___________________________________________________________Revista Científica, FCV-LUZ / Vol.
XI, Nº 6, 485-490, 2001
EVALUACIÓN DEL EFECTO DEL COBRE SOBRE JUVENILES DEL
MEJILLÓN VERDE Perna viridis MEDIANTE LA CONCENTRACIÓN
DE ADN Y LA RELACIÓN ARN/ADN EN EL MÚSCULO ABDUCTOR
Evaluation of Copper Effect on Juveniles of the Green Mussel Perna viridis by DNA
Concentration and a RNA/DNA Ratio of Abductor Muscle
Vanessa Acosta y César Lodeiros
Instituto Oceanográfico de Venezuela, Universidad de Oriente. Cumaná 6101, Venezuela.
RESUMEN
Juveniles de Perna viridis fueron expuestos a diferentes con-
centraciones de cobre (0,00; 0,05; 0,10; 0,20; 0,80; 1,20 y 3,40
-1
mgCu L ), durante un período de 96 h. Los efectos letales se
determinaron cuantificando la supervivencia y los subletales
estimando la concentración de ADN, así como el índice
-1
ARN/ADN. Las concentraciones de 0,8; 1,2 y 3,4 mgCu L
provocaron niveles de mortalidad del 20, 80 y 100%, respecti-
-1
vamente. Se estimó una DL50 de 0,61 mgCu L con límites in-
ferior y superior de confiabilidad al 95% de 0,39 y 0,91 mgCu
-1
L , respectivamente. Los niveles de ADN en el músculo ab-
ductor de los organismos expuestos a las diferentes concen-
traci ones de cobre y al inicio del experimento no presentaron
diferencias significativas. Al final del experimento, se deter-
minó un aumento progresivo del índice de ARN/ADN de los
juveniles expuestos al metal hasta la concentración de 0,1
-1
mgCu L , probablemente como una respuesta metabólica re-
lativa a la exposición del cobre, la cual activó la síntesis de
proteínas. Por otra parte, se observó una disminución signifi-
cativa del índice de ARN/ADN en los individuos sometidos a
-1
las concentraciones de 0,2 y 0,8 mgCu L , posiblemente pro-
ducto de una respuesta a las altas concentraciones de cobre,
conjuntamente con el estado de inanición establecido en el
bioensayo. Los resultados sugieren que los niveles de
ARN/ADN del tejido muscular, reflejaron un comportamiento
relativo a una respuesta antitóxica.
Palabras clave: Bivalvos, Perna viridis, Venezuela, contami-
nación, condición fisiológica.
Recibido: 14 / 06 / 2001. Aceptado: 05 /10 / 2001.
ABSTRACT
In this study, juveniles individuals of the mussel Perna viridis
were exposed to different concentrations of copper (0.00, 0.05,
-1
0.10, 0.20, 0.80, 1.20 y 3.40 mgCu L ), during a period of
96 h. The lethal effect was determined by measuring the sur-
vival rate and the sublethal effect by estimating the concentra-
-1
tions of DNA and RNA/DNA ratio. The 0.8, 1.2 y 3.4 mgCu L
concentrations caused mortality rates of 20, 80 y 100%, re-
-1
spectively. The DL50 was 0.61 mgCu L the upper and lower
-1
limits of confidence at 95% were 0.39 and 0.91 mgCu L re-
spectively. At the beginning of the experiment, the DNA levels
in adductor muscle, and after their exposition to the different
copper concentrations, did not indicated a significant variation.
At the end of the experiment, the RNA/DNA ratio increased in
-1
the juveniles exposed to a concentration of up to 0.1 mgCu L ,
probably as a metabolic response due to the exposition to cop-
per which may have activated protein synthesis. In the mussels
-1 -1
exposed to 0.20 mgCu L and 0.80 mgCu L , the RNA/DNA
ratio decreased significantly, possibly because these higher
levels of copper concentration caused them an advanced state
of stress. Results suggest that RNA/DNA ratios of muscle tis-
sue showa behavior relative to antitoxic response.
Key words: Bivalves, Perna viridis, Venezuela, contamination,
physiological condition.
INTRODUCCIÓN
En los últimos años ha aumentado el interés por estudiar
el efecto de la contaminación en el medio marino. Una serie de
invertebrados y vertebrados han sido objeto de investigaciones
relacionadas con el impacto ambiental producido por la pre-
sencia de metales pesados en los sistemas acuáticos, princi-
485
Efecto del cobre en Perna viridis / Acosta, V. y Lodeiros, C.________________________________________________________________
palmente en zonas templadas [3, 4, 23, 24]. Sin embargo, en
regiones tropicales pocos estudios se han realizado al respec-
to y cada día se hace más imprescindible el empleo de espe-
cies acuáticas que permitan cuantificar el impacto ambiental
producido por contaminantes en los ecosistemas marinos.
Los metales pesados, por su carácter no biodegradables
provocan un efecto negativo sobre los organismos. Se ha de-
mostrado que estos elementos producen complejos con sus-
tancias orgánicas que conducen a un desequilibrio metabólico
que origina una reducción de la energía destinada para el cre-
cimiento corporal [ 24]. Debido a ello, el estudio de los niveles
de toxicidad, comportamiento y acumulación de los metales
pesados en los tejidos de los bivalvos, particularmente en me-
jillones, ha ocupado un lugar preferencial en los estudios eco-
toxicológicos. Estos organismos son capaces de bioacumular
los metales biodisponibles en el medio ambiente, un buen
ejemplo lo constituyen Mytilus edulis y Mytilus galloprovincialis,
los cuales han sido clásicamente utilizados en diversos estu-
dios de contaminación en zonas templadas [2, 14, 19, 25].
Entre los metales pesados se encuentra el cobre, un mi-
cronutriente esencial que forma parte, principalmente, de los
pigmentos respiratorios así como de muchas moléculas, parti-
cularmente metaloenzimas, como la ureasa, citocromo oxida-
sa, tiroxidasa y butil CoA deshidrogenasa [ 4, 27, 38]. No obs-
tante, en elevadas concentraciones el cobre es considerado
tóxico, ya que afecta las funciones básicas del organismo, lle-
gando a provocar un desequilibrio metabólico que puede cau-
sar hasta la muerte [37]. En ambientes estuarinos y marinos
está presente en cantidades suficientes, razón por la cual no
se han reportado deficiencias en los organismos acuáticos,
este metal proviene de usos agrícolas, domésticos e industria-
les, entre otros. Las descargas antropogénicas a los estuarios
y áreas costeras es considerada la principal fuente de conta-
minación, por lo que tiene prioridad en los estudios de toxici-
dad [ 33].
Evaluar la respuesta fisiológica de un organismo acuáti-
co ante la presencia de metales pesados provee una informa-
ción importante, ya que permite estimar el posible impacto am-
biental que estos elementos pueden producir en los ecosiste-
mas acuáticos.
Los cambios metabólicos que se producen dentro del or-
ganismo durante situaciones estresantes, han sido examina-
dos mediante el contenido de ADN, ARN y la relación
ARN/ADN, mostrando ser éste último un índice adecuado para
establecer la condición fisiológica de los organismos en un
momento dado [6, 7, 23, 26, 34]. En bivalvos marinos la rela-
ción ARN/ADN, ha sido utilizada para determinar el estado fi-
siológico del organismo [10, 12, 16, 20, 21, 39].
Perna viridis es una especie de bivalvo conocido como
el mejillón verde, es originario del océano Indo-Pacífico que ha
invadido gran parte de las costas del nororiente venezolano
[1,17], debido probablemente a la resistencia que presenta a
las variaciones ambientales [32], llegando a desplazar en algu-
486
nas áreas al mejillón marrón Perna perna [31]. Esta especie
presenta un gran potencial como organismo cultivable [11, 13,
35] y también ha sido ampliamente utilizado como organismo
bioindicador de contaminación en zonas tropicales del Océano
Pacífico [1, 9, 15, 18], lo cual conlleva a considerarlo como un
organismo modelo para ser utilizado en estudios ecotoxicológi-
cos, con un carácter comparativo geográficamente extenso.
En el presente estudio se realizó una evaluación prelimi-
nar para estimar el efecto tóxico del cobre sobre juveniles del
mejillón verde P. viridis durante un período de exposición de
96 h, evaluando la respuesta del organismo mediante la super-
vivencia, contenido de ADN y niveles de ARN/ADN, como índi-
ce de condición fisiológica.
MATERIALES Y MÉTODOS
Los ejemplares de P. viridis fueron recolectados utilizan-
do un equipo básico de buceo, en un banco natural ubicado en
el morro de Chacopata, estado Sucre-Venezuela, la cual es
una zona caracterizada por no presentar ningún aporte antro-
pogénico. Los mejillones fueron trasladados en contenedores
isotérmicos con agua de mar suficientemente aireada hasta la
Estación Hidrobiológica de Turpialito, donde se mantuvieron
en un tanque con agua de mar circulante, sin suministro de ali-
mento, durante un período de aclimatación de 4 d.
Para evaluar el efecto del cobre, se escogieron indivi-
duos de menor talla (13 ± 3 mm), con la finalidad de evitar una
variabilidad en la respuesta entre el índice de ARN/ADN y la
talla del bivalvo [16] . Antes de realizar el bioensayo se toma-
ron al azar 12 ejemplares, en función de mostrar la condición
fisiológica en la cual se encontraban los mejillones en su habi-
tat natural (grupo inicial). Durante el bioensayo, se utilizaron
contenedores de vidrio de 4 litros de capacidad, los cuales fue-
ron llenados hasta 3 litros con agua de mar filtrada y esteriliza-
da con luz ultravioleta. En cada contenedor se colocaron 5
ejemplares de P. viridis, sometiéndolos por triplicado a diferen-
tes concentraciones de cobre (0,05; 0,10; 0,20; 0,80; 1,20 y
3,40 mgCu L-1 ) preparadas a partir de una solución patrón de
sulfato de cobre pentahidratado (CuSO 4.5H2O), durante un pe-
ríodo de exposición de 96 h. De igual manera se estableció un
tratamiento o grupo control sin exposición al cobre. Los orga-
nismos se mantuvieron bajo condiciones controladas a una
temperatura de 22±1°C, salinidad de 36±, pH de 7,9±2 y una
saturación de oxígeno > 90%.
Continuamente se realizó un monitoreo con la finalidad
de observar la existencia de organismos muertos, en dicho
caso eran extraídos inmediatamente. El criterio de mortalidad
fue establecido como la falta de respuesta al estímulo mecáni-
co, producido por la apertura y cierre de las valvas, por contac-
to con una varilla plástica. Una vez transcurridas las 96 h, se
cuantificaron los organismos sobrevivientes, los cuales fueron
identificados y posteriormente congelados.
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El contenido de ADN e índice de ARN/ADN, fueron me-

didos en 30 mg de masa húmeda del músculo abductor y se 100
determinó mediante la técnica de fluorescencia [ 8].
80

Sobrevivencia (%)
En función de evaluar la dosis letal al 50% (DL 50), se
aplicó el método “Logit” utilizando un programa suministrado
por los protocolos estándares para bioensayos de toxicidad 60
[30].
Para determinar si existieron diferencias significativas 40
entre las concentraciones ensayadas en las variables de su-
pervivencia, determinaron contenido de ADN y relación
ARN/ADN, se aplicó el análisis noparamétrico de Kruskal-Wa-
20
llis. En los casos donde se determinaron diferencias significati-
vas (P<0,05), se aplicó la prueba no paramétrica de compara- 0
ciones múltiples según las recomendaciones de Zar [41]. Control 0,05 0,1 0,2 0,8 1,2 3,4
Concentración de cobre (mg L-1)
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
FIGURA 1. PORCENTAJE DE SUPERVIVENCIA EN JUVENI-
LES DE PERNA VIRIDIS SOMETIDOS A DIFERENTES CON-
Los juveniles de P. viridis expuestos a las concentracio- CENTRACIONES DE COBRE. LA DEGRADACIÓN DEL NE-
nes de 0 (control), 0,05; 0,1 y 0,2 mgCu L-1 sobrevivieron du- GRO SE PRESENTA EN RELACIÓN A LA CONCENTRA-
rante las 96 h del bioensayo; en contraste con los juveniles ex- CIÓN DEL COBRE. LAS LÍNEAS VERTICALES INDICAN EL
puestos a 0,8 y 1,2 mgCu L -1, en donde se obtuvo un 40 y ERROR ESTÁNDAR DE LA MEDIA EN CADA TRATAMIEN-
20% de sobrevivencia FIG. 1. En la concentración de 3,4 TO. LAS LÍNEAS HORIZONTALES INDICAN LA FORMA-
mgCu L-1 , se presentó una mortalidad total de los juveniles, la CIÓN DE GRUPOS SIGNIFICATIVAMENTE IGUALES
cual aconteció antes de las 48 h. El análisis de los datos por el (P>0,05).
método “logit” mostraron una dosis letal al 50% de mortalidad
(DL 50) de 0,61 mgCu L-1 con límites inferior y superior de con- 3,0
fiabilidad al 95% de 0,39 y 0,91 mgCu L -1, respectivamente.
2,5
ADN (µg mg –1)

Los niveles de ADN en el músculo abductor de los orga-

nismos sobrevivientes expuestos a las diferentes concentra-
ciones de cobre y al inicio del experimento no presentaron nin-
2,0
guna variación significativa (P>0,261) FIG. 2. Estos resultados
sugieren que en el transcurso del bioensayo no se presentó un 1,5
proceso de división celular. Esta condición de no-crecimiento,
concuerda con las condiciones experimentales, donde no hubo 1,0
suministro de alimento en el período de aclimatación (120 h) y
durante las 96 h de experimentación. 0,5
En contraste con la concentración de ADN, el índice de
0
ARN/ADN de los juveniles fue dependiente de los tratamientos Inicial Control 0,05 0,1 0,2 0,8
empleados (P<0,001) FIG. 3. Esto, lógicamente, se debió a
una variabilidad en los niveles de ARN. El mayor índice se de- Concentración de cobre (mg L- 1)
terminó en los individuos al inicio de la experimentación
(P>0,05), lo cual sugiere la mejor condición de los individuos al FIGURA 2. CONCENTRACIÓN DE ADN EN JUVENILES DE
comienzo del experimento. PERNA VIRIDIS ANTES Y DESPUÉS DE LA EXPOSICIÓN A
DIFERENTES CONCENTRACIONES DE COBRE. LA DE-
Al final del bioensayo, el índice ARN/ADN mostró un au- GRADACIÓN DEL NEGRO SE PRESENTA EN RELACIÓN A
mento progresivo en el intervalo de 0,05 a 0,1 mgCu L -1, con- LA CONCENTRACIÓN DEL COBRE. LAS LÍNEAS VERTI-
centraciones donde todos los individuos presentaron un 100% CALES INDICAN EL ERROR ESTÁNDAR DE LA MEDIA EN
de Sobrevivencia. Posteriormente el índice disminuyó signifi- CADA TRATAMIENTO.
cativamente (P<0,05) en los ejemplares expuestos a las con-
significativa (P<0,05) del índice de ARN/ADN, es producto de
centraciones de 0,2 y 0,8 mgCu L -1, así como en los organis-
procesos metabólicos no relacionados con el crecimiento so-
mos no expuestos al cobre (grupo control). La no existencia de
mático. En este sentido, el aumento progresivo del índice en
diferencias en los niveles de ADN, sugiere que la variabilidad
los juveniles expuestos al cobre desde la concentración 0

487
Efecto del cobre en Perna viridis / Acosta, V. y Lodeiros, C.________________________________________________________________

(control) hasta 0,1 mgCu L -1, puede ser explicado por un au- 2,5
mento de la síntesis de proteínas como respuesta al incremen-
to del metal en concentraciones no estresantes. Esta hipótesis

Índice de ARN/ADN
se ve apoyada por la sobrevivencia total de los organismos a
2,0
dichas concentraciones. Una hipótesis alternativa es una posi-
ble estrategia de respuesta metabólica relativa a la exposición 1,5
del cobre, activando sustancias antitóxicas tales como la for- .
mación de complejos proteicos (metalotioninas), para atrapar
el excedente de metal presente dentro del organismo [24, 36].
1,0

Un hallazgo, que concuerda con nuestros resultados, es

0,5
el obtenido en investigaciones realizadas por Yang y Thomp-
son [40], en donde reportan que la exposición de Perna viridis
a bajas concentraciones de cadmio, zinc y cobre durante 96 h, 0
activan enzimas denominadas proteínas transportadoras de Inicial 0,1 0,05 0,2 0,8 Control
metales como una función de contribuir a la homeóstasis de Concentración de cobre (mg L -1)
estos metales en el metabolismo de varios tejidos de la espe-
cie, incluyendo el músculo. Estudios de activación enzimática FIGURA 3. RELACIÓN DEL ÍNDICE DE ADN/ARN EN JUVE-
relativos a la síntesis de proteínas y con especial referencia a NILES DE PERNA VIRIDIS ANTES Y DESPUÉS DE LA EX-
la formación de metalotioninas en concentraciones subletales POSICIÓN A DIFERENTES CONCENTRACIONES DE CO-
BRE. LA DEGRADACIÓN DEL NEGRO SE PRESENTA EN
de cobre en el mejillón verde P. viridis, deben ser realizados
RELACIÓN A LA CONCENTRACIÓN DEL COBRE. LAS LÍ-
para verificar las hipótesis antes señaladas. NEAS VERTICALES INDICAN EL ERROR ESTÁNDAR DE
Un hecho contrario a lo acontecido en las concentracio- LA MEDIA EN CADA TRATAMIENTO. LAS LÍNEAS HORI-
-1 ZONTALES INDICAN LA FORMACIÓN DE GRUPOS SIGNI-
nes de hasta 0,1 mgCu L , es el no aumento significativo del
índice de ARN/ADN en los individuos expuestos a las concen- FICATIVAMENTE IGUALES (P=0,05). EN ESTA FIGURA
-1 LOS TRATAMIENTOS (CONCENTRACIONES) SE ORDENA-
traciones de 0,2 y 0,8 mgCu L con respecto al grupo control.
RON EN FUNCIÓN DE LOS NIVELES DEL ÍNDICE OBTENI-
En este caso los individuos sobrevivientes a dichas concentra- DOS DE MAYOR A MENOR, PARA LA VISUALIZACIÓN DE
ciones posiblemente presentaron un estado de estrés avanza- LOS GRUPOS SIGNIFICATIVOS.
do, producido por dichas concentraciones (letales), conjunta-
mente con el estado de inanición establecido durante el bioen-
sayo, lo cual pudo generar una mayor disminución de la capaci- AGRADECIMIENTO
dad metabólica del organismo, afectando el proceso de síntesis
de proteínas y por ende la disminución del índice de ARN/ADN.
La investigación fue financiada parcialmente por el Con-
En este sentido, Bracho y col. [3], demostraron que el creci-
sejo de Investigación de la Universidad de Oriente y el Dpto.
miento instantáneo medido a través del índice ARN/ADN en
de Biología Pesquera del Instituto Oceanográfico de Venezue-
Perna viridis, es afectado por el estado de inanición.
la de la Universidad de Oriente. Se agradece la colaboración
Es evidente que el cobre a concentraciones elevadas técnica de la Estación Hidrobiológica de Turpialito.
actúa como un agente estresante de Perna viridis, ya que la
-1
DL 50 fue establecida en 0,67 mgCu L , considerándose dosis REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
-1
subletales concentraciones menores de 0,1 mgCu L , las cua-
les inducen al aumento de la síntesis de proteínas, probable-
[1] AGARD, J.; KISHORE, R.; BAYNE, B. Perna viridis (Lin-
mente para producir proteínas tipo metalotioninas, con la finali-
naeus, 1758) firts records of the Indo-Pacific green mus-
dad de mantener la homeóstasis del bivalvo.
sel (Mollusca: Bivalvia) in the Caribbean. Caribb. Mar.
Aunque los resultados permiten concluir que los niveles Stud. 3:59-60. 1992.
de ARN/ADN del tejido muscular de los juveniles de P. viridis,
[2] BEAUMONT, A.; TSERPES, G.; BUDD, M. Some effects
reflejaron un comportamiento relativo a una respuesta antitóxi-
of copper on the veliger larvae of the mussel Mytilus
ca en las diferentes concentraciones de cobre en el medio; es
edulis and the scallops Pecten maximus (Mollusca: Bi-
importante plantear estudios similares en los diferentes tejidos
valvia). Mar. Environ. Res. 21 (4):299-309. 1987.
del bivalvo, en función de entender mejor la actividad metabóli-
ca del organismo ante la presencia de xenobióticos. En este [3] BRACHO, M.; SEGNINI, M.; VIÑOLES, I.; CHUNG, K.
sentido, se recomienda que dicho estudio se determine utili- Efecto de la alimentación sobre la condición fisilógica del
zando además de los índices de ARN/ADN, otros índices bio- mejillón verde Perna viridis (L. 1758) (Mollusca: Mytili-
químicos como la actividad de enzimas reguladoras en los pro- dae), medido por la relación ARN/ADN. Reunión 29
cesos claves del metabolismo.

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