el “Año del Bicentenario del Congreso de la República Con

del Perú”

Profesor: Julio Ivan Cruz Colque

Alumna: Tania Rosmery Perez Aroni
Código: 212165
Grupo: B

ABANCAY-2022
 PRACTICA

COLORACION DE FLAGELO Y ESPORA

I. INTRODUCCION

La tinción de flagelos determina la morfología flagelar de las células bacterianas y

se han reportado técnicas rápidas para la caracterización morfológica de bacterias,
con las técnicas de tinción Gram y la tinción flagelar (Kodaka et al., 1982; Goldman
y Green, 2015), las cuales proporcionan características

os flagelos bacterianos son estructuras de locomoción demasiado finas para

visualizarlos con el microscopio óptico sin tinción. Para lograr su coloración se trata
de engrosarlos aplicando soluciones coloidales inestables de ácido tánico, que se
depositan sobre estas estructuras engrosando el diámetro aparente de los mismos,
de tal manera que se hacen visibles al microscopio óptico con una tinción con
fucsina básica. En la coloración de flagelos requiere mucho cuidado la fijación de la
bacteria en la confección del preparado, dado la facilidad con que pueden
desprenderse los flagelos por daños mecánicos.

La tinción de esporas bacterianas, también llamada tinción Schaeffer-Fulton, es

utilizada ampliamente para la identificación de bacterias esporuladas, generalmente
pertenecientes a los géneros Bacillus y Clostridium, algunas de las cuales son
patógenas por naturaleza.

Sin embargo, debido a su resistencia característica, en muchos casos las

endosporas bacterianas resisten la coloración, dificultando la percepción de las
mismas. El objetivo del presente estudio fue evaluar el efecto que produce una
modificación, aplicada en el laboratorio de microbiología de la facultad de Químico
Farmacobiología-UMSNH, a la técnica original de tinción de esporas, tomando en
cuenta la edad de los bacilos. Se efectuó la comparación entre la técnica de tinción
de esporas bacterianas según Schaeffer-Fulton y con modificaciones de la misma,
aumentando el tiempo de exposición a verde de malaquita y disminuyendo la
concentración de safranina. Para ello se realizaron tinciones de cultivos de 24 y 48

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horas de 8 cepas de bacilos gram positivos esporulados incubadas a 37oC, para
determinar la eficiencia de las modificaciones frente a la técnica original. Como
resultado a estas modificaciones, se observó de manera clara, una respuesta
positiva de hasta un 80% sobre los cultivos de 24 horas, mientras que en cultivos
de 48 horas la eficiencia de la técnica original aumento hasta un valor de 90%. Con
las modificaciones introducidas a la técnica original de Schaeffer-Fulton, se facilitó
la identificación de los bacilos esporulados de interés médico, al observar
correctamente la posición y la forma de la espora al microscopio.

II. OBJETIVOS

- Es el proceso por el cual las moléculas de un colorante se adsorben a una

superficie. El uso de colorantes permite cambiar el color de las células de los
microorganismos y poder realizar la observación en microscopio óptico
- Esta tinción permite determinar el número y la disposición de los flagelos de
las bacterias, lo que constituye una información esencial para la identificación
de muchas especies. La tinción de flagelos es un arte que se adquiere sólo
con la práctica
- Un flagelo es un apéndice móvil con forma de látigo presente en muchos
organismos unicelulares y en algunas células de organismos pluricelulares.
Normalmente los flagelos son usados para el movimiento, aunque algunos
organismos pueden utilizarlos para otras funciones
- La tinción de esporas bacterianas, también llamada tinción Schaeffer-Fulton,
es utilizada ampliamente para la identificación de bacterias esporuladas,
generalmente pertenecientes a los géneros Bacillus y Clostridium, algunas
de las cuales son patógenas por naturaleza
- El primero, permite magnificar el tamaño y estructuras de los
microorganismos para que sean visibles al ojo humano y la segunda,
permiten hacer visibles a los objetos microscópicos y transparentes, revelar

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 su forma y tamaño, así como hacer evidente la presencia de estructuras
internas y externas
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III. MATERIALES Y METODOS

3.1. Observación de Flagelos

1. Material necesario
 Cultivo joven en medio sólido de una bacteria flagelada
 Portaobjetos limpios y desengrasados
 Agua destilada (todas las soluciones y lavados de esta técnica
requieren agua destilada)

 Solución fijadora:
 Alcohol absoluto 60 ml
 Cloroformo 30 ml
 Formaldehído 10 ml

 Mordiente (solución extemporánea: preparar antes de usar; no se

debe de guardar)
 Ácido tánico al 10% 10 ml
 Alumbre potásico saturado 10 ml
 Cloruro férrico al 10% 1 ml
 Mezclar los componentes y esperar 30 minutos antes de usar

 Nitrato de plata amoniacal (Fontana):

 Disolver 5 g de AgNO3 en 100 ml de agua destilada y separar unos
mililitros de la solución
 Añadir al resto, gota a gota y agitando, amoniaco concentrado,
hasta que el precipitado formado se redisuelva.

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  Añadir entonces, gota a gota, la cantidad suficiente de solución de
AgNO3 que habíamos apartado, hasta que aparezca un ligero
enturbiamiento que no desaparezca por agitación.
 Conservar en frascos de color topacio.

2. Técnica (Método de Kirkpatrick, modificado).

 Extender en un portaobjetos 3 gotas de agua destilada.
 Con el asa estéril y bien fría, tomar una pequeña porción del cultivo y
depositarlo suavemente sobre la primera gota, sin extender.
 Quemar el asa a la llama, y dejar que se enfríe.
 Tocar con el asa la primera gota y pasar a la segunda.
 Quemar de nuevo el asa, dejar que se enfríe, y repetir la operación a
partir de la segunda gota (tocar la 2ª, y pasar a la 3ª).
 Dejar secar la preparación en una estufa de 37ºC.
 Fijación: Una vez seca, cubrir la preparación con la solución fijadora
durante un tiempo variable entre 1 y 3 minutos.
 Lavar con etanol para eliminar el cloroformo del fijador y enseguida,
lavar con agua destilada abundante.
 Tratar con mordiente durante 4-5 minutos filtrándolo directamente
sobre la preparación.
 Lavar con agua destilada.
 Añadir el nitrato de plata amoniacal, y dejar actuar entre 60 y 90
segundos.
 Lavar con agua destilada y secar

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 3. Observación

Examinar al microscopio con objetivo de inmersión

(100X) depositando una pequeña gota de aceite de
inmersión sobre la preparación teñida.

Las bacterias aparecen teñidas de pardo oscuro, y los flagelos, de pardo negro-
marrón

3.2. TINCIÓN DE ENDOSPORAS

1. Material necesario.
 Cultivo de una bacteria en fase de esporulación
 Portaobjetos limpios y desengrasados.
 Solución acuosa de Verde de Malaquita (5 % en agua)
 Solución de Safranina al 0’25% en agua

2. Técnica (Método de Würtz, modificacíón del método de Couklin).

 Preparar una extensión seca y fijada por calor
 Cubrir las extensiones con la solución de Verde de Malaquita, y
calentar hasta emisión de vapores durante 10 minutos (cuidar que la
preparación no se deseque y que no hierva, evitar crepitaciones).
 Lavar con agua abundante
 Contrastar con safranina durante 15 segundos
 Lavar y secar

3. Observación
Examinar al microscopio con objetivo de inmersión (100x) depositando una
pequeña gota de aceite de inmersión sobre la preparación teñida.

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Las esporas aparecen teñidas de verde, las células vegetativas en rojo. Anotar la
forma, tamaño y situación de la espora en el esporangio.

IV. PROCEDIMIENTO
4.1. Tinción sencilla
1. material necesario
 Cultivo bacteriano de 24 horas, en medio sólido
 Portaobjetos limpios y desengrasados
 Frasco lavador con agua de grifo o destilada
 Asa de siembra (“asa de platino”), pinzas, mechero, cristalizadores
con agua, microscopio, etc...
 Colorantes:
Fuchsina básica fenicada de Zielhl:
- Fuchsina diamante 0,3 g
- Alcohol etílico de 96º 10 ml
- Solución de fenol 5% en H20 destilada 100 ml
Disolver la fuchsina en el alcohol, y añadir después la solución de
fenol
Azul de Metileno Loeffler:
- Azul de Metileno 0,3 g
- Alcohol etílico de 96º 30 ml

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 - Solución de KOH al 0,01% 100 ml
Disolver el colorante en el alcohol, y añadir la solución de KOH

2. Preparación y fijación de las extensiones

 Colocar en el portaobjetos una gota de

agua con el asa
 Con el asa flameada y fría, tomar una
porción del cultivo bacteriano y suspenderlo
homogéneamente en la gota de agua.
 Extender la suspensión sobre la superficie
del portaobjetos
 Secar la preparación al aire, o bien
calentando muy suavemente a cierta distancia de
la llama del mechero
 Fijar la extensión al portaobjetos por el
calor (pasar la porta dos o tres veces a través de
la llama del mechero, con la ayuda de las pinzas

3. Tinción de las extensiones

 Cubrir la extensión con alguno de los siguientes colorantes:
- Azul de Metileno de Loeffler durante 2 minutos
- Fuchsina diluida (con agua sobre el portaobjetos) durante 30
segundos
 Lavar abundantemente con agua
 Secar la preparación suavemente con papel de filtro

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 4. Observación

Examinar al microscopio con objetivo de inmersión

(100x) depositando una pequeña gota de aceite de
inmersión sobre la preparación teñida.

Esta tinción permite observar la forma y agrupación de las bacterias

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Al final de cada práctica se debe limpiar el objetivo con una toallita de papel
impregnada con una solución jabonosa.

V. RESULTADO

Tinción de Leifson. La tinción de Leifson usa para la observación de flagelos

bacterianos; entra dentro de las tinciones selectivas. Tienen un espesor de 0.01
micrones, por lo que son invisibles al microscopio óptico; por ello hace falta esta
técnica especial.

Las esporas son altamente impermeables a los colorantes, de manera que con las
técnicas de coloración comunes como la de Gram, se observan como regiones sin
teñir dentro de las células coloreadas y por esto se deben utilizar métodos
especiales y selectivos de coloración.

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 VI. CONCLUCIONES

Concluimos esta práctica ya que pudimos identificar cuáles eran las bacterias Gram
positivas y Gram negativas mediante las practica de tinción, todo esto nos ayudó a
comprender el porqué de los diferentes tipos de tinciones cambia debido a que su
pared celular, en el caso de la bacteria Gram positiva el tono es un color azul o
morado que se da debido a que la pared celular es más gruesa, en el caso de la
Gram negativa es rojo o rosa de igual forma a su pared celular que en este caso
solo cambia en su grosor siendo menor.

La función del proceso es colorear las bacterias Gram positivas y Gram negativas,
cuya técnica comúnmente es solicitada por médicos para los pacientes enfermos y
así conocer el tipo de bacteria que contraen.

VII. RECOMENDACIONES

Las tinciones en microbiología son las primeras herramientas que se utilizan en

el laboratorio para el diagnóstico de las enfermedades infecciosas. Desde hace
más de un siglo han ayudado a resolver problemas de etiología microbiana.

La tinción de esporas bacterianas, también llamada tinción Schaeffer-Fulton, es

utilizada ampliamente para la identificación de bacterias esporuladas,
generalmente pertenecientes a los géneros Bacillus y Clostridium, algunas de las
cuales son patógenas por naturaleza.

Hay técnicas tintoriales específicas de gran utilidad, como la tinción de Ziehl-

Neelsen, que se utiliza para el diagnóstico de enfermedades crónicas como la
tuberculosis o la actinomicosis, o la tinción de azul de lactofenol, que preserva e
identifica a los componentes estructurales de los hongos.

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VIII. BIBLIOGRAFIA

Tinción de flagelos. (2022). Www.uv.es.

https://www.uv.es/uvweb/coleccion-espanola-cultivos-
tipo/es/servicios/identificacion-caracterizacion/caracterizacion-
procariotas/estudio-fenotipico/tincion-flagelos-1285978913424.html

Tinción DOMS. (2013). Imbiomed.com.mx.

https://www.imbiomed.com.mx/articulo.php?id=92263

2.5.6: Coloración de flagelos (tinción diferencial). (2022, June).

LibreTexts Español.
https://espanol.libretexts.org/Biologia/Microbiolog%C3%ADa/Manual_d
e_microbiolog%C3%ADa_general/02%3A_Fundamentos_de_microsco
pia_montaje_y_coloraciones_de_muestras/2.05%3A_Tinciones_comu
nmente_usadas_en_microbiologia/2.5.06%3A_Coloracion_de_flagelos
_(tincion_diferencial)

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