Tema 17: Técnicas de cultivo “in vitro”

1. Introducción. Historia y aplicaciones de los cultivo in vitro

¿Qué es el cultivo “in vitro” de plantas?
El cultivo in vitro es el cultivo en un medio nutritivo artificial y en condiciones estériles de
explantos (pequeños fragmentos de plantas, semillas, órganos, tejidos, células o protoplastos), con
el fin de obtener individuos completos.

El cultivo in vitro se caracteriza porque:

 Se desarrolla a microescala.
 Se optimizan las condiciones ambientales: factores físicos, nutricionales y hormonales.
 Se excluyen todos los agentes patógenos y depredadores: hongos, bacterias, insectos y
nematodos.

Para ello, la manipulación del material se realiza en cámaras estériles como las cabinas de flujo
laminar. Se utiliza una cabina de flujo laminar para eliminación de partículas en el aire,
especialmente de posibles contaminantes (bacterias, esporas de hongos, etc.).

Historia del cultivo “in vitro”(leer)

• 1878, Hermann Vöchting observó que células de tallos eran capaces de rediferenciarse y formar
raíces y brotes, lo que demostró que la diferenciación no era permanente sino que estaba dada
por la posición relativa de la célula en la planta.
• 1898, Gottlieb Haberlandt aisló células y tejidos de plantas superiores y las colocó en soluciones
nutritivas para su crecimiento y estudio, dando origen de esta manera a la técnica de cultivo de
células y tejidos vegetales in vitro.
• 1922, se logra el primer experimento exitoso: la germinación in vitro de semillas de orquídeas.
• 1934, Gautheret cultivó células de cambium de algunas especies y encontró que el ácido
indolacético (AIA, auxina) estimulaba considerablemente su crecimiento.
• 1934, White logra el primer cultivo indefinido de raíces de tomate en medio nutritivo con
extracto de levadura. Este se considera el primer cultivo de órganos vegetales in vitro.
• 1955, Miller descubre la cinetina (citoquinina) en el esperma de arenque.
• 1957, Skoog y Miller determinan el efecto del balance auxina/citoquinina en la inducción de
respuestas morfogénicas en callo de tabaco.
• 1958, Reinert consigue la embriogénesis somática en callos de zanahoria.
• 1965, Vasil y Hildebrandt consiguen regenerar una planta de tabaco a partir de una célula
aislada.
• 1962, Murashige y Skoog desarrollaron un medio nutritivo con el que lograron un crecimiento
rápido en tejidos de tabaco.
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2. Aplicaciones del cultivo “in vitro” de plantas

 Propagación masiva de plantas (micropropagación ): principal aplicación comercial del cultivo
de tejidos vegetales. 
 Especialmente útil para especies en vías de extinción de difícil propagación por otros métodos.
Conservación de germoplasma.
 Obtención de plantas libres de patógenos (cultivo de meristemas, quimioterapia y
termoterapia).
 Producción de semillas sintéticas.
 Producción de metabolitos secundarios.
 Ingeniería genética: obtención de plantas transgénicas.
 Estudios fisiológicos diversos.

3. Las bases biológicas del cultivo de tejidos

La reproducción asexual de plantas por cultivo in vitro es posible gracias a que, en general, varias
células de un individuo vegetal poseen la capacidad regenerar un individuo completo.
 Esta capacidad se denomina totipotencialidad celular, y es característica de las células
meristemáticas o indiferenciadas (Haberlandt, 1902).
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 En células diferenciadas se pierde parcialmente la totipotencialidad, pero puede recuperarse

(desdiferenciación) para dar lugar a células meristemáticas
 Las células previamente desdiferenciadas pueden diferenciarse de nuevo (rediferenciación)
para dar lugar a la regeneración de una planta completa.
 Todo proceso de diferenciación está regulado por el balance entre diferentes tipos de
reguladores del crecimiento, fundamentalmente de auxinas y citocininas.

AUXINAS
El nombre auxina significa en griego 'crecer' y es dado a un grupo de compuestos que estimulan la
elongación de las células. El ácido indolacético (AIA) es la auxina natural predominante.
CITOCININAS
Las citocininas son hormonas vegetales naturales que derivan de adeninas sustituidas y que
promueven la división celular en tejidos no meristemáticos.

4. Efecto de los reguladores de crecimiento en el cultivo in vitro

En cultivo “in vitro”

- Las AUXINAS se emplean para promover la formación de RAÍCES
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- Las CITOCININAS se emplean para estimular la formación de BROTE

- La combinación de ambas da lugar a la formación del callo

Las células vegetales (explantos) cultivados in vitro y con hormonas vegetales adicionadas al medio
de cultivo, pueden producir dos tipos de respuesta:
• Organogénesis o embriogénesis indirecta. Desdiferenciación celular acompañada de
crecimiento tumoral, que da lugar a una masa de células indiferenciadas denominada callo, la
cual bajo las condiciones adecuadas es capaz de generar órganos o embriones somáticos.
• Organogénesis o embriogénesis directa una respuesta morfogenética directa, sin pasar por la
etapa de callo, por la cual se forman órganos (organogénesis) o embriones (embriones
somáticos) a partir del propio explanto.

o La organogénesis es de origen pluricelular. Un grupo o cluster de células del explanto inicial

se desdiferencia inicialmente para luego rediferenciarse dando lugar a un órgano vegetal.
o La embriogénesis se presupone de origen unicelular. Una célula del explanto se aísla y
constituye el punto de partida para la obtención de un embrión somático (sin participación
de gametos). Se diferencian embriones o estructuras bipolares que completan cada una de
las etapas implicadas en la ontogenia de un embrión cigótico.

5. Vías de regeneración de plantas por cultivo in vitro

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Micropropagación
 La propagación de plantas in vitro es una técnica muy utilizada en cultivos de importancia
económica.
 Permite cultivar células, tejidos, órganos, semillas, embriones y obtener individuos selectos
de forma rápida
Etapas necesarias para generar plantas a partir de explantos aislados:
Fase 0: Selección y preparación de la planta madre/donante. Estos dos son comunes
Fase 1: Establecimiento de los cultivos axénicos. a todos los protocolos
Fase 2: Multiplicación del material.
Fase 3: Enraizamiento y obtención de plantas completas.
Fase 4: Aclimatación y rusticación de las plantas obtenidas

Fase 0: Selección y preparación de la planta madre/donante.

 Selección de plantas donantes. El material inicial es una planta élite seleccionada por
características fenotípicas especiales
 Estado fisiológico de la planta donante. Generalmente, se utilizan plantas en estado de
crecimiento activo: vigoroso y sano.
• Selección y crecimiento de la planta madre bajo condiciones higiénicas
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• Crecimiento de las plantas en ambientes controlados

• Pretratamientos con reguladores de crecimiento
Fase 1: Establecimiento de los cultivos axénicos.
 Elección del explante (parte separada del vegetal ya sea células, protoplastos, tejidos u
órgano).
 Desinfección del explante. El éxito de los sistemas de propagación de plantas por
biotecnología depende en gran medida del control y prevención de la contaminación
microbiana.
• Desinfección superficial sin dañar el explante.
• Etanol 70 %, hipoclorito sódico o agua oxigenada

 Trabajo en condiciones de asepsia. Equipamientos que generen las condiciones necesarias

de esterilidad, como los flujos laminares
 Medio de cultivo líquido o semisólido
Composición del medio de cultivo:
• Agua destilada: representa el 95% del medio
• Fuente de carbono: generalmente se usa sacarosa. La fuente de carbono se necesita porque
los explantos no son completamente autótrofos
• Sustancias inorgánicas: macroelementos (N, P, K, Ca, Mg, S) y microelementos (Fe, Co, Zn, Ni,
B, Al, Mn, Mo, Cu, I), en una proporción adecuada según la planta elegida
• Vitaminas: Vitaminas B1, B2, B6, vitamina H, vitamina E, ácido fólico, ácido nicotínico, entre
otras. Fase 1. Establecimiento de los cultivos axénicos.
• Hormonas y reguladores del crecimiento como auxinas, citoquininas y giberelinas.
• Materiales inertes se usan como soporte agar, agarosa, otros polisacáridos, lana de vidrio,
papel de filtro, arena.

Fase 2: Multiplicación del material.

 Tras un período de crecimiento es necesario el subcultivo y paso a un nuevo medio.
 En este paso se produce la multiplicación de las partes aéreas de las plantas. MEDIO
RELATIVAMENTE RICO EN CITOCININAS
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Fase 3: Enraizamiento
 Se busca la formación de raíces con el fin de convertir los brotes en plántulas completas.ç
 Se transfieren los brotes obtenidos durante la fase de multiplicación a un medio que sólo
contenga auxinas.

Fase 4. Aclimatación o rusticación de las plantas micropropagadas

 Aclimatación de las plántulas obtenidas in vitro a las condiciones ambientales ex vitro
(suelo o algún sustrato inerte)
 Los explantes recién enraizados son muy sensibles a los cambios ambientales, de manera
que el éxito o el fracaso de todo el proceso depende de la aclimatación.
 Después de la transferencia de las condiciones de in vitro a ex vitro, las plántulas tienen
que corregir esta anormalidad.
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 Después del pasar a condiciones ex vitro, las plantas usualmente necesitan un período de
aclimatización, donde se tiene en cuenta la humedad, irradiancia, temperatura,
concentración de CO2 y flujo de aire.
 El proceso de aclimatación debe ser gradual, disminuyendo progresivamente la humedad
relativa e incrementando progresivamente la intensidad de luz.
Micropropagación vs. propagación vegetativa convencional
o Es posible propagar algunas especies recalcitrantes que no se propagan “in vivo”.
o Se necesita muy poco material de partida.
o El crecimiento es mayor por rejuvenecimiento y sanidad.
o Se requiere poco espacio para el cultivo del material.
o Se elimina el efecto estacional.
o Simultáneamente se “limpia” el material.

Embriogénesis somática
La embriogénesis somática, es la capacidad que poseen ciertas células vegetales de formar
embriones por un proceso semejante a la embriogénesis cigótica.

Etapa 1. Inducción formación de masas proembriónicas con auxinas

o En la embriogénesis somática directa, los embriones aparecen directamente sobre el explante
original.
o En la embriogénesis somática indirecta, los embriones se originan a partir de un callo o a partir
de una suspensión de células embriogénicas.
Etapa 2. Histodiferenciación embriones en estadío globular, de corazón, de torpedo, cotiledonar
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(sin auxinas).

Etapa 3. Maduración embriones en estado cotiledonar con ABA, desecación.

Etapa 4. Germinación

Embriones somáticos encapsulados: SEMILLAS ARTIFICIALES

Cultivo de meristemas
 El meristema apical (tiene un tamaño entre 0,01 y 0,3 mm), tejido embrionario que tiene la
capacidad de formar todos los tejidos de la planta.
 A partir de ellos se pueden regenerar plantas completas
 Útil para la obtención y multiplicación de plantas libres de virus por medios artificiales juega un
papel importante para mejorar la producción y calidad.

Cultivo de células y órganos vegetales en biorreactores

Los callos a partir de algún explanto, los mismos pueden disgregarse para obtener una suspensión
de células:
1. Puede utilizarse para generar embriones somáticos
2. Puede directamente cultivarse para producir metabolitos secundarios:
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o Mentol
o Compuestos anticancerígenos (taxol)
o Edulcorantes