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RESEÑAS cro

Hacia sangre de donante universal: conversión enzimática de

tipo A y B a tipo O
Publicado, Papers in Press, 2 de diciembre de 2019, DOI 10.1074/jbc.REV119.008164

Pedro Rahfeld‡§yXStephen G. Withers‡§¶1

Desde el‡Departamento de Química, Universidad de Columbia Británica, Vancouver, Columbia Británica V6T 1Z1, el§Laboratorios Michael
Smith, Universidad de Columbia Británica, Vancouver, Columbia Británica V6T 1Z4, y el¶Departamento de Bioquímica y Biología Molecular,
Universidad de Columbia Británica, Vancouver, Columbia Británica V6T 1Z3, Canadá

Editado por Chris Whitfield

La transfusión de sangre, o más comúnmente de glóbulos rojos (RBC), es parte
integral de los sistemas de atención médica en todo el mundo, pero requiere una
cuidadosa comparación de los tipos de sangre para evitar consecuencias adversas
graves. De los cuatro tipos de sangre principales, A, B, AB y O, solo se puede
administrar O a cualquier paciente. Esta sangre tipo O de donante universal es
crucial para situaciones de emergencia donde el tiempo o los recursos para tipificar
son limitados, por lo que a menudo escasea. La sangre A y B difiere del tipo O en la
presencia de un antígeno de azúcar adicional (GalNAc y Gal, respectivamente) en el
antígeno H central que se encuentra en los glóbulos rojos de tipo O. Por lo tanto, la
conversión de los glóbulos rojos A, B y AB en glóbulos rojos de tipo O debe lograrse
mediante la eliminación de ese azúcar con una glucosidasa apropiada. La primera
demostración de una conversión de B a O realizada por Goldstein en 1982 requirió
cantidades masivas de enzima, pero permitió transfusiones de prueba de principio
sin efectos adversos en humanos. Nuevo--galactosidasas y
- - norte-acetilgalactosaminidasas se identificaron mediante la detección de
bibliotecas bacterianas en 2007, lo que permitió una conversión mejorada de
B y las primeras conversiones útiles de glóbulos rojos de tipo A, aunque en
condiciones limitadas. En 2019, la selección de una biblioteca metagenómica
derivada de las heces de un donante AB permitió el descubrimiento de un
sistema de dos enzimas significativamente más eficiente, que involucra una
Gal-NAc desacetilasa y una galactosaminidasa, para la conversión A. Este
prometedor sistema funciona bien tanto en condiciones estándar como en
sangre completa. Discutimos los desafíos y oportunidades restantes para el
uso de tales enzimas en la conversión de sangre y el trasplante de órganos.
La transfusión de sangre es una parte indispensable del sistema de
atención médica y salva miles de vidas cada año. Para que esto sea posible,
-85 millones de unidades de concentrados de glóbulos rojos (RBC)2
se obtienen anualmente en todo el mundo, según la Cruz Roja, en gran
parte a través de donaciones. Esto requiere una organización masiva
para asegurar los suministros y, sin embargo, según el World Health
Este trabajo fue apoyado por los Institutos Canadienses para la Investigación en Salud y
la Deutsche Akademie der Naturforscher Leopoldina. Los autores son nombrados
inventores en una presentación de patente de la Universidad de Columbia Británica
con respecto a las enzimas que pueden usarse para eliminar los antígenos A de los
glóbulos rojos.
1A quién debe dirigirse la correspondencia: Departamento de Química, Universidad
Organización, se espera que la demanda de glóbulos rojos siga creciendo (2).
Este crecimiento es impulsado en parte por el envejecimiento demográfico
de la población y el consiguiente aumento de los procedimientos intensivos
en sangre, como los trasplantes de órganos sólidos, los trasplantes de
células madre hematopoyéticas, la reanimación de hemorragias y la
quimioterapia agresiva contra el cáncer. Para contrarrestar esta demanda,
se han realizado mejoras significativas en la recolección y gestión del
suministro de componentes sanguíneos, incluida la reevaluación de las
políticas sobre cuándo se necesita sangre y en qué cantidades. Esto ha
ayudado a reducir el uso de hemoderivados, estabilizando un poco el
suministroversusdemanda. Sin embargo, persisten los problemas,
especialmente dado el desafío de hacer coincidir correctamente los tipos de
sangre en todas las ocasiones.
El sistema de grupos sanguíneos humanos es complejo; Se conocen 30
grupos sanguíneos discretos, definidos por 270 antígenos más 38 que no
han sido asignados a un grupo en particular (3). Estos antígenos de grupos
sanguíneos se basan en epítopos de oligosacáridos (antígenos ABO, P y
Lewis) o en secuencias de aminoácidos específicas de proteínas (antígenos
Rh, Kell y Duffy). La mayoría de los antígenos están integrados en la
membrana celular, pero algunos, como el sistema de Lewis, son antígenos
plasmáticos que se adsorben en la superficie de los glóbulos rojos.4). Los
antígenos de carbohidratos A, B y H (tipo O) del sistema de grupo sanguíneo
ABO son los más importantes clínicamente (3, 5), con alrededor de 1 millón
de antígenos presentes en la superficie de cada RBC (6). La compatibilidad
cuidadosa de los tipos de sangre ABO del huésped y del donante es esencial
para evitar eventos de incompatibilidad transfusional, que son fatales en el
10% de todos los casos (7). Esto se aplica a la transfusión de sangre
completa, glóbulos rojos o plaquetas, así como a los trasplantes de tejidos u
órganos, porque los antígenos ABO no solo están presentes en los glóbulos
rojos, sino también en la mayoría de los demás tejidos del cuerpo humano.
Las únicas excepciones son los llamados no secretores, para quienes una
mutación en una de las fucosiltransferasas conduce a la ausencia de
antígenos ABH en las células epiteliales secretoras de las glándulas salivales,
el tracto gastrointestinal y las cavidades respiratorias.8).
Por lo tanto, en circunstancias sin prisas, la transfusión se realiza con
sangre de donante cuyos antígenos se asemejan lo más posible a los
del receptor. Para confirmar la compatibilidad, se realizan estudios de
compatibilidad cruzada en los que se mezclan pequeñas muestras de
sangre del donante y del receptor y se monitorean para detectar

Ciudad de British Columbia, 2036 Main Mall, Vancouver, British Columbia V6T 1Z1,
Canadá. Teléfono: 604-822-3402; Correo electrónico:withers@chem.ubc.ca.
2Las abreviaturas utilizadas son: RBC, glóbulo rojo; GTA y GTB, A-
y B-transferasa, respectivamente; Cer, ceramida; FUT, 2--
-fucosiltransferasa(s); ECO-RBC, O RBC convertido en enzima; DeAc,
desacetilasa; GalN, galactosamina.
posibles reacciones de aglutinación que indicarían una interacción
antígeno/anticuerpo. En situaciones de emergencia se emplea sangre
tipo O “universal” (preferiblemente O negativa) porque, como se explica
a continuación, es compatible con sangre A, B, AB y, por supuesto, tipo
O. Incompatibilidades menores debidas a otro antígeno

J. Biol. química(2020) 295(2) 325–334325

© 2020 Rahfeld and Withers. Publicado bajo licencia exclusiva por la Sociedad Americana de Bioquímica y Biología Molecular, Inc.
COMENTARIOS DE JBC:Hacia el donante universal de sangre
Figura 1.A, descripción general de los antígenos básicos A, B y H en la superficie de los glóbulos rojos tipo A, B y O.B, representación de la compatibilidad de transfusiones de sangre (flechas negras, se
puede transfundir;lineas grises, sin transfusión). O Los glóbulos rojos son los únicos que carecen de un antígeno de grupo sanguíneo reconocido y, por lo tanto, pueden ser donados universalmente.
Los azúcares se muestran utilizando la notación Consortium for Functional Glycomics (12).
los desajustes no suelen poner en peligro la vida. Esta revisión proporciona
una breve reseña de los antígenos sanguíneos y luego describe los intentos
de convertir la sangre A, B y AB en sangre tipo O mediante la eliminación
enzimática de sus antígenos glicanos diferenciadores. Las tecnologías
desarrolladas deben ser compatibles con los procedimientos actuales de
recolección, almacenamiento y manejo de sangre. Por lo general, después
de la recolección en bolsas estériles, la sangre se almacena a temperatura
ambiente durante 24 h y luego se enfría a 4 °C y se puede almacenar hasta
por 42 días. La mayor parte de la sangre se separa en sus componentes de
plasma, glóbulos rojos y plaquetas al principio del proceso, y la transfusión
más común se realiza con glóbulos rojos en lugar de sangre completa.
En este informe, revisamos los métodos que se han empleado para
identificar las enzimas que funcionan de manera eficiente en las condiciones
de pH neutro requeridas por los glóbulos rojos, lo que culminó con la
reciente identificación de un par de enzimas altamente eficientes del
microbioma intestinal humano. Para excelentes revisiones que brindan más
detalles sobre las primeras etapas de este camino de descubrimiento,
remitimos al lector a las siguientes publicaciones: Olsson (9), Olsson y
Clausen (10), y Garratty (11).
El sistema de grupos sanguíneos ABO definido
La estructura base del sistema de grupos sanguíneos ABO es el
antígeno fucosil galactosa H de la sangre tipo O (Figura 1A), que se une
a glicoproteínas y lípidos en la superficie de los glóbulos rojos y otros
tejidos. Los antígenos A y B se diferencian de este antígeno H por la
adición de un resto de azúcar extra, siendo esto--Gal-NAc para tipo A o-
-galactosa para los glóbulos rojos tipo B y ambos en el caso del tipo AB (
Figura 1A). Los individuos con sangre tipo A albergan anticuerpos anti-
B, con el resultado de que la transfusión de un individuo A con glóbulos
rojos tipo B conduciría a la aglutinación de los glóbulos rojos y la
hemólisis subsiguiente. Asimismo, la sangre de tipo B
326J. Biol. química(2020) 295(2) 325–334
contiene anticuerpos A; por lo tanto, la transfusión complementaria no
podrá realizarse. Las personas con sangre tipo O albergan anticuerpos
anti-A y anti-B; por lo tanto, pueden recibir solo sangre tipo O.
Los glóbulos rojos de tipo O tienen un estado especial, porque los
antígenos H en su superficie no son reconocidos por los anticuerpos anti-A o
anti-B, y no se forma ningún anticuerpo H (O) específico, probablemente
porque los antígenos A y B se sintetizan a través del antígeno H, que por lo
tanto se reconoce como "propio". En consecuencia, los glóbulos rojos tipo O
se pueden utilizar como donante universal para cualquier otro tipo de
sangre ABO y, por lo tanto, tienen una gran demanda (Figura 1B). Como
puede verse entabla 1, la distribución de los tipos de sangre varía según la
raza demográfica. El tipo O es el más común en todos los casos, seguido por
A y luego B, con solo un pequeño número de AB. El segundo antígeno
clínicamente más importante es el factor Rh (D), que es una proteína
transmembrana y hace que el individuo sea Rh positivo (Rh-) (3, 13, 14). La
gran mayoría de las personas son Rh-, con solo el 18% de los caucásicos
siendo Rh negativo (Rh) y otros grupos raciales aún menos, como se muestra
entabla 1(15). Los pacientes Rh pueden producir anticuerpos contra la
proteína Rh, en cuyo caso no pueden recibir sangre de individuos Rh
positivos. Esta es una preocupación particular durante el parto si el feto es
Rh positivo y la madre Rh negativa porque, si la sangre fetal ingresa al
torrente sanguíneo materno, induciría anticuerpos anti-Rh. Aunque estos no
son un problema en ese momento, esto podría ser un problema durante un
embarazo posterior si el feto es Rh-. En ese caso, los anticuerpos maternos
podrían atravesar la placenta y destruir los glóbulos rojos fetales. Los
segundos embarazos después de un desajuste inicial son, por lo tanto,
especialmente vigilados mediante la medición de los niveles de anticuerpos
anti-Rhesus. Si se sospechan problemas, se administra una inyección de
inmunoglobulina Rh a las 28 semanas para suprimir la formación de
anticuerpos Rh.

tabla 1
Distribución de los grupos ABO y Rh (D)
Datos dehttps://www.redcrossblood.org/donate-blood/blood-types.html. (Tenga en
cuenta que JBC no es responsable del archivo y mantenimiento a largo plazo de este sitio
o de cualquier otro sitio alojado por terceros).
Rh (D)-positivo Rh (D)-negativo
Raza
demográficoa O- A- B- AB- O AB AB
% % % % % % % %
caucásico 37 33 9 3 8 7 2 1
Afroamericano 47 24 18 4 4 2 1 0.3
asiático 39 27 25 7 1 0.5 0.4 0.1
latinoamericano 53 29 9 2 4 2 1 0.2
aDatos basados en la población de los Estados Unidos.
Alrededor del 1 al 8 % (O ) de la población de los Estados Unidos son, por lo
tanto, donantes universales “verdaderos”, mientras que del 37 al 53 % (O-)
son donantes universales dentro del grupo (muy grande) Rh (D) positivo. En
consecuencia, la sangre tipo O siempre tiene una gran demanda,
especialmente en situaciones de emergencia donde no hay tiempo para
tipificar el grupo sanguíneo o simplemente no hay posibilidad de realizarlo.
En particular, al menos en situaciones de emergencia en Canadá, las
unidades Rhesus positivas se transfunden a todos los receptores, excepto a
las mujeres en edad fértil, independientemente del estado Rhesus del
receptor. Así, aunque es el mayor de los grupos sanguíneos dentro de la
población mundial, existe una escasez constante de sangre tipo O.
Subtipos de antígenos ABH y su biosíntesis
Los antígenos ABH del grupo sanguíneo ABO están compuestos por
cadenas de carbohidratos unidas a glicolípidos (-10%) o glicoproteínas
(-90%). Estos antígenos existen como una serie de subtipos que difieren
en los enlaces internos dentro del oligosacárido de enlace, como se
muestra enFigura 2. Curiosamente, la expresión de estos antígenos en
los tejidos puede ser específica de un órgano, con implicaciones
importantes para el trasplante de órganos.16, 17).
Estos glicanos se construyen a partir de dos grupos principales
de carbohidratos. Lactotriaosilceramida (GlcNAc---3-gal---4- Glc--
-Cer) forma la estructura central de los tipos de enlace de antígeno
Tipo 1, 2 y 3 (18 –21). Transferir a este de galactosa en un
- - 3 varillaje o--4 enlace seguido de fucosa en un-El enlace -2 con la
galactosa produce los antígenos H tipo 1 y tipo 2, respectivamente. A
partir de estos, los antígenos A y B se derivan a través de la
transferencia de GalNAc o galactosa por la A-transferasa (GTA) o la B-
transferasa (GTB), respectivamente (22). La extensión adicional del
antígeno A de tipo 2 por transferencia de galactosa y fucosa produce el
antígeno H de tipo 3, que se puede decorar nuevamente con GalNAc, lo
que produce el antígeno A de tipo 3, que también se denomina A
repetitivo, debido a la repetición de la estructura del trisacárido (21).
Alrededor del 50% de los antígenos de tipo 2 A sintetizados en
glicolípidos se modifican aún más a estos antígenos de tipo 3 (21).
La otra estructura central es la de globotriaosilceramida (Gal-
--1,4-gal---1,4-Glc---Cer, Gb3 o Pk), a partir del cual se construye
el enlace del antígeno Tipo 4 (20). La adición inicial de--3-
GalNAc produce el antígeno P; la posterior adición de galactosa
y fucosa produce el antígeno tipo 4 H, del cual se deriva el
antígeno tipo 4 A por transferencia de GalNAc (23) (Figura 2).
El 2---fucosiltransferasas (FUT) juegan un papel clave en la definición de
qué tejidos dentro del cuerpo presentan antígenos del grupo sanguíneo
ABO. FUT1, que produce los antígenos H tipo 2 y tipo 4, es el más importante
en términos de producción de antígenos basados en glóbulos rojos.
COMENTARIOS DE JBC:Hacia el donante universal de sangre
ción (24, 25), mientras que FUT2 se requiere específicamente para la
formación de los antígenos H tipo 1 y tipo 3. Esta última enzima está
inactiva en el 20% de la población caucásica, lo que lleva al fenotipo no
secretor mencionado anteriormente, en el que la mayoría de los no
secretores ya no presentan los antígenos ABH.8). La pérdida de FUT1 y
FUT2 conduce al raro fenotipo Bombay, que se caracteriza por la
ausencia de antígenos H en los glóbulos rojos. Los pacientes de
Bombay solo pueden recibir transfusiones autólogas o sangre de otro
individuo del grupo sanguíneo de Bombay. FUT3 a FUT7 son
responsables de la producción de antígenos de Lewis mediante la
adición de--1,4- o--1,3-fucosa a residuos de GlcNAc/galactosamina del
precursor apropiado. La presencia de los antígenos sanguíneos ABO y
sus diferentes tipos de enlace variarán entre los diferentes tejidos del
cuerpo (26).
Los tipos de sangre A se clasifican además como A1o un2basado en la
densidad de los antígenos en la superficie de RBC y específicamente en la
presencia de la estructura repetitiva Tipo 3A en A2glóbulos rojos. Esta
diferencia tiene sus raíces en las enzimas GTA que tienen mayor actividad en
A1glóbulos rojos que en A2. Como consecuencia, en el más frecuente A1
glóbulos rojos, se modifican más antígenos H y se forman cada uno de los
subtipos de tipo 1, 2, 3 y 4. Por el contrario, en el tipo A2En los glóbulos rojos,
la mayoría de los antígenos H no están modificados y solo se forman
antígenos de tipo 2 en niveles significativos, con muy poca formación de
enlaces de tipo 1 y 4 y ninguna formación de tipo 3. De hecho, la distinción
experimental de A1a partir de una2Los glóbulos rojos se basan en
anticuerpos contra la estructura de tipo 3. Se conocen otros subgrupos A y B
pero no son tan comunes como A2.
Conversión enzimática del tipo de sangre, primera generación
El hallazgo de que la única diferencia aparente entre los glóbulos rojos A,
B y O reside en la presencia o ausencia de Gal-NAc o Gal en el antígeno H
terminal planteó la posibilidad de que los glóbulos rojos A y B pudieran
convertirse en glóbulos rojos O si eso el azúcar podría eliminarse
selectivamente (Fig. 3). Dichos glóbulos rojos O convertidos enzimáticamente
(ECO-RBC) podrían usarse como sangre de donante universal en lugar de la
sangre de tipo O normal, aunque este procedimiento claramente no
afectaría el estado Rh de los glóbulos rojos. En consecuencia, la conversión
de los glóbulos rojos A y B produciría O-, mientras que los glóbulos rojos A y
B producirían O.
Los primeros informes completos que demuestran la viabilidad de dicha
conversión enzimática fueron publicados por Goldstein y sus colegas (27, 28)
a principios de la década de 1980, con base en los hallazgos preliminares de
Sharon y su grupo (29). El grupo de Goldstein se centró en la conversión de
glóbulos rojos B en lugar de A, principalmente porque en ese momento, la
única enzima disponible comercialmente que podría ser aplicable a tal tarea
era la--galactosidasa de granos de café verde. El pH óptimo bajo de esta
enzima requería que la conversión se realizara en condiciones subóptimas
para los glóbulos rojos (pH 5,7) y usando grandes cantidades de enzima. No
obstante, se confirmó la conversión completa al antígeno H y se
establecieron la estructura y viabilidad de los glóbulos rojos. Después de
demostrar que los eritrocitos B convertidos de los gibones podían volver a
transfundirse de forma segura a los gibones donantes y que los eritrocitos
transfundidos disfrutaban de tiempos de circulación normales, el equipo
pasó a un pequeño ensayo en humanos con tres pacientes de tipo
sanguíneo A, B y O. del donante de tipo B se convirtieron y luego, después
de lavar para eliminar la enzima, se inyectaron muestras de 5 ml de ECO-RBC
empaquetados en voluntarios. Otra vez,
J. Biol. química(2020) 295(2) 325–334327
COMENTARIOS DE JBC:Hacia el donante universal de sangre

Figura 2. Presentación de los tipos de enlaces de antígenos sanguíneos presentes en los glóbulos rojos de diferentes tipos de sangre.A, presentación de la diferencia de los
cuatro tipos de enlaces en los glóbulos rojos.B, los grupos principales son O, B, A1, y A2. La sangre de tipo O que presenta los diferentes antígenos H es el punto de partida para la
síntesis de los antígenos A y B, dependiendo de si está presente un GTA o GTB. Subgrupo A2solo posee un GTA de baja actividad (débil), lo que conduce a solo cantidades menores de
producción de antígenos tipo 1 y 4 A (esto está simbolizado por eldesteñidoantígenos) y sin producción de Tipo 3. Los azúcares se muestran utilizando la notación Consortium for
Functional Glycomics (12).

Se demostró que los ECO-RBC exhiben una vida media normal y son bien
tolerados. Este mismo grupo realizó un seguimiento de estos estudios a principios
de la década de 1990 y demostró que, inicialmente, una unidad completa (200 ml)
de tales ECO-RBC y, finalmente, 2 o 3 unidades podrían transfundirse en pacientes
de tipo A y O sin enfermedad. efectos y tiempos normales de supervivencia
circulatoria de RBC. Sin embargo, se observó que se necesitaban niveles más altos
de galactosidasa (2 g por bolsa de glóbulos rojos empacada (6 mg/ml para
hematocrito al 80 %)) para las muestras transfundidas a voluntarios O que A para
evitar un pequeño aumento en el título anti-B, aunque la razón por la que no
estaba claro (30 –32).
Un ensayo clínico de Fase 2 más grande realizado en 2000 por un
segundo grupo llegó a conclusiones similares (33). Usando una forma
recombinante de la enzima del grano de café para generar sus ECO-RBC, 21
de pacientes A y 40% de pacientes O, aunque los ECO-RBC no pudieron
ser aglutinados por anti-A y anti-B murinos. Aunque algo
desconcertante, esto parecería no ser clínicamente significativo, dada la
falta de efectos adversos sobre la transfusión. El estudio concluyó que,
en espera del desarrollo de enzimas adecuadas para la conversión de
sangre tipo A, la conversión enzimática podría usarse para crear un
suministro de sangre de donante universal (grupo O). Sin embargo, era
evidente que se necesitaban enzimas de actividad y pH óptimo
mejorados. Se realizaron más investigaciones en un intento de mejorar
la eficiencia de las enzimas. Aquí, un jugador clave fue ZymeQuest
(ahora Velico Medical), que desarrolló una soja cinéticamente superior-
-galactosidasa (34). Esta enzima fue capaz de trabajar a un pH más alto

pacientes recibieron ECO-RBC y no se registraron eventos adversos, aunque
nuevamente se observaron pequeños aumentos en el título B en algunos
pacientes. Los estudios de comparación cruzada, en los que se mezclaron
ECO-RBC con sueros de pacientes del grupo A y del grupo O, dieron como
resultado algún nivel de aglutinación en el 20 % de las muestras de suero.
de 5,8, y la cantidad utilizada por bolsa de RBC empacada se redujo a
0,5 g (9). Sin embargo, esto todavía no era adecuado para un uso serio.
Además, dado el porcentaje relativamente pequeño de la población
norteamericana y europea del tipo de sangre B, estaba claro que

328J. Biol. química(2020) 295(2) 325–334


Figura 3. Descripción general de la conversión enzimática de antígenos A y B en antígenos H como rutas para la producción de O-ECO-RBC.Se presentan las rutas enzimáticas
conocidas para la conversión de antígenos A o B en antígenos H. Las enzimas con actividades de exoescisión convencionales se presentan ennegro, enzimas con actividad de
endoescisión enpúrpura(producir ECO? glóbulos rojos, con antigenicidad desconocida), y la vía de dos pasos enverde. Los azúcares se muestran utilizando la notación Consortium for
Functional Glycomics (12).
tales enfoques de conversión no serían viables hasta que se
identificaran enzimas de escisión A eficientes.
Hacia glicosidasas que escinden A y mejores escindidores de
antígenos B
El éxito en la producción de B ECO-RBC inspiró la búsqueda de
enzimas que puedan convertir el antígeno A en O. Al considerar otras
glucosidasas que podrían ser útiles en la conversión del tipo sanguíneo,
es útil revisar la clasificación más amplia de dichas enzimas. Las
hidrolasas de glucósido se han agrupado en más de 160 familias
relacionadas con secuencias dentro de la base de datos de enzimas
activas de carbohidratos (CAZy) (35). Debido a que la secuencia dicta la
estructura, el mecanismo y, en última instancia, la especificidad del
sustrato, esta base de datos, junto con el sitio hermano CAZYPEDIA, ha
proporcionado un principio organizador extremadamente valioso para
la glicoenzimología. el grano de cafe--galactosidasa pertenece a la
familia CAZy GH27, una agrupación de bacterias y eucariotas-
-galactosidasas y--norte-acetilgalactosaminidasas, incluidas las enzimas
lisosomales humanas, cuya deficiencia conduce a los trastornos de
almacenamiento lisosomal de Fabry y Schindler. El pH óptimo bajo de
las enzimas del grano de café quizás no sea sorprendente. Otra familia
de parientes cercanos--galactosaminidasas y
- - galactosidasas es la de GH36; Las enzimas de estas dos familias
tienen en común un dominio catalítico con un (-/-)8pliegue, junto
con un asociado-dominio de hoja
Los primeros intentos de identificar--norte-acetilgalactosaminidasas
enfocadas en la bacteriaClostridium perfringens, que anteriormente
había sido identificado como un organismo "destructor de A" (36 – 39).
Se identificó la enzima responsable de esta actividad (y luego se
demostró que era un miembro de la familia CAZy GH36), pero aunque
pudo convertir los antígenos A en antígenos H en
COMENTARIOS DE JBC:Hacia el donante universal de sangre
A2fragmentos de membrana de glóbulos rojos, no fue activo en glóbulos
rojos intactos y, por lo tanto, no fue útil. Casi al mismo tiempo, la empresa
ZymeQuest comenzó a utilizar un GH27--norte-acetilgalactosaminidasa de
hígado de pollo para convertir los antígenos A (34). Sin embargo, solo fue
capaz de convertir completamente A2glóbulos rojos; conversión de A1Los
glóbulos rojos, con su contenido de antígeno mucho más alto, estaban
incompletos. Además, su rango de pH óptimo no era realmente compatible
con los glóbulos rojos (3,8 a 5,7), lo que significa que se necesitaban hasta 3
g de enzima por unidad de glóbulos rojos empaquetados (40). Otro--norte
-acetilgalactosaminidasas de diferentes fuentes se encontraron en los
próximos años (41–43), pero lamentablemente, ninguno mostró una
actividad de conversión completa en A1glóbulos rojos (41–43).
Conversión enzimática del tipo de sangre, segunda generación
Una publicación clave que describe el descubrimiento de nuevas enzimas
para la conversión del tipo de sangre fue la de Liuet al.en 2007 (44). La
detección basada en TLC de una biblioteca de unos 2500 lisados fúngicos y
bacterianos utilizando tetrasacáridos marcados con fluorescencia que
representan los antígenos A y B identificaron nuevos grupos de--norte-
acetilgalactosaminidasas y--galactosidasas que funcionan a pH 7. La--norteLa
actividad de la acetilgalactosaminidasa fue similar a la delElizabethkingia
meningosepticum --norte-acetilgalactosaminidasa que había sido
identificada por medios similares previamente (45). Luego, el análisis BLAST
identificó una familia de enzimas que posteriormente se asignaron a GH109
y demostraron hidrolizar sus sustratos con una retención neta de la
configuración anomérica. Los miembros de esta familia usan un cofactor
NAD y escinden el enlace glucosídico a través de un mecanismo inusual que
involucra pasos transitorios de eliminación y adición asistidos por redox,
como se demostró por primera vez para los miembros de GH4.46). Una
estructura tridimensional de la enzima confirmó la localización
J. Biol. química(2020) 295(2) 325–334329
COMENTARIOS DE JBC:Hacia el donante universal de sangre
ción del cofactor NAD cerca de H3 del sustrato y la ausencia de
cualquier requisito de iones metálicos. También proporcionó
información estructural sobre la estricta especificidad de la enzima
para los antígenos A y su amplia especificidad para todos los
subtipos A. También descubrieron una nueva familia de inversores-
-galactosidasas que escinden el antígeno B de manera eficiente a
pH 7 y asignan estas enzimas a GH110. Una subfamilia (GH110B)
que también escinde el antígeno B lineal (sin la fucosa) se informó
al año siguiente (47), pero en la actualidad, no hay estructuras
tridimensionales disponibles para explicar estos hallazgos.
losE. meningosepticumDe hecho, se demostró que la enzima escindía los
antígenos A de los glóbulos rojos, pero solo si se empleaban tampones de
baja fuerza iónica. Este comportamiento se atribuyó a la necesidad de que la
enzima, que es predominantemente catiónica alrededor del sitio activo,
interactúe con la superficie neta de glóbulos rojos cargada negativamente.48
). Bajo tales condiciones, pudieron usar tan solo 300 g ml1de enzima para
convertir completamente los glóbulos rojos A en O, medido con agentes de
tipificación estándar. Esto corresponde a -60 mg de enzima por unidad de
glóbulos rojos. Conversión de glóbulos rojos tipo B por la--galactosidasas fue
considerablemente más eficiente. Utilizando la enzima GH110A deB. fragilis
en el mismo tampón de baja fuerza iónica, se podría convertir una unidad
completa de glóbulos rojos de tipo B usando solo 2 mg de enzima. De hecho,
al combinar las dos enzimas, también pudieron convertir los glóbulos rojos
tipo AB. Las condiciones empleadas fueron estudiadas más a fondo por otros
grupos, que demostraron que un tampón estándar que contiene glucosa de
baja fuerza iónica era igualmente bueno para usar en la conversión de
glóbulos rojos A, B y AB, pero que las enzimas no eran estables al
almacenamiento a baja concentración iónica. fuerza (49, 50). Se podría lograr
un rendimiento de escisión considerablemente mejorado a fuerzas iónicas
más altas mediante la inclusión de agregados moleculares como dextranos
en las mezclas de reacción (51). Estos polímeros aumentan efectivamente la
concentración de enzima al disminuir el volumen de reacción disponible para
ellos, acercándolos así a la superficie de RBC. Dada su larga historia como
expansores de sangre que se usan para mantener el volumen de plasma en
situaciones de emergencia, los dextranos probablemente se pueden usar de
manera segura de esta manera.
Inspirándonos en estos estudios, nuestro laboratorio exploró el
potencial de una clase de endobacterias--gal que escinde todo el
trisacárido A o B de los glóbulos rojos con la esperanza de que una sola
enzima pueda usarse para la conversión de ambos tipos de sangre.
Estas enzimas GH98, descubiertas por el grupo Li (52), se ha
demostrado que escinde la dominante-antígenos de tipo 2 ligados a 1,4
con eficacia, pero con actividades relativamente bajas en el--1,3-
enlaces de otros subtipos. Mediante el uso de pasos iterativos de
evolución dirigida, guiados por estructuras cristalinas disponibles,
pudimos aumentar la actividad de una enzima GH98 deneumonía
estreptocócicaunas 170 veces en la escisión de los enlaces de Tipo 1 sin
una pérdida significativa de la actividad de escisión de Tipo 2 (53).
Crucial para nuestro éxito fue nuestro desarrollo de un ensayo
acoplado eficiente en el que se empleó el glucósido de metilumbeliferil
del pentasacárido tipo A1, sintetizado quimioenzimáticamente. Escisión
de la terminal--El residuo de GalNAc expuso el oligosacárido a la
degradación secuencial por el--fucosidasa, exo---gal, y--hexosaminidasa
que se incluyeron en la mezcla de ensayo, lo que resultó en la liberación
de la metilumbeliferona fluorescente. En general, esto proporcionó una
importante
330J. Biol. química(2020) 295(2) 325–334
demostración del potencial para mejorar las actividades de estas
enzimas (53, 54). Sin embargo, la realidad de que este proceso tendría
que repetirse para crear buenas enzimas para los enlaces de tipo 3 y 4 y
la preocupación de que la presencia de un residuo de GlcNAc terminal
podría conducir a la eliminación de glóbulos rojos nos llevó a
reconsiderar la sabiduría de este enfoque específico. Esto fue
especialmente cierto a la luz de las nuevas oportunidades presentadas
por nuestro desarrollo de pantallas de alto rendimiento adecuadas para
análisis metagenómicos.
Conversión enzimática del tipo de sangre, tercera generación
El advenimiento del análisis metagenómico funcional ha abierto
nuevas oportunidades para el descubrimiento de nuevas enzimas
porque permite interrogar el repertorio genómico de potencialmente
todos los microorganismos dentro de una muestra ambiental, no solo
aquellos que pueden ser cultivados.55). Al extraer todo el ADN de la
muestra y luego expresar fragmentos del mismo dentro de un
organismo huésped comoEscherichia coli, se genera una biblioteca que
se puede analizar para determinar la actividad deseada. Crucial para
este enfoque, que se puede realizar con inserciones de ADN pequeñas
(3–10 kb) o grandes (30–40 kb), es la disponibilidad de una pantalla
adecuada de alto rendimiento.
Entonces, armados, primero consideramos qué entornos podrían
albergar organismos que degradan los antígenos A y B. Después de rechazar
ideas basadas en parásitos, como mosquitos o sanguijuelas, que se
alimentan de sangre humana (porque solo los primates tienen el sistema
ABO), nos decidimos por el microbioma intestinal humano. Las mucinas que
recubren la pared intestinal muestran muchas estructuras de azúcar en sus
extremos, incluidos los antígenos ABH (56). Debido a que se sabe que las
bacterias intestinales se alimentan de estos glucanos de mucina, parecía
probable que algunas de las bacterias en ellos produjeran glucosidasas que
podrían escindir los antígenos A y B. Con base en esto y en un estudio que
muestra una correlación del contenido del microbioma humano con el tipo
de sangre (57), generamos una gran biblioteca metagenómica de inserción
de un donante del tipo de sangre AB. El cribado de estos 20.000 clones
identificó varias enzimas GH109 nuevas, así como una enzima GH36
- - norte-acetilgalactosaminidasa, aunque ninguno de estos exhibió
propiedades superiores a las delemGH109 encontrado anteriormente (44).
Sin embargo, otro clon particularmente activo contenía un par de genes que
codifican dos enzimas que trabajan en conjunto para escindir el antígeno A.
El primero de ellos es una metalo-GalNAc desacetilasa (DeAc) que es
altamente específica para el antígeno A pero funciona en todos los subtipos
de A, generando una galactosamina (GalN) en el extremo en lugar de
GalNAc. El análisis cristalográfico de un complejo análogo del producto
reveló el sitio activo que contiene el metal, así como un conjunto de
interacciones de enlaces de hidrógeno con el resto de fucosa que explican la
especificidad del antígeno A (Figura 4). Su módulo de unión a carbohidratos
C-terminal se une fuertemente a las estructuras LacNAc, de acuerdo con su
acoplamiento a la pared celular de los glóbulos rojos, mientras actúa sobre
el antígeno A. La segunda enzima es una GH36--galactosaminidasa que
escinde eficientemente el monosacárido del terminal, generando el antígeno
H (58) (higos. 3y4). Esta última enzima es mucho menos específica, pero
debido a que es probable que no haya otra GalN presente en la superficie
celular, no es probable que esto sea un problema. De hecho, las pruebas de
esta enzima en glóbulos rojos O y B no revelaron liberación de GalN. Estas
dos enzimas, trabajando juntas, escinden el antígeno A de manera muy
eficiente, lo que requiere entre 15 y 30 veces menos enzima que el mejor
anterior.
 COMENTARIOS DE JBC:Hacia el donante universal de sangre

Figura 4. Vía de desacetilación para la escisión del antígeno A.A, el antígeno A es desacetilado por GalNAc DeAc, seguido de la escisión de la galactosamina por la galactosaminidasa
(GH36), produciendo el antígeno H. Los azúcares se presentan como estructuras químicas (laparte con etiqueta rojade la estructura química es el grupo funcional que es convertido por
la desacetilasa) y símbolos que usan la notación del Consorcio para la Glicómica Funcional (12).B, se presentan los residuos del sitio activo de la GalNAc desacetilasa, involucrados en
interacciones con el grupo galactosilo del extremo no reductor. Las interacciones polares se muestran comolineas grises discontinuas, y las moléculas de agua se muestran como
esferas azules. losnorte-El grupo acetilo de GalNAc en un trisacárido de antígeno A modelado en la estructura del complejo con antígeno B se muestra en unrepresentación de palo
magenta semitransparente. Los residuos His-252 y Asp-100 coordinan el ion metálico divalente (esfera roja). Los residuos de galactosilo se muestran comopalos amarillos, y el residuo
de fucosil se muestra enrojo.

(EmGH109) y hacerlo en tampones estándar sin necesidad de agregados
moleculares, aunque su adición mejora aún más la actividad. De hecho,
funcionan especialmente bien en sangre total, ya sea a temperatura
ambiente o a 4 °C, y se pueden eliminar de los glóbulos rojos mediante un
simple lavado durante los pasos de centrifugación que se emplean en el
procesamiento normal de glóbulos rojos. Es posible que se necesite tan solo
1 mg por unidad de glóbulos rojos para la conversión. Estas propiedades
deberían facilitar el uso de estas enzimas dentro de la estructura actual para
el procesamiento de sangre con una interrupción mínima. Curiosamente, en
la literatura científica médica y forense ya existían buenas pruebas de la
existencia probable de tales GalNAc desacetilasas que funcionan en los
glóbulos rojos de tipo A. Se ha observado que algunos pacientes con sepsis
experimentan un cambio transitorio en su tipo de sangre de A a B hasta que
desaparece la infección. cuando su tipo de sangre A regresó. De hecho,
Kabat había sugerido que este proceso, conocido como el fenómeno B
adquirido (59), podría ser causado por una desacetilasa bacteriana que
genera un resto de galactosamina que fue reconocido como galactosa por
los anticuerpos policlonales en uso en ese momento, aunque no se purificó
ninguna enzima. También se observaron fenómenos similares de tipo de
sangre variable durante los intentos de tipificar partes del cuerpo
recuperadas del río Támesis, nuevamente presumiblemente debido a
bacterias transmitidas por el río.60).
Estado actual y perspectivas futuras de los glóbulos rojos convertidos
enzimáticamente
A pesar del éxito temprano de la conversión de glóbulos rojos de
tipo B a O y su posterior transfusión en pacientes de tipo A y O.33) sin
efectos adversos, la tecnología aún no se ha trasladado a la práctica
clínica. Un retraso ha sido la eficiencia y la eficacia de las enzimas de
escisión A disponibles. Esto fue mitigado en parte por el desarrollo de
las enzimas GH109 de ZymeQuest, aunque todavía se requerían 15 a 60
mg de enzima por unidad de glóbulos rojos. El otro problema,
mencionado anteriormente, es la aglutinación de bajo nivel que se
observa cuando los ECO-RBC se cruzan con suero de tipo A (en el 20 %
de los casos) o tipo O (en el 40 % de los casos) de otros pacientes. No se
ha determinado la causa de esto, pero podría deberse a niveles bajos
de antígeno B residual causados por una escisión incompleta. También
se han observado problemas similares después de la escisión del
antígeno A (9) y, curiosamente, la aglutinación fue más frecuente
cuando se utilizó suero extraído de pacientes con infecciones previas (
61). Una vez más, la causa de esta aglutinación cruzada, que no parece
provocar hemólisis, no está clara. Sin embargo, es importante señalar
que la presencia de pequeñas cantidades de antígeno A residual no
parece ser un problema para la transfusión, ya que se sabe que algunas
personas de tipo B también expresan un nivel bajo de antígeno A.

J. Biol. química(2020) 295(2) 325–334331

COMENTARIOS DE JBC:Hacia el donante universal de sangre
debido a que su B-galactosiltransferasa tiene poca especificidad. La sangre
de tales individuos se ha utilizado para transfusiones a otros pacientes B
durante años sin ningún problema. Como consecuencia, los fabricantes de
reactivos de tipificación sanguínea ahora ajustan las concentraciones de
anticuerpos para evitar detectar este fenómeno y rechazar innecesariamente
la sangre (33). Es importante destacar que la densidad residual del sitio del
antígeno A de los A-ECO-RBC que fueron convertidos por las enzimas GH109
es menor que la presente en estos RBC de tipo B y, de hecho, los bajos
niveles de antígeno A en estos RBC de tipo B pueden ser eliminado por
tratamiento con enzimas GH109 (10). En consecuencia, es probable que los
glóbulos rojos tipo ECO A sean realmente seguros para la transfusión.
Otra explicación sugerida gira en torno a la forma en que los
antígenos A de la cadena tipo 3 son escindidos por una exo-GalNAcasa
porque solo se escindiría la GalNAc terminal, no las internas (Figura 2).
Esto genera un antígeno H que cubre un antígeno A interno. Si el
residuo interno de GalNAc es reconocido por anti-A u otros anticuerpos,
esto podría resultar en la aglutinación observada (11,44,61–63). Otra
posibilidad es que la eliminación de los antígenos A o B de la superficie
pueda dar lugar a una reorganización de otros antígenos agrupados en
las inmediaciones, exponiendo antígenos que antes estaban ocultos.
Aunque no hay evidencia directa de esto, se demostró que los cambios
en el agrupamiento de glicanos alrededor de los antígenos ABH
después de su eliminación enzimática afectan de manera diferencial el
reconocimiento de los ácidos siálicos de la superficie celular por parte
de los receptores afines, muy probablemente a través del
agrupamiento alterado.sesenta y cinco). Los únicos ensayos clínicos
informados sobre A-ECO-RBC son ensayos de fase 1 realizados por
ZymeQuest en 2005, en los que se reinfundieron pequeños volúmenes
de A-ECO-RBC en el donante original sin efectos nocivos (NCT00261274)
(10). Claramente, se necesitan más ensayos.
A medida que avanzamos, una preocupación principal es claramente
comprender la base de estas aglutinaciones durante las pruebas cruzadas y
evaluar si tienen importancia clínica. Lo más probable es que esto requiera la
identificación de los anticuerpos que causan dicha aglutinación y su
especificidad, al mismo tiempo que se investigan las posibles causas
sugeridas anteriormente. Cierta claridad sobre estos temas mejoraría en
gran medida las perspectivas de pasar a más ensayos clínicos, dada la alta
actividad de las enzimas más nuevas y, en consecuencia, las bajas cargas de
enzimas necesarias. Las perspectivas de eliminación del antígeno Rh son
más limitadas, dado que está asociado a una proteína transmembrana. Sin
embargo, el enfoque mucho más invasivo de enmascaramiento de antígenos
que utiliza polímeros de superficie celular es un método que se ha propuesto
(66).
Mientras tanto, otra posible aplicación de estas enzimas es en el área
de trasplante de órganos. Los antígenos ABO son de gran importancia
entre los antígenos que necesitan ser emparejados para identificar
órganos adecuados para el trasplante a un paciente individual. Quitar el
antígeno A/B enzimáticamente puede parecer poco práctico al principio
porque el órgano regenerará el antígeno escindido. Sin embargo, el
mayor desafío con los trasplantes incompatibles es durante los
primeros días después del trasplante. Si la respuesta inmunitaria
durante este tiempo puede reducirse sustancialmente, se espera que
mejoren las tasas de éxito. De hecho, cuando los tiempos de espera se
han vuelto peligrosamente largos, en algunos centros ya se realizan
trasplantes de riñón a través de la barrera ABO. Por lo general, la
plasmaféresis se realiza en el receptor para eliminar los anticuerpos,
junto con la inmunosupresión.
332J. Biol. química(2020) 295(2) 325–334
y posiblemente esplenectomía (67, 68). La eliminación de los antígenos A/B
del órgano del donante antes del trasplante reduciría en gran medida la
necesidad de inmunosupresión y posiblemente de plasmaforesis. Varios
artículos relacionan el uso de glucosidasas para eliminar antígenos de la
superficie tisular de órganos completos durante la perfusión.1, 64, 67), pero
los estudios no han progresado más allá de ese punto. El advenimiento de
enzimas mejoradas y procedimientos de perfusión mejorados dan nueva
vida a este campo.
Agradecimientos—Agradecemos a nuestros colegas en el Centro de
Investigación de la Sangre de la Universidad de Columbia Británica por
muchas discusiones y colaboraciones útiles y al Dr. Lyann Sim por su ayuda
con las cifras.
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