument Co, EE. UU.), seguido de
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sustituyendo la viscosidad intrínseca en la Ecuación de Mark Houwink
(Martin, 1953; Laurent et al., 1960). La viscosidad intrínseca [η] se
evaluó mediante el método de la Farmacopea Británica (2003).
Caracterización del ácido hialurónico por FTIR
La caracterización de HA se realizó mediante
espectrofotómetro FTIR (Jasco, Japón) como se describe en
British Pharmacopoeia (2003). HA obtenido por extracción y
purificación de los cultivos discontinuos alimentados deS.
zooepidemicus se comparó con una muestra estándar de HA
(Sigma Chemicals, EE. UU.).
El bromuro de potasio seco se introdujo en un mortero y se
molió con un mortero. Luego se agregaron 2 mg de HA estándar
(como sustancia de referencia) y se molieron para obtener una
mezcla uniforme. La muestra se distribuyó uniformemente sobre
la peletizadora y la broca peletizadora se mantuvo sobre ella con
la superficie lisa mirando hacia la muestra. La peletizadora
(Kimaya Engineers, India) se fijó y apretó con la cabeza del tornillo.
Luego se aplicó presión lentamente usando la palanca hasta 10
toneladas (sin exceder las 10 toneladas). El granulador se
despresurizó después de un minuto con la ayuda de la perilla. El
sedimento se recogió cuidadosamente del peletizador y se colocó
en el portamuestras para medirlo en el espectrofotómetro FTIR.
De manera similar, la muestra de HA obtenida de S.
zooepidemicustambién fue preparado para espectrofotómetro
FTIR. La muestra de HA a examinar y el estándar de referencia se
prepararon ambos mediante el mismo procedimiento y los
espectros registrados oscilaron entre 4000 y 400 cm-1(2,5-25 μm)
en las mismas condiciones operativas frente al aire que el blanco.
Todas las moléculas orgánicas pueden absorber radiación FTIR
entre 4000 cm-1y 400cm-1, que corresponde a una absorción de
energía entre 11 kcal/M y 1 kcal/M. Esta cantidad de energía inicia
las transiciones entre los estados vibratorios de los enlaces
contenidos dentro de la molécula. Los mínimos de transmisión
(máximos de absorción) en el espectro obtenido con la muestra
de HA a examinar corresponden a la posición y tamaño relativo a
los del espectro obtenido con la sustancia de referencia.
Caracterización del ácido hialurónico por análisis espectroscópico de
RMN
Para determinar la estructura química del ácido hialurónico,
análisis de la C13El núcleo presente en el compuesto (ácido hialurónico)
se estudió mediante espectroscopía de resonancia magnética nuclear
(RMN) (Bruker, Alemania) como se describe a continuación.
Diez miligramos de muestra de HA obtenida deS.
zooepidemicusse llevó a un tubo NMR de 5 mm limpio y
seco (vidrio Wilmad). El compuesto se disolvió en 500 μl de
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D2O dentro del tubo de RMN. De manera similar, la referencia
estándar (10 mg de HA en 500 μl de D2O) se preparó para el
análisis.
La solución isotrópica tanto para la prueba HA como para el
estándar de referencia se ha preparado en D2O. Todos los
experimentos se realizaron con el espectrómetro BRUKER AMX 53
400 NMR operado a 9,7 Tesla con una sonda QNP de 5 mm. Se ha
utilizado el programa de pulso Zgdc estándar para adquirir el C13
Espectros de RMN con desacoplamiento Waltz-16. La temperatura
se mantuvo a 300 K usando una unidad de temperatura BRUKER
BVT estándar y la muestra no se centrifugó durante el tiempo del
experimento. Se registraron los espectros y el espectro obtenido
para la muestra se comparó con el espectro estándar de
referencia.
análisis estadístico
Los datos se expresaron como media ± DE obtenidos de al menos
tres experimentos independientes. La significación estadística de los
resultados obtenidos se verificó mediante la prueba t de Student y
ANOVA de una vía utilizando un paquete comercial (Sigma Plot 5.05).
pag<0,05 en las comparaciones con los controles se consideró
significativo.
Resultados y discusión
Producción de ácido hialurónico por S. zooepidemicus 3523-7
S. zooepidemicusSe ha demostrado que la cepa 3523-7
produce diez veces más HA en comparación con su cepa original
(Jagadeeswara Reddy et al, 2011). Hemos empleado la misma cepa en
el estudio para obtener mejores rendimientos. Durante el crecimiento
de la fermentación por lotes alimentados, la producción de HA y la
concentración total de azúcar se monitorearon continuamente (Figura
1). Al finalizar las 18 hrs, tanto la OD final530del cultivo (4,7) y la
producción de HA (2,34 g/L) alcanzó el máximo. Por el contrario, la
concentración de azúcar total comenzó a disminuir durante el
crecimiento y la producción de HA hasta el final de la fermentación.
Por lo tanto, el proceso de fermentación resultó en un mayor
rendimiento de HA en comparación con nuestro estudio anterior
(Jagadeeswara Reddy et al, 2011).
Aislamiento y purificación de ácido hialurónico producido por S.
zooepidemicus 3523-7
El aislamiento y el proceso de purificación aguas abajo son
cruciales para la recuperación eficiente de HA del caldo de
fermentación. Anteriormente se han empleado varios procedimientos
de purificación para el aislamiento y la purificación de HA (Brown et al.,
1994; Han et al., 2004).
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Figura 1.Producción de ácido hialurónico mediante fermentación discontinua por S. zooepidemicus cepa 3523-7.A) El cambio en el crecimiento de S. zooepidemicus
se muestra mediante -♦- en función de la absorbancia en la DO530yB) El cambio en la producción de ácido hialurónico se muestra como (-
● - ) junto con el azúcar total en CDM indicado por (-■-) se muestran en el gráfico de líneas.

La liberación de HA de los complejos con otros polisacáridos y
proteínas generalmente se logra mediante el uso de enzimas,
solventes orgánicos y detergentes (laurilsulfato, bromuro de
hexadeciltrimetilamonio, etc.) y resinas de intercambio aniónico
(Han et al., 2004). Sin embargo, la principal desventaja asociada
con estos procesos es el mayor costo de producción y se vuelve
difícil eliminar completamente el material exotérmico, las
proteínas, los ácidos nucleicos, etc., por lo que no son los
preferidos para los procesos de aumento de escala. En el presente
estudio, se ha desarrollado un proceso de purificación novedoso y
rentable para HA de alta pureza.
El proceso de purificación optimizado (Tabla 1) en el
presente estudio incluye tratamiento con ácido tricloroacético
(0,1%) y carbón activado (1-2%) seguido de centrifugación. El
tratamiento con carbón produjo un HA de alta pureza.
y eliminó eficientemente impurezas como proteínas y ácidos nucleicos.
La solución de HA clarificada así obtenida se diluyó cinco veces y se
pasó a través de filtración (0,45 µm) y ultrafiltración en modo de
diafiltración. El retenido que contenía HA se concentró a la mitad del
volumen original con una recuperación del 72,2 % y una pureza del
99,2 % (sin ADN ni proteínas). El paso de precipitación con alcohol
isopropílico en presencia de cloruro de sodio 0,5 M ha eliminado
eficazmente las endotoxinas del paso final de la purificación (datos no
mostrados), que es un paso muy importante y redujo el costo de los
materiales muy caros utilizados específicamente para la eliminación de
endotoxinas . Usando este proceso, logramos una pureza del 99,2 %
de HA con una mejor pureza en comparación con los estudios
anteriores.
(Brown et al., 1994; Rangaswamy y Jain, 2008).

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La calidad de HA obtenida en este proceso cumple con las estándar. Estos resultados revelaron la similitud del HA estándar y el HA de la

especificaciones de British Pharmacopoeia (2003) para uso médico con muestra de prueba y las posiciones de los picos.

un rendimiento de 2,3 g/L durante el proceso (Cuadro 1). En

consecuencia, el HA obtenido mediante un método de purificación
simple y económico de la presente invención tiene un HA de alta
pureza (sin ADN y es de grado médico. Se encontró que el peso
molecular del HA aislado de cultivos discontinuos alimentados era de
2,5 × 106da.

Tabla 1.Purificación de ácido hialurónico producido por S.

zooepidemicus 3523-7.

Antes Después

purificación purificación

AH (g/L) 2,320 ± 0,091 1,675 ± 0,075

sobredosis260 3.800 ± 0.060 0,032 ± 0,008

Proteína (mg/L) 356,00 ± 1,701 1,181 ± 0,142

Figura 2.Caracterización por FTIR del ácido hialurónico producido
El HA del caldo clarificado se precipitó con alcohol isopropílico y se suspendió en cloruro
por S. zooepidemicus cepa 3523-7.
de sodio. Luego, la solución de HA se trató con carbón vegetal durante 1 h. Después de
la centrifugación, la solución de HA se pasó a través de un filtro de 0,45 µm, se sometió
a filtración de flujo cruzado y finalmente se concentró hasta el volumen original.

Tabla 2.El número de pico y la posición de los picos (en términos de

número de onda, cm-1) tanto del estándar de HA de referencia como del HA
Caracterización FTIR del ácido hialurónico producido por S. de prueba producido por S .zooepidemicus 3523-7 usando espectroscopía

zooepidemicus 3523-7 FTIR.

La espectroscopia FTIR es un método poderoso para la identificación

de grupos funcionales y compuestos orgánicos mediante la evaluación de Cima Longitud de onda (cm-1) Longitud de onda (cm-1)

las transiciones entre los estados vibratorios de los enlaces contenidos No Estándar HA de referencia Muestra de HA de prueba

dentro de la molécula. El espectro FTIR de la muestra de HA de prueba y el

estándar de referencia y sus ondas son similares, como se muestra en la 1 611.32 613.25

Figura 2 y la Tabla 2.
2 1043.30 1041.37
La posición de los picos en términos de número de onda (cm-1)
tanto del estándar de referencia como del HA producido porS. 3 1411.64 1413.57
zooepidemicusen condiciones óptimas son idénticos y están
4 1616.06 1619.91
correlacionados. Este espectro FTIR tanto del estándar de
referencia como del HA purificado en este estudio cumplió con la 5 2892.70 2896.51
similitud en su caracterización (Figura 2). HA estándar mostró
6 3407.60 3424.96
varios picos agudos (cm-1) como en 611.32, en 1043.3 que podría
deberse al estiramiento COC (Alkrad et al., 2002), en 1411.64 que
corresponde a la presencia del grupo CO con combinación C=O, Análisis espectral de RMN del ácido hialurónico producido por S.
en 1616.06 que indica la presencia de amida II grupo, en 2892.7 zooepidemius 3523-7
debido al estiramiento CH y en 3407.6 que confirma la presencia 13La espectroscopia C NMR se usa para identificar las resonancias
de estiramiento OH. Picos similares (cm-1) se ven con la prueba HA asociadas con el solvente usado para la muestra NMR. picos en el13Los
como se indica en la Tabla 2. Estos seis picos diferentes obtenidos espectros de RMN C (Figura 3) correspondientes a las 86 moléculas de
en la muestra HA comparten una posición relativamente similar disolvente deuterado muestran patrones de acoplamiento de espín
en comparación con la de la únicos y la magnitud del acoplamiento depende de la

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número de enlaces que separan los átomos y la geometría de los enlaces
entre sí. En el presente estudio, los resultados espectroscópicos de RMN de
HA producidos en cultivos discontinuos alimentados de
S. zooepidemicusmostró similitud en el cambio químico de13C que
la del estándar de referencia en las mismas condiciones
operativas. El cambio químico de13C a 25 ppm, 57 ppm, 63,2
ppm, 71,2 ppm, 76,1 ppm, 78,9 ppm, 82,6 ppm, 85 ppm, 103,2 ppm,
105,9 ppm y 176,6 ppm son similares tanto en la muestra de prueba
HA como en el estándar de referencia, como se muestra en la Figura 3.
En el presente estudio, los cambios químicos exhibidos de13C se
correlacionó con los informes anteriores (Alkrad et al., 2002; Bjarne et
al., 1992; Scott et al., 1984; Cowman et al., 1984).

Figura 3.Análisis espectral de RMN del ácido hialurónico producido por la cepa 3523-7 de S. zooepidemius Muestra.1: Estándar de referencia de
Sigma Aldrich y Muestra.2: Muestra de prueba interna.

HA de grado clínico. Análisis posteriores por espectroscopía FTIR y

Conclusión NMR han revelado queEl HA producido en este estudio exhibió
propiedades químicas similares a las del estándar de referenciaJA.
S.zooepidemicusha producido 2,3 g/L de alto peso molecular
Por lo tanto, este HA podría usarse para aplicaciones médicas.
peso HA (2.5x106Da) en condiciones óptimas en fermentación
discontinua. El método de purificación desarrollado en el presente
estudio eliminó eficientemente material exotérmico, proteínas, ácidos
nucleicos y otras impurezas en comparación con el método
convencional y, por lo tanto, se obtuvo una alta recuperación (72,2 %)
de HA. El proceso de recuperación utilizado en este informe es simple Referencias
y económico mediante el uso de ácido tricloroacético (0,1%), Alkrad JA., Mrestani Y, Stroehl D, Wartewig S, Neubert R. 2002.
tratamiento con carbón vegetal, filtración y diafiltración. HA purificado Caracterización del ácido hialurónico digerido enzimáticamente
por este procedimiento de purificación produjo un HA de alta pureza mediante espectroscopios de RMN, Raman, IR y UV-Vis. J. Pharm.
biomedicina Analy., 31: 545-550.
(99,2%) y este método podría ser útil para la purificación industrial de

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