“Año de la inversión para el desarrollo rural y la seguridad alimentaria”

UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA

FACULTAD DE CIENCIAS

ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE BIOTECNOLOGÍA

UNIDAD I

PRÁCTICA Nº01 : Curva de calibración de glucosa, etanol y protenias

DOCENTE : Angel Castro

CURSO : Operaciones Unitarias I

ESTUDIANTES :

 GARCÍA PÉREZ, Carlos

 RIVAS SANDOVAL, Walter

CICLO : VIII

Nvo. Chimbote. Octubre de 2013

CURVA DE CALIBRACION DE GLUCOSA, ETANOL Y PROTEINAS

INTRODUCCION:

La conversión microbiológica de carbohidratos para obtener biomasa y productos de interés

industrial es tema de constante actualidad debido a la creciente dependencia de los recursos
renovables. Los rendimientos alcanzados en biomasa y productos son de relevancia
significativa debido a que, generalmente, el valor de los sustitutos empleados en la
formulación de medios de cultivo tiene una importancia sustancial en el costo de operación
de las plantas industriales.

El grado en que un microorganismo puede transformar los componentes del medio de

cultivo en nueva biomasa y productos juega un papel fundamental, a punto tal que puede
llegar a ser factor determinante de la viabilidad de un proceso en gran escala. Desde este
punto de vista, resulta de sumo interés poder llegar a determinar, estimar o predecir
rendimientos que den cuenta de las transformaciones que se están llevando a cabo en un
biorreactor. Los balances de materia y energía resultan a tal fin de suma utilidad y su
empleo se ha extendido ampliamente en ciencias básicas y aplicadas. La aparición en el
mercado de sensores que permiten medir importantes variables delos cultivos microbianos
y el uso de ordenadores acoplados a los biorreactores (biorreactor = recipiente en el cual se
cultivan los microorganismos) han ampliado el horizonte para la aplicación de balances de
materia y energía. la producción de biomasa (biomasa = concentración de microorganismos
expresada en gramos de células secas / litro de cultivo), consumo de las fuentes de C y
energía, de nitrógeno y Oxígeno y las producción de CO2 y desprendimiento de calor son
algunas de las variables que pueden ser estimadas a partir de medidas experimentales y
utilizadas en el planteo y cálculo de balances de materia y energía.

Antes de proceder a considerar el sistema de análisis propuesto, es conveniente introducir

algunas definiciones y hacer ciertas consideraciones sobre algunas “regularidades”
observadas experimentalmente en el cultivo de microorganismos.

Un aspecto también importante de conocer y determinar durante la cinética de crecimiento

de microorganismos, es su biomasa, la cual de encontrarse en un medio de cultivo que
contenga todo los nutrientes necesarios para su crecimiento, ha de permitir el incremento de
éste; lo cual además se puede determinar mediante densidad óptica con la ayuda de un
espectrofotómetro, así también mediante el peso seco de la biomasa, en los cuales los
valores tanto de las absorbancias como de los pesos deben de ser crecientes.
OBJETIVOS:

1. Elaborar curva de calibrado de DNS.

2. Elaborar curva de calibrado para proteínas mediante el método de Lowry.

MARCO TEORICO:

Curva de calibrado

La curva de calibrado es un método de química analítica empleado para medir la

concentración de una sustancia en una muestra por comparación con una serie de
elementos de concentración conocida. Se basa en la existencia de una relación en
principio lineal entre un carácter medible (por ejemplo la absorbancia en los enfoques de
espectrofotometría) y la variable a determinar (concentración). Para ello, se efectúan
diluciones de unas muestras de contenido conocido y se produce su lectura y el
consiguiente establecimiento de una función matemática que relacione ambas; después,
se lee el mismo carácter en la muestra problema y, mediante la sustitución de la variable
independiente de esa función, se obtiene la concentración de esta. Se dice pues que la
respuesta de la muestra puede cuantificarse y, empleando la curva de calibración, se
puede interpolar el dato de la muestra problema hasta encontrar la concentración del
analito. Las curvas de calibración suelen poseer al menos una fase de respuesta lineal
sobre la que se realiza un test estadístico de regresión para evaluar su fiabilidad.

Método del DNS

Consiste en la reacción generada por el extremo reductor del azúcar frente el ácido 3,5-
dinitrosalícilico y su conversión en acido 3-amino-5-nitrosalicilico y ácido D-glucónico. Esta
reacción genera que el color amarillo del 3,5-dinitrosalicilico se convierta en color rojo
ladrillo. Para seguir el protocolo descrito por Miller se debe conocer la composición de
DNS que está dada por fenol, bisulfito de sodio, hidróxido de sodio, sal de Rochelle y
ácido 3,5-dinitrosalicilico. Para generar la reacción es necesario que la mezcla entre el
reactivo y el azúcar reductor se lleve a cabo mediante el calentamiento de la muestra en
un choque térmico durante en el cual se procede 5 minutos en un recipiente con agua
hirviendo para permitir la apertura de la molécula en forma de anillo y dejar el extremo
reductor expuesto para la reacción. Luego se establece el choque térmico sumergiendo la
muestra durante 5 minutos en hielo para detener tal reacción y finalmente es leído por
medio de espectrofotometría a 540nm.

Método de Bradford para determinación de proteínas

Se basa en la unión de un colorante, Comassie Blue G-250 (también Serva Blue) a las
proteínas. El colorante, en solución ácida, existe en dos formas una azul y otra naranja.
Las proteínas se unen a la forma azul para formar un complejo proteína-colorante con un
coeficiente de extinción mayor que el colorante libre. Este método es sensible (1-15 μg),
simple, rápido, barato y pocas sustancias interfieren en su determinación. Entre las
sustancias que interfieren están los detergentes y las soluciones básicas.

MATERIALES Y MÉTODOS

Elaboración de curva de calibrado para glucosa: Método de DNS

1. Se añade 1 mL de reactivo DNS a cada tubo de ensayo que contiene 1 mL de muestra

a analizar.
2. Mantener la mezcla en baño de agua a ebullición durante 5 minutos, luego enfriar con
agua helada por un tiempo de 3 minutos.
3. Añadir 5 ml de agua destilada a cada tubo de ensayo, dejar reposar por 15 minutos,
pasados estos, agitar hasta homogenizar la solución obtenida.
4. Leer las muestras a una longitud de onda de 540 nm, utilizando agua como blanco.
5. La concentración se obtiene interceptando la medida de absorbancia en la curva de
calibrado.

Determinacion de proteínas por el método de Lowry:

1 Colocar la muestra problema 0,05 mL, 0.95 mL de agua destilada y 0.5 mL

reactivo de Lowry.
2 Agitar energéticamente y dejar 15 minutos.
3 Agregar 5 mL de reactivo de Folin, agitar energéticamente y dejar 30 min en
reposo.
4 Leer la absorbancia a 500 nm.
 RESULTADOS:

A. Llenar la siguiente tabla para azucares reductores por DNS

Tubo Solucion estándar de glucosa Agua destilada mL Concentracion Absorbancia 540

(0.1 g en 50 mL) en mL g/L nm
1 0 1 Blanco 0.018
2 0.1 0.9 0.2 0.115
3 0.2 0.8 0.4 0.152
4 0.3 0.7 0.6 0.317
5 0.5 0.5 1.0 0.446
6 0.6 0.4 1.2 0.588
7 0.7 0.3 1.4 0.737
8 0.8 0.2 1.6 0.771
9 0.9 0.1 1.8 0.887
10 1 0 2 1.027

y = 1,9442x + 0,0446
R² = 0,9901
1.2
1,027
1
Absorbancia a 540 nm

0,887
0.8
0,737
0.6
0,446
0.4

0.2 0,317

0 0.018
0 0.5 1 1.5 2 2.5
Concentración de glucosa en g/L

Gráfica 1. Curva de calibrado de la concentración de la

glucosa mediante el método de DNS.
 B. Llenar la siguiente tabla para determinación de proteína Lowry:

Tubo Solucion estándar de Agua destilada Concentracion Absorbancia

seroalbumina (1 mg/ml) en (mL) (mg/mL) (500 nm)
mL
1 0 1 Blanco 0.0052

2 0.2 0.8 0.2 0.008

3 0.3 0.7 0.3 0.015

4 0.4 0.6 0.4 0.025

5 0.6 0.4 0.6 0.028

6 0.8 0.2 0.8 0.045

7 1 0 1 0.045
DISCUSION:

Hartree (1972), las lecturas de absorbancia obtenidas en la elaboración de la curva de

calibrado para determinación de glucosa, se dieron de manera decreciente y de forma
proporcional al contenido de glucosa en las muestras utilizadas, lo cual es validado con la
gráfica y el coeficiente de correlación lineal obtenido, R² = 0.9901, lo cual nos indica que
el comportamiento de los puntos, relación entre la concentración de glucosa en las
soluciones y la absorbancia tienen un comportamiento lineal, mejor dicho que a mayor
concentración de glucosa en las soluciones se obtendrá mayor absorbancia.

CONCLUSION:

 Lo obtenido es adecuado y confiable para realizar la curva de calibrado para

determinar las concentraciones de glucosa en otras soluciones, debido al
coeficiente de correlación lineal obtenido, R² = 0.9969.

BIBLIOGRAFIA:

1. Alarcón Elías; A. 2010. Producción de etanol por zymomonas mobilis. México

distrito federal; México. Tesis de maestría.
2. Bradford M (1976) A rapid and sensitive method for quantification of
microgram quantities of protein utilizing the principles of protein-dye binding.
Analytical Biochemistry 72: 248-254.
3. Buitrago Estrada Johana Carlina, Tenjo Camacho Dolly Giselle, 2007.
Obtencion de un sustrato Fermentable de origen vegetal y su evaluación con
células libres de Saccharomyces cerevisiae. Trabajo de Grado para optar el titulo
de microbiólogo Industrial.