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PRACTICA Nº 3

PROTEINAS

RELACION DE EXPERIMENTOS
1. Separación de proteínas por diálisis del suero.
2. Estudio de la solubilidad de la caseina a diferentes ph
3. Determinación de las proteínas totales del suero sanguíneo
4. Identificación de la presencia de proteínas en la orina

INTRODUCCION

Las proteínas son consideradas como macromoléculas, debido a este gran tamaño las
proteínas son incapaces de atravesar membranas semipermeables, lo que posibilita que
en una solución en donde existen proteínas y otros constituyentes de menor peso
molecular (aminoácidos, monosacáridos, urea, creatinina, sales, iones, etc.), las primeras
puedan ser separadas al no poder pasar a través de los poros de las membranas
semipermeables, en tanto que los otros constituyentes, de menor peso molecular,
pasarán sin problema alguno.

Las proteínas tienen un control del pH celular y extracelular (amortiguador), se explica por
la presencia de grupos ionizables en las cadenas laterales de los aminoácidos.
En general una proteína se carga positivamente cuando se encuentra disuelta en un
medio de pH inferior al de su punto isoeléctrico (pI), en tanto que se carga negativamente
cuando el pH del medio en que encuentra es superior al valor de su pI. El punto
isoeléctrico de las proteínas con un alto contenido en aminoácidos básicos (histidina,
lisina y arginina), es alto, como el caso del citocromo c, que tiene un valor de pI de 10,7.
Cuando una proteína tiene un alto contenido en aminoácidos dicarboxílicos (aspártico y
glutámico), tendrán un pI bajo, como el caso de la pepsina que tiene un pI cercano a 1. En
general la mayor parte de las proteínas globulares tiene un pI que varía entre 5,0 y 9,0.

Cuando la proteína está en un medio de pH que coincide con su valor de pI, no solo es
incapaz de migrar en un campo eléctrico sino que su solubilidad llega al mínimo, incluso
algunas llegan a precipitar.

Para la determinación de las proteínas totales del suero sanguíneo existen muchos
métodos pero los más difundidos es la reacción de Biuret.

Desde hace mucho tiempo se conoce que al calentar la urea hasta 180°C, se
descompone para rendir amoniaco y un compuesto denominado biuret. Este último, en
presencia de iones cúpricos y en medio alcalino, rinde una coloración violeta.

No solamente el biuret es capaz de dar esta reacción, otras sustancias que tienen dos
radicales CONH2 o CH2NH2, también pueden hacerlo; incluso estos radicales están unidos
mediante átomos de carbono o de nitrógeno. De la misma manera, los péptidos con más
de dos enlaces peptídicos dan positividad a esta reacción, que es comúnmente conocida
como la reacción de Biuret.

Los valores normales para este método son de 6 a 8 g%. Por debajo de 6 g% se habla de
hipoproteinemia y por encima de 8g% hablamos de hiperproteinemia.
Algunas proteínas que encontramos en la sangre son:
Proteínas Características
Albúmina Es la más homogénea, no contiene lípidos, su peso molecular es de 69,000; su PI es
aproximadamente 4,9 y es la de mayor velocidad de migración.
Participa en el equilibrio hídrico y además el transporte de una serie de sustancias como
la bilirrubina, los ácidos grasos, etc. La albúmina también se une a drogas que son poco
solubles en el agua, como barbitúricos, digitálicos, aspirina, etc. Normalmente, el 50%
del calcio plasmático está unido a la albúmina y esto debe tomarse muy en cuenta para
explicar las manifestaciones de hipocalcemia asociadas a las situaciones en las cuales
disminuye la concentración de albúmina plasmática.
alfa globulinas incluye dos fracciones electroforéticas,
las alfa 1 PI (5.1) y las alfa 2 (5.5 - 5.8). las principales alfa 1 globulinas, son la proteína
C reactiva y las lipoproteínas de alta densidad (HDL), en tanto que las alfa 2 globulinas
son la haptoglobina, ceruloplasmina y protrombina.

La beta (PI 5.4 - 6.3) incluye la proteína transportadora de fierro (transferrina) y a las
globulina lipoproteínas de baja densidad (LDL).

Las gamma (PI 6.3 - 7.3), contiene las diferentes inmunoglobulinas, como la inmunoglobulina G (Ig G)
globulinas que corresponde al 80%, la inmunoglobulina A (Ig A) que representa un 13% y a otras
inmunoglobulinas, que se encuentran en menor concentración (Inmunoglobulinas M, D,
E, etc.).

A pesar de existir una concentración tan alta de proteínas en el suero, normalmente no se


detectan proteína en la orina, explicable por la incapacidad de las proteínas
(macromoléculas) de atravesar los poros de la membrana basal del glomérulo renal. Por
esta razón el encontrar proteínas en cantidades demostrables en la orina de un paciente,
es una situación de mucho cuidado desde el punto de vista médico.

Al calentar una muestra de orina y apreciar la turbidez, lo cual es indicativo de la


desnaturalización de las proteínas por el calor. Sin embargo debe tenerse en cuenta que
los fosfatos también pueden enturbiar la orina; la distinción puede hacerse considerando
que los fosfatos se vuelven solubles en medio ácido.

EXPERIMENTO 1

SEPARACION DE PROTEINAS ( DIALISIS DEL SUERO ).


Objetivos
1. En base al carácter macromolecular de las proteínas utilizar un método para separarlas de
otros componentes de menor peso molecular.
2. Estudiar el efecto de la fuerza iónica sobre la solubilidad de las proteínas del suero
sanguíneo.
3. Constatar la acción del ácido tricloroacético (TCA) como agente precipitante de las
proteínas.

Método: ( Diálisis del suero sanguíneo utilizando como membrana semipermeable una bolsa
de celofán o colodión ).

Procedimiento:
a) Medir en el interior de una bolsa de celofán, 5 ml de suero sanguíneo y cerrar la bolsa.
b) Colocar la bolsa de celofán en el interior de un beaker conteniendo agua destilada, la misma
que debe ser renovada cada cierto tiempo (20 minutos).
c) Al notar algo de precipitado en el interior de la bolsa, vaciar su contenido a un tubo de
centrifuga y centrifugar por 5 minutos a 2500 r.p.m.
d) Separar el sobrenadante en un tubo de ensayo y añadirle 5 ml de ácido tricloroacético al
10%. Observar lo que sucede.
e) Trate de disolver el precipitado que quedó en el tubo de centrifuga utilizando agua destilada,
de no ser posible, añada unas gotas de NaCl al 10% y observe si se solubiliza.

Resultados:
1. Escriba si observó precipitado en el interior de la bolsa y a que puede corresponder.
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2. ¿Qué observó al añadir el ácido tricloroacético al 10%?
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3. ¿Fue posible disolver el precipitado del tubo con agua destilada?
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4.- ¿Qué ocurrió al añadir el NaCl al 10%?
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INTERROGANTES
1. ¿Por qué es necesario renovar el agua destilada del beaker cada cierto tiempo?
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2. ¿Cuál es el fundamento de la precipitación de las proteínas por el ácido tricloroacético?
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3. ¿Con qué experimento(s) podría Ud. demostrar que las proteínas no difundieron a través de
la bolsa de celofán?
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Complete la siguiente tabla:


ALBUMINA GLOBULINAS
Solubilidad en el agua
Solubilidad en soluciones salinas
diluidas
EXPERIMENTO 2.

ESTUDIO DE LA SOLUBILIDAD DE LA CASEINA A DIFERENTES pH


Objetivos
1. Demostrar como varía la solubilidad de una proteína en función del pH.
2. Precisar las alteraciones que ocurren en la solubilidad de la caseína cuando se encuentra en
un medio de pH cercano al valor de su pI.
3. Determinar experimentalmente el pI de la caseína .

Método
A través de la turbidez, apreciar la solubilidad de la caseína en medios de diferentes pH.
Procedimiento.
a) Rotular una serie de 9 tubos de ensayo, del 1 al 9
b) En el tubo 1 medir 9 ml de ácido acético 0.178 N
c) En el tubo 2 medir 9 ml. de la solución de ácido acético preparada mezclando 10 ml. de
ácido acético 0.178 N y 10 ml de agua destilada.
d) En el tubo 3 medir 9 ml. de la solución de ácido acético obtenida al mezclar 10 ml. de la
solución anterior con 10 ml de agua destilada.
e) Proceder sucesivamente con la misma dilución progresiva, hasta completar los 9 tubos.
f) A cada uno de los tubos, añada 1 ml. de la solución de caseína al 0.5 % en acetato de sodio
0.1 N.
g) Mezclar bien y observar la turbidez o precipitación, inmediatamente y a los 15 minutos.
h) Con ayuda del papel indicador, estime el pH en cada uno de los tubos.

Expresión de resultados.
Anote sus resultados en la siguiente tabla.
Expresión de resultados.

TUBOS 1 2 3 4 5 6 7 8 9
Relación SAL / ACIDO
pH (teórico)
pH estimado con papel indicador
Precipitación o insolubilidad a 15’

INTERROGANTES
1. Cuál es el pI de la caseína? Fundamente su respuesta.

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2. Se altera la estructura primaria de las proteínas, cuando se encuentran a un pH que coincide
con el valor de su pI? Fundamente su respuesta.
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3. Por qué precipita la caseína en su pI? Es este proceso reversible?

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4. El pI de la ureasa es de 5.0 será mayor su solubilidad si se encuentra disuelta en un tampón
acetato 4.7 o si se encuentra disuelta en un tampón fosfato 7.8. Por qué?

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EXPERIMENTO 4.

IDENTIFICACION DE LA PRESENCIA DE PROTEINA EN LA ORINA.


Objetivo:
Aplicar un método sencillo que permita la identificación de la presencia de proteínas en la orina
Método
Coagulación de las proteínas por el calor
Procedimiento.
a) Medir 5 ml de orina en un tubo de ensayo y calentar hasta la ebullición. Observar lo que
sucede
b) En caso observe enturbiamiento, añada alguna gotas de solución de ácido acético al 2%.
Apreciar si la turbidez persiste o desaparece
c) Haga el mismo procedimiento con todas las muestras de orina que le serán proporcionadas.

Resultados.
1.- Llene el espacio en blanco escribiendo + cuando hay turbidez y - cuando no la hay o cuando
desaparece la turbidez
ORINA X ORINA Y ORINA Z
Calentando la muestra
Añadiendo Ac. Acético
DIAGNOSTICO

INTERROGANTES.
1.- Puede una proteína coagulada dar la reacción de biuret. Fundamente su respuesta
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2.- Que puede decir de un líquido biológico que al ser calentado se pone turbio y con el añadido
de unas gotas de limón desaparece su turbidez
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