TÉCNICAS INSTRUMENTALES

TEMA 2: ESPECTROMETRÍA DE MASAS

Un espectrómetro de masas se utiliza para determinar las masas de determinadas partículas con
distintos estados de carga de una mezcla, pudiendo separarlas en función de su masa molecular y su
patrón de fragmentación. Se suele combinar con una previa separación de analitos a través de electroforesis
bidimensional, cromatografía en columna o cromatografía instrumental.

Se suelen representar en el eje X el cociente masa/carga,

pero normalmente la carga es 1 por ello será la masa del
analito ; mientras que en el eje Y estará la abundancia.
En primer lugar se medirán las masas de las moléculas
intactas,pero con solo la masa no sirve debido a que
diferentes proteínas pueden tener la misma masa como es
el caso de los isótopos. Después se deberá llevar a cabo
una fragmentación de forma controlada para poder
identificarlas; se escoge el péptido a fragmentar a través de
filtros con campos magnéticos y eléctricos denominados
trampa de iones. En el patrón de fragmentación podemos
asociar los fragmentos a aminoácidos concretos debido a
que la diferencia de dos péptidos de tamaños cercanos es
la de un aminoácido que tendrá masa conocida. Siendo
muy fácil en proteínas porque solo hay 20 aminoácidos
pero en otras especies como ácidos orgánicos es más complicado.

Las etapas que presenta la espectrometría de masas son:

1. Vaporización. Pasar la muestra que se encuentra en un tejido o en una disolución a fase gaseosa
2. Ionización. Se ionizan las moléculas vaporizadas para que adquieran carga
3. Separación de masas. Se seleccionan las masas y almacenan con campos eléctricos
4. Detección del ión. Se detecta la señal de abundancia al impactar los analitos contra el detector

Como solo se pueden detectar iones será necesario ionizar las muestras a través de las siguientes técnicas:
➔ Clásicas
● Ionización por impacto de electrones. Es la técnica más utilizada, consistiendo en introducir los analitos
dentro de una cámara con un flujo de electrones de forma transversal. Los electrones se acelerarán al
aplicarse un campo eléctrico para que impacten sobre los electrones de los analitos siendo capaces de
arrancarlos y dejarlos ionizados.
○ La ventaja es que es universal, ionización cualquier molécula
○ La desventaja es que con la alta energía se rompen muchos enlaces y produce fragmentación,
pudiendo inducir reacciones que alteren las moléculas
● Ionización química. Técnica menos violenta que el impacto de electrones pretendiendo que no se de
una fragmentación masiva, consistiendo en reacciones con cationes ácidos cediendo el protón para
conseguir la ionización. Se tendrá en cuenta que el analito sale con +1 de masa debido a dicho. En
algunos casos los analitos son inestables y acabarán fragmentándose, pero su espectro será más
sencillo que con el anterior caso.
○ La ventaja es que no vemos interferencia de compuestos no deseados
○ La desventaja es que no es universal, es selectiva porque sólo algunas moléculas pueden
ionizarse como básicas o que acepten fácilmente un protón

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Normalmente se combinan ambas técnicas debido a que cuando se realiza el impacto electrónico no se ve
muchas veces el analito completo sino otros fragmentos, por ello se comprobará con ionización química.

➔ Modernas
● Vaporización térmica. Es la técnica más habitual, consistiendo en utilizar energía térmica para vaporizar
sustancias termoestables menores de 1000 amu. Se alcanzan temperaturas de 500 grados, haciendo
que aquellas que no son muy volátiles se derivatizan.
● Desorción ionización láser MALDI. Se desarrolló como solución a las macromoléculas que en la
vaporización térmica no se vaporizan mayores de 10^6 amu. Se utilizan láseres para calentar
rápidamente en un punto concreto y que el resto de la muestra quede a temperatura ambiente, lo que
hará que por expansión se enfríe totalmente muy rápido.
La muestra se mezcla con una matriz orgánica denominada matriz que está en exceso con respecto a
la muestra. Diferentes compuestos pueden actuar como matriz, pero deberán tener una estructura
concreta compuesta de un grupo aromático y un grupo ácido. Dicha matriz es la que se excita para que
la molécula no reciba la energía y se fragmente. Cuando la matriz sublima, arrastrará la muestra a la
fase gaseosa y le transferirá un protón a modo de ionización química. Los analitos pueden tener
diferentes números de carga porque se pueden protonar varias veces.
● Electronebulización ESI. La muestra deberá ir disuelta en un tampón con electrolitos y al salir se
producirá pulverización formando aerosoles que pasarán a una atmósfera seca de nitrógeno o CO2
para evaporar el disolvente. Esto hará que se vuelvan inestables porque las cargas estarán más cercas
dando repulsiones de Coulomb provocando la fragmentación, quedando los analitos cargados de forma
poco específica. El analito puede quedar cargado con bastantes cargas de forma que veremos
diferentes picos que corresponden al mismo péptido pero con diferentes cargas.
MALDI y ESI son especialmente adecuados para la caracterización de polímeros ya sean naturales o sintéticos.

Cuando se caracterizan los polímeros obtenemos picos que tienen diferentes decimales, esto se debe a que los
elementos tienen decimales en su masa que se conoce como defecto de masas a excepción del carbono que es
el único que tiene masa exacta. También se tendrá en cuenta respecto al carbono que en ocasiones aparecen
picos a la derecha, esto se debe a que no todos los carbonos de la molécula serán C12 ya que en 1,1% será
C13 que tiene mayor peso molecular. Cuanto más larga sea la cadena, más probabilidad habrá de C13.

Se pueden analizar los analitos respecto a su masa antes de

fragmentarse a través de un analizador de iones por tiempo de
vuelo Los iones estarán en fase gas y se acelerarán con un
campo eléctrico constante hasta un momento en el que se para
dejando una zona libre de campo denominada tubo de vuelo.
En esta zona los analitos avanzan hasta el detector, tendrán
igual energía cinética haciendo que la velocidad con la que
vayan depende de su masa. De forma que aquellos que lleguen
antes tendrán mayor velocidad y menor masa.
Para obtener una mayor resolución se deberá realizar con un tubo que sea más largo. Normalmente se realizará
primero con un polimero del que se sabe las longitudes de la cadena que tiene para calibrar el tiempo respecto
de la masa. Con nuestros analitos se puede realizar una recta de calibrado en la que representemos el tiempo
de vuelo frente a masa/carga para saber la masa que tienen.

Orbitrap es un analizador que posee alta resolución ya que permite ver incluso hasta el cuarto decimal. Consiste
en un electrodo en forma de ovillo que captura electrones y los pone a orbitar a su alrededor, con una frecuencia
de órbita dependiendo de su masa/carga. La trayectoria de los iones se guia con lentes electrostáticas por su
carga negativa para que pasen por un canal guía con barras y campos electricos para ser almacenados antes
del detector para que salgan todos a la vez hacía el orbitrap. Empezarán a orbitar y cada uno tiene una
frecuencia de oscilación distinta, se utilizará la transformada de Fourier para saber su masa debido a que lo que
se obtiene es una suma de todas las frecuencias que deberá ser procesada. Si queremos identificar uno de los
iones se deberá elegir y fragmentar haciendo espectrometría de masa/masa, los canales guía aplican un campo
eléctrico para desviar el resto. El ion pasa a un canal de fragmentación donde colisionan y se rompen para ser
almacenados y pasar al orbitrap.

Otro analizador importante es el del cuadrupolo eléctrico que consiste en un canal formado por cuatro cilindros
dispuestos simétricamente sobre los que se aplica un voltaje positivo/negativo de forma alterna. Los iones se

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repelen por los cilindros con su misma carga y se atraen por los de carga opuesta; pero los polos cambian de
polaridad rápidamente antes de que el iones llegue al cilindro provocando una oscilación indefinida y que la
molécula quede en el medio que permitiendo almacenar los iones sin que se desvíen.
➔ Si el voltaje es alto, los iones de baja masa/carga se aceleran demasiado y aunque se cambie la
polaridad se perderán al chocar con el cuadrupolo neutralizándose
➔ Si el voltaje es bajo, los iones de alta masa/carga no pueden frenar su inercia y se perderán al chocar
con el cuadrupolo neutralizándose

Los péptidos pueden fragmentarse en 3 sitios por cada aminoácido, coincidiendo con su masa y necesitando
una nomenclatura determinada. De forma que se nombra por x,y,z los fragmentos que contienen el grupo CO
terminal y por a,b,c los que contienen el grupo NH terminal.
● Rotura de enlace C-CO dando un fragmento an y xn
● Rotura de enlace CO-NH dando un fragmento bn y ym
● Rotura de enlace NH-C dando un fragmento cn y zm
En función de las masas de los fragmentos que se forman podemos
obtener la secuencia minoácidica original que será único.

Al igual se puede realizar con los ácidos nucléicos que será más fácil porque habrá 4 roturas o con los
olignonucleótifos aunque serán más difíciles por sus ramificaciones y múltiples puntos de ruptura. Por lo que
para los oligosacáridos se realizará la fragmentación controlada múltiple hasta 10 veces.

Para separar iones de igual masa o parecida pero distinto tamaño se utilizará la separación por movilidad iónica,
que consiste en acelerarlos suavemente hacia la celda de interacción. En esa celda habrá un fluido que será gas
inerte; de forma que cuanto más grande sea la molécula más le costará atravesar el fluido porque tendrá mayor
rozamiento asemejando a una cromatografía de exclusión por tamaño. En el caso de que las dos moléculas
tengan igual masa, la que esté más compactada atravesará antes. Esto será un método no destructivo ya que se
puede diferenciar iones sin necesidad de fragmentar.