BIOTECNOLOGÍA: TÉCNICAS CELULARES

1. Biotecnología: uso de cultivos celulares y tisulares (pp. 4-29).

2. La Biotecnología en valoraciones de problemas ambientales

(Biotecnología en ecotoxicología) (pp. 30-31).
3. Biotecnología ecotoxicológica con sistemas biológicos
animales: Las biovaloraciones (pp. 33-78).

4. Biotecnología celular eucariótica vegetal (pp. 80-107).

5. Biotecnología ecotoxicológica con sistemas biológicos

vegetales (pp. 109-129).
6. Biotecnología de las transfecciones y la diferenciación
celular dirigida (pp. 131-150):
6.1. Aplicaciones biotecnológicas en sistemas biológicos
animales (pp. 152-168).
Rafael
6.2. Aplicaciones biotecnológicas en sistemas biológicos Torronteras
vegetales (pp. 170-178). Santiago

1
 5. BIOTECNOLOGÍA ECOTOXICOLÓGICA

CON

SISTEMAS BIOLÓGICOS VEGETALES.

2
 Biotecnología Eucariótica Vegetal
aplicada a
Estudios Medioambientales

1º. El caso de Spartina densiflora.

2º. El caso de Erica andevalensis.

3
 Biotecnología Vegetal Aplicada a
Estudios Medioambientales
1º. El caso de Spartina densiflora.

S. densiflora en las marismas del Odiel Cultivos hidropónicos de

S. densiflora en el laboratorio
4
Concentración de metales pesados (p.p.m.) en suelo y
tejidos de S. densiflora. Las muestras fueron tomadas en
especimenes silvestres el día de la recolección. Se
muestra la media de, al menos, 3 replicados.
Nótese la cantidad de
metales pesados y restos
de hidrocarburos en el
sustratos.

Grupo Control (CTR)

56 días

In situ
28 días 28 días

Grupo Experimental (EXP)

5
Bio-acumulación de metales en Spartina densiflora
Fig 1. Iron localization in roots Fig 2. Iron localization in S. densiflora leaves

P V
C M C
C
C
B S
V t
C
E M
V x C M
C C
P
C

E PC: Parenchymatous cells; VC: Vascular cylinder; CB:

x
Caspary band; Ex: Exodermis; MC: Mesophyll cells and
St: Stomata

Fig 1. Iron is mainly stored in the parenchymatous cells, concretely on their cell walls.
On the other hand, we didn’t find significant accumulation of iron in the vascular
cylinder, including xylem and phloem.
Fig 2. In leaves, accumulation occurs predominantly in cell walls of mesophyll and
parenchymatous cells; no signals of iron accumulation were founded in vascular cells.
6
 ELONGACIÓN FOLIAR ACTIVIDAD GUAIACOL PEROXIDASA

PDO. DE TRATAMIENTO

PDO. DE ACLIMATACIÓN (PA)

ACTIVIDAD CATALASA ACTIVIDAD ASCORBATO PEROXIDASA

PDO. DE TRATAMIENTO PDO. DE TRATAMIENTO

PDO. DE ACLIMATACIÓN (PA) PDO. DE ACLIMATACIÓN (PA)

7
 Concentración de Ascorbato en Spartina
tras su cultivo en medios descontaminados
Concentración de Asc (µM/mg PF)

Nótese la cantidad
de metales pesados
y restos de
hidrocarburos en el
sustratos.

Periodo de Adaptación
Actividad de Peroxidasas en Spartina tras
Actividades Antioxidativas en Spartina durante su cultivo en medios descontaminados

8
Periodo de Adaptación
 CONCLUSIONES

Los sistemas de defensa antioxidante

de Spartina densiflora responden
rápidamente ante variaciones de metales
pesados en el sustrato, indicando que S.
densiflora sufre estrés oxidativo en su
hábitat natural.

Las alteraciones del sistema antioxidante en

respuesta a las variaciones ambientales no
modifican la tasa de crecimiento de S.
densiflora.
9
 CONCLUSIONES

Los sistemas de defensa antioxidante de

Spartina densiflora responden rápidamente
ante variaciones de metales pesados en el
sustrato, indicando que S. densiflora sufre
estrés oxidativo en su hábitat natural.

Las alteraciones del sistema

antioxidante en respuesta a las
variaciones ambientales no modifican la
tasa de crecimiento de S. densiflora.

10
 CONCLUSIONES
Los mecanismos de defensa antioxidante
permite a S. densiflora controlar el daño
oxidativo, posibilitando que su tasa de
crecimiento sea similar a la de los individuos
que crecen en ausencia de agentes
estresantes. Esto permite que:
• Los sistemas antioxidantes permiten a Spartina
densiflora acumular metales pesados.
• Spartina densiflora se presenta como
mecanismo de biorremediación de suelos
altamente contaminados por metales pesados.
11
 CONCLUSIONES
Los mecanismos de defensa antioxidante permite
a S. densiflora controlar el daño oxidativo,
posibilitando que su tasa de crecimiento sea
similar a la de los individuos que crecen en
ausencia de agentes estresantes. Esto permite que:
• Spartina densiflora pueda vivir y desarrollarse
en presencia de metales pesados y acumularlos.
• Spartina densiflora se presente como
mecanismo de biorremediación de suelos
altamente contaminados por metales pesados.
12
 Biotecnología Vegetal Aplicada a
Estudios Medioambientales
2º. El caso de Erica andevalensis

Erica en escombreras de Nerva Cultivos in vitro de Erica

13
 Provincia de
Huelva con
las cuencas
de los ríos
Odiel y Tinto.
Detalle de las flores
de E. andevalensis

E. Andevalensis bordeando el río Tinto en Peña del

14 Hierro, donde ya presenta aguas de color rojo.
 Fig. 3: Zarzas
creciendo en un
bancal, junto con
E. andevalensis.
Fig. 1: Erica andevalensis en las cercanías
del curso de agua del río Tinto en las
proximidades de su nacimiento.

Fig. 2: Río Tinto a su paso

por la zona minera de
Nerva, donde E. andevalensis
crece sobre escombros de
minería y en las cercanías
del río, cargado de metales y
acidez extrema.

15
Concentración de ROOH (nmol/mg. prot.) en Concentración de MDA (nmol/mg. prot.) en las
las poblaciones de Ericas estudiadas (n=7). poblaciones estudiadas (n=7).

Actividad APX en las poblaciones estudiadas (n=7)

16
RESULTADOS

Bio-acumulación de Cd en hojas de Erica

Cd added to soil Cd in soil solution Cd in plant leaves

(ppm) (ppm) (ppm)
Control 0 0 0
T1 0.05 0.0012±0.0008 0.064±0.019
T2 0.5 0.0119±0.0046 0.101±0.031
T3 5 0.3553±0.1175 0.323±0.087
T4 50 2.9325±0.1579 0.495±0.113

Tras 5 días de exposición a Cadmio, éste es absorbido por las

raíces y transportado a las hojas
Bio-acumulación de Cd en hojas de Erica. Secuentro
del Cd en parenquima clorofílico
RESULTADOS Bio-acumulación de Cd en hojas de Erica
Cd added to soil Cd in soil solution Cd in plant leaves
Tras 5 días (ppm) (ppm) (ppm)
de exposición Control 0 0 0
a Cadmio,
este es T1 0.05 0.0012±0.0008 0.064±0.019
absorbido por T2 0.5 0.0119±0.0046 0.101±0.031
las raíces y
transportado T3 5 0.3553±0.1175 0.323±0.087
a las hojas T4 50 2.9325±0.1579 0.495±0.113

Medición de Daños Celulares por Cadmio en Erica

Niveles Clorofílicos Peroxidación Lípidica

 Ciclo del Ascorbato RESULTADOS

Actividad de Glutatión y
Tioles no proteícos

Los niveles de Ácido ascórbico (AsA) muestran

incrementos significativos en presencia de
Cadmio, tanto para las formas reducidas como
oxidadas (134-178% más altas para formas
reducida y 288-431% más para formas
oxidadas).

Los niveles de Glutatión fueron muy afectados. Con una

disminución del 20-40% del Glutatión redudido en los
tratamientos frente a los controles. Los tioles fueron
disminuidos significativamente en T1

1. Se ha confirmado que la
Rivera Tallisca, sin síntomas de
contaminación metálica y sin E.
andevalensis.
CONCLUSIONES
distribución de E. andevalensis
está asociada a terrenos ácidos
con alta concentración de
metales; otras Ericáceas son
incapaces de crecer en dichos
hábitat, aunque en algún caso (E.
australis) forman comunidades
con E. andevalensis.

2. Las poblaciones de Erica

andevalensis muestran un mayor
grado de estrés oxidativo que las
poblaciones de E. australis y E.
arbórea.
21
 CONCLUSIONES
1. Se sugiere que la población de
Erica andevalensis más afectada
por el estrés oxidativo, tolera el
medio ácido y contaminado por
metales en el que se desarrolla
Rivera Tallisca, sin síntomas de
contaminación metálica y sin E. mediante la síntesis o activación
andevalensis.
de enzimas con actividad
peroxidasa.

2. Las condiciones fisiológicas de

Erica andevalensis la hacen un
bioindicador óptimo para
localización de hábitat
fuertemente acidificados y la
capacitan como una especie apta
22 para la biorrestauración.
 BIOTECNOLOGÍA: TÉCNICAS CELULARES

1. Biotecnología: uso de cultivos celulares y tisulares (pp. 4-29).

2. La Biotecnología en valoraciones de problemas ambientales

(Biotecnología en ecotoxicología) (pp. 30-31).
3. Biotecnología ecotoxicológica con sistemas biológicos
animales: Las biovaloraciones (pp. 33-78).

4. Biotecnología celular eucariótica vegetal (pp. 80-107).

5. Biotecnología ecotoxicológica con sistemas biológicos

vegetales (pp. 109-129).
6. Biotecnología de las transfecciones y la diferenciación
celular dirigida (pp. 131-150):
6.1. Aplicaciones biotecnológicas en sistemas biológicos
animales (pp. 152-168).
Rafael
6.2. Aplicaciones biotecnológicas en sistemas biológicos Torronteras
vegetales (pp. 170-178). Santiago

23
 6. BIOTECNOLOGÍA DE LAS
TRANSFECCIONES Y DE LA
DIFERENCIACIÓN CELULAR
DIRIGIDA

24
 DIFERENCIACIÓN

1. Señales internas: Control génico de la propia célula

Sustancias secretadas por otras células.

2. Señales externas: Contacto físico con las células vecinas.
Moléculas del microambiente.

DIFERENCIACIÓN DIRIGIDA

1. Inserción de genes específicos

2. Modificación de las condiciones de cultivo

25
 DIFERENCIACIÓN

1. Señales internas: Control génico de la propia célula

DIFERENCIACIÓN DIRIGIDA

1. Inserción de genes específicos

Biotecnología del ADN recombinante

26
 Biotecnología del ADN recombinante

• El uso de la biotecnología y bioingeniería moderna implica,

inicialmente, el conocimiento y aislamiento de secuencias de ADN
que corresponden a genes responsables de conferir una
característica deseada (fenotipo determinado).

• El aislamiento de los genes de interés es realizado por medio de

técnicas de clonado molecular, y el uso de las transfecciones.

27
 Tecnología de Clonado molecular
• Inducción de la amplificación de una secuencia de ADN en un
organismo vivo.
• Vectores de clonado (plásmidos o virus): vectores en los que la
secuencia de ADN es introducida usando una DNA ligasa.
Cuando es necesario que el fragmento de ADN de interés sea
liberado del vector se hace por medio de enzimas de restricción.
• Una vez aislados, los genes de interés son incorporados al
organismo blanco, a través de cultivos celulares y resultando un
organismo genéticamente modificado (OGM) y esta
característica adquirida puede pasar a ser hereditaria.
• Es posible transferir genes de animales, bacterias o virus.
• Se amplían los recursos para el mejoramiento genético.
• Los genes de un organismo que son insertados en otro se
denominan transgenes y tienen la capacidad de conferirle a este
último una determinada característica.

28
 TRANSFECCIONES
OBJETIVOS
•Expresión de proteínas para su purificación
•Expresión de proteínas para estudiar su efecto sobre el
fenotipo celular
•Estudio de promotores y elementos reguladores
•Estudio de mecanismos involucrados en el procesamiento
del RNA, postraduccionales, etc.
•Interacción de proteínas
•Clonación
•Terapia génica

29
 Problemas que pueden surgir al expresar
proteínas en sistemas procariontes
- Inestabilidad
– Sin actividad biológica
– Contaminantes procariontes
– Características bioquímicas diferentes

Modificaciones postraduccionales incompletas o ausentes

- Maduración proteolítica
- Glicosilación
- Alteraciones de los aminoácidos
•fosforilación
•acetilación
•Sulfatación
•Adición de ácidos grasos
30
 Métodos de Transfección
Depende del tipo celular: HeLa, HEK 293T, COS7, etc.

Liposomas: alta eficiencia, no-tóxico

e.g. Lipofectamine Plus (Invitrogen), Tfx20 (Promega)

Fosfato de calcio: simple, baja eficiencia

DEAE-dextrano: simple, alta eficiencia, no para estable

Electroporación: alta eficiencia, altos niveles de muerte

Microinyección: laborioso, alta eficiencia

Biobalística: para células vegetales

Retrovirus: muy eficiente, trabajoso

31
 Método de Transfección por Liposomas

Moléculas lipídica catiónicas

(N,N,N´,N´-tetramethyl-
N,N´-bis(2-hydoxyethyl)-2,3-
di(oleoyloxy)-1,4-butane-
diammonium iodide)
Y de un lípido neutro L-
dioleoyl
phosphatidylethanolamine
(DOPE).

32
 Protocolo de transfección de
células con liposomas
Método
de
Transfección
por
Liposomas

33
 Métodos de Transfección por Fosfato
cálcico y por DEAE-Dextrano
MÉTODO DEL FOSFATO CÁLCICO
Basado en la obtención de un precipitado
entre el cloruro de calcio y el DNA en una
solución salina de fosfatos. En esta
situación coprecipitan formando unos
agregados que son endocitados/fagocitados
por las células. Aparentemente el agregado
con calcio protege al DNA de la degradación
por las nucleasas celulares.
34
MÉTODO DEL DEAE DEXTRANO
Basado en la obtención de complejos entre
la resina DEAE y el DNA. Los polímeros de
DEAE dextrano o polybreno tienen una carga
que les permite unirse a las moléculas de
DNA cargadas muy negativamente. El DNA
acomplejado se introduce en las células
mediante choque osmótico mediante DMSO
o glicerol
 Método de Transfección por Electroporación
Introducción de macromoléculas en el interior de las células a las que se ha
sometido a una despolarización eléctrica de la membrana de corta duración y
elevada intensidad.

Ventajas:
- técnica simple, reproducible y de gran eficacia.

Desventajas:
- células en suspensión, gran mortalidad celular.
- necesidad de ajustes para cada modelo celular.

35
 Método de Transfección por Biobalística
Introducción de DNA unido a pequeñas bolas de tungsteno u oro aceleradas en una
corriente de helio en un medio carente de aire.
Recomendado para la modificación de células resistentes a otros métodos, y
especialmente para células vegetales.

36
PDS-1000/He system (BioRad, www.biorad.com)
 Método de transfección por Microinyección

37
 Esquema de Métodos de transfección

38
 Proteínas producidas en cultivos de
células eucariontes por transfecciones
Proteína Condición
• Factor VIII & IX c hemofílicos
• CD4 receptor SIDA
• eritropoyetina cáncer
• Interferones b & g cáncer
• Interleuquina-2 cáncer
• GH (Hormona del Crecimiento) enanismo
• Activador plasminógeno Ataques
tisular cardíacos
• Antígeno superficie vacuna
Hepatitis B
39
• Anticuerpos monoclonales varios
 ¿Cómo estar seguro
del resultado positivo
de una transfección? ? ¿Genes reporteros?

40
¿Cómo conocer el resultado de una transfección?
Estrategia de genes reporteros

Los genes reporteros son secuencias que codifican

para proteínas de simple detección. Se usan para
reemplazar productos génicos difíciles de medir y
determinar actividad promotora.

5’ 3’

PROMOTOR exón 1 intrón exón 2

PROMOTOR
GEN REPORTERO
41
v.g. GFP (fluorescencia)
Genes reporteros
CAT (cloramfenicol acetiltransferasa)
Transfiere grupos acetilos marcados 14C o 3H al cloramfenicol.
La detección se da por cromatografía en capa delgada o extracción
orgánica
GAL (β-galactosidasa)
Hidroliza sustrato incoloro (ONPG, OrtoNitroPhenil-Galactopiranósido)
para dar producto amarillo que se cuantifica.
SEAP (secreted human placental alkaline phosphatase)
Ensayo de fosfatasa alcalina bioluminiscente. Muy sensible
LUC (luciferasa)
Oxida a la luciferina emitiendo fotones. Los fotones se cuentan en un
luminómetro o una cámara de recuento de fotones (ensayo in vivo). Hay
diferentes luciferasas disponibles
GFP (green fluorescent protein)
Fluoresce por irradiación con UV – se observa con microscopio de
fluorescencia.
42
 Expresión de proteínas fluorescentes

Proteína fluorescente verde

43
 DIFERENCIACIÓN

1. Señales internas: Control génico de la propia célula

Sustancias secretadas por otras células

2. Señales externas Contacto físico con las células vecinas
Moléculas del microambiente

DIFERENCIACIÓN DIRIGIDA

1. Inserción de genes específicos

2. Modificación de las condiciones de cultivo

44
 BIOTECNOLOGÍA: TÉCNICAS CELULARES

1. Biotecnología: uso de cultivos celulares y tisulares (pp. 4-29).

2. La Biotecnología en valoraciones de problemas ambientales

(Biotecnología en ecotoxicología) (pp. 30-31).
3. Biotecnología ecotoxicológica con sistemas biológicos
animales: Las biovaloraciones (pp. 33-78).

4. Biotecnología celular eucariótica vegetal (pp. 80-107).

5. Biotecnología ecotoxicológica con sistemas biológicos

vegetales (pp. 109-129).
6. Biotecnología de las transfecciones y la diferenciación
celular dirigida (pp. 131-150):
6.1. Aplicaciones biotecnológicas en sistemas biológicos
animales (pp. 152-168).
Rafael
6.2. Aplicaciones biotecnológicas en sistemas biológicos Torronteras
vegetales (pp. 170-178). Santiago

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