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PRÁCTICA X: NOMBRE DE LA PRACTICA

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MATERIA
NOMBRE DOCENTE

FECHA

Resumen
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 Existen células vegetales con la capacidad necesaria para permitir el crecimiento y el desarrollo
de un nuevo individuo, es decir, poseen una totipotencialidad celular. La potencialidad de una célula
diferenciada disminuye con el grado de diferenciación que posea, sin embargo puede revertirse
parcial o completamente según las condiciones de cultivo a la que se les someta. Una de las
respuestas celulares que se puede tener tras la adición de fitohormonas es la desdiferenciación de las
células acompañadas de un crecimiento tumoral, a lo que se le denomina “callo”. De los reguladores
más utilizados en el cultivo in vitro se encuentran las auxinas y las citoquininas. En la presente práctica
se trabajó en la resiembra de callos de caña de azúcar y formación de callo a partir de explantes de
geranio, obteniendo diferentes crecimientos tumorales en dos medios MS uno adicionado con auxina
(2,4-D) y el segundo con auxina (ANA) y citoquinina (BAP).
Objetivo
Que el alumno se familiarice con las técnicas de cultivo vegetal in vitro a través de la formación
de callos, ya sea de explantes o de callos previos.
Introducción
El concepto de explante se refiere a cualquier parte vegetal que ha sido separada de la planta,
que puede ser un tejido (fragmentos de hojas, tallos, raíces, pétalos, etc.), un órgano (semillas,
anteras, ovarios, botones florales, hojas y raíces completas, etc.), estructuras como las anteras y los
ovarios, o bien células individuales (como en el caso de los protoplastos). Con excepción de los óvulos
y el polen, los explantes están constituidos por tejidos y/o células (Ovando, 2013).

La selección del explante es un aspecto clave para tener éxito en el cultivo de tejidos, ya que
dependiendo de su ubicación en la planta, del tipo de tejido que contiene, de su edad cronológica y
fisiológica, de su contenido endógeno de hormonas, entre otros, se comportará de una manera o de
otra. Cuanto más pequeño es el explante más reducidas son también las probabilidades de
sobrevivencia. Los brotes apicales, por ejemplo, son en general, más efectivos que los axilares
(Suárez, 1993).

La reproducción asexual de plantas por cultivo de tejidos es posible gracias a que, en general,
varias células de un individuo vegetal poseen la capacidad necesaria para permitir el crecimiento y el
desarrollo de un nuevo individuo completo, sin que medie ningún tipo de fusión de células sexuales o
gametas. Esta capacidad se denomina totipotencialidad celular, y es característica de un grupo de
células vegetales conocidas como células meristemáticas, presentes en los distintos órganos de la
planta. La potencialidad de una célula diferenciada (una célula de conducción, epidérmica, etc.) para
generar tejidos nuevos y eventualmente un organismo completo, disminuye con el grado de

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diferenciación alcanzado por esa célula, pero puede revertirse parcial o completamente según las
condiciones de cultivo a las que se le someta (Germoplanta, 2015).

Las células vegetales crecidas en condiciones asépticas sobre medios de cultivo adicionados
con hormonas vegetales, pueden dividirse dando dos tipos de respuesta: 1) una desdiferenciación
celular acompañada de crecimiento tumoral, que da lugar a una masa de células indiferenciadas
denominada “callo”, la cual bajo las condiciones adecuadas es capaz de generar órganos o embriones
somáticos (llamados así porque son estructuras similares a un embrión, pero que no se originaron por
unión de gametas); y 2) una respuesta morfogenética por la cual se forman directamente órganos
(organogénesis) o embriones (embriones somáticos). La primera respuesta se conoce como
organogénesis o embriogénesis indirecta (mediada por un estado de callo) mientras que la segunda
respuesta se considera organogénesis o embriogénesis directa. El cultivo in vitro consiste en tomar
una porción de una planta (a la que se denominará explante, como por ej. el ápice, una hoja o
segmento de ella, segmento de tallo, meristema, embrión, nudo, semilla, antera, etc.) y colocarla en un
medio nutritivo estéril (usualmente gelificado, semisólido) donde se regenerarán una o muchas plantas
(Segretín, 2008).

Materiales
- Semillas con germinación (2)
- Callos de caña de azúcar
- 1 frasco de medio MS + ANA (1g/L) + BAP (1g/L)
- 2 cajas Petri con medio MS + 2,4D
- Pinzas y bisturí estériles
- Papel o sanitas
- Mechero

Reactivos
- Sulfato de cobre
- Etanol al 70%
- Etanol absoluto

Metodología
Primeramente fue necesaria la limpieza y desinfección de la cabina de seguridad en donde se
trabajó. Para ello, se roció sulfato de cobre sobre la superficie y las paredes y se limpió son una sanita.

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Posteriormente se utilizó etanol al 70% y se repitió el proceso de limpieza. Las pinzas y el bisturí
estériles fueron colocados en el frasco de etanol absoluto y se encendió el mechero dentro de la
campana.

El primer paso fue la resiembra de callos de caña de azúcar, entregados por el profesor. Se
abrieron la caja Petri que contenía los callos y la otra caja nueva con medio y auxina, manteniéndolas
siempre cerca del mechero. Las pinzas se sacaron del etanol y se colocaron sobre la llama del
mechero para su completa esterilización. Una vez que se enfriaron, se pudieron utilizar para tomar los
callos de caña de azúcar con mucho cuidado y colocarlos sobre el medio nuevo. Se colocaron tantos
callos como fue posible, siendo de diferentes tamaños. Las cajas Petri fueron selladas con cinta y
etiquetadas adecuadamente.

De las semillas que germinaron se procedió a la segmentación. De aquella que poseía tallo y
hojas, se cortó con ayuda de las pinzas y bisturí. Para evitar contaminación, se realizó el mismo
proceso de introducir los instrumentos en etanol absoluto y luego pasarlos por el mechero. Se cortaron
cuidadosamente el tallo y las hojas, obteniendo explantes de aproximadamente de 1 cm de longitud.
Éstos fueron colocados en Medio MS con fitohormonas ANA y BAP. Las semillas germinadas también
fueron colocadas dentro del mismo medio.

Resultados
De las 2 semillas que germinaron, se obtuvieron ocho explantes, dos de hoja, dos de semilla y
cuatro a partir de tallo. Se obtuvo la primera observación a los 8 días, como se muestra en la figura 1.
Los explantes presentaban callogénesis y las semillas restantes no presentaron germinación (15
semillas).

A) B)

Ilustración 1. ddhjfd

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 Figura 1 A) Formación de callo a partir de explantes. B) Semillas sin germinar en medio MS con hormonas.
Observación a los 8 días.

Los callos de caña de azúcar colocados en medio con 2,4D fueron observados a los 15 días
después de haberlos cambiado de medio. Se obtuvieron dos cajas Petri con callos de diferentes
tamaños, como se muestra en la figura 2. Se pudo ver un crecimiento de los callos, sin embargo la
velocidad de crecimiento varió en cada uno de ellos. La coloración fue principalmente de un color
blanco-amarillo, sin embargo se encontraron segmentos con coloraciones que variaban entre rojo y
café.

Figura 2. Crecimiento de callos de caña de azúcar en medio MS + 2,4D. Observación a los 15 días.

La observación final de los explantes de geranio se hizo después de 15 días de haber realizado
la colocación de explantes en el medio MS con hormonas. En el cultivo en el que se encontraban los
explantes en proceso de formación de callo, se vio mayor tamaño. El callo que se formó a partir de los
explantes de los tallos fueron aquellos que mostraron mayor crecimiento. De las semillas germinadas
fue donde se observó un menor crecimiento. Se puede observar en la figura 3.

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 Figura 3. Crecimiento de callo de geranio en medio MS + 1g/L ANA + 1 g/L BAP. Observación a los 15 días.

Discusión
Todo procedimiento para la propagación de cultivos vegetales in vitro debe ser llevado bajo
condiciones de asepsia, ya que es necesario mantener los cultivos exentos de contaminación. Debido
a que las células vegetales presentan largos tiempos de duplicación comparadas con las células
microbianas, es más sencillo poder observar macroscópicamente el crecimiento fúngico o bacteriano
en caso de existir (Ovando, 2013). Hasta el momento, se considera que se ha llevado un buen manejo
para la propagación in vitro, ya que no ha habido contaminación aparente por parte de hongos, tanto
en los medios, como en los explantes y callos.

Al resembrar los callos de caña de azúcar proporcionados por el profesor, se pudo ver la
composición de los mismos, y una situación que se presentó fue que el hacer el cambio de caja, no era
posible tomar las células juntas, sino que era muy sencillo separar el cúmulo de células. Es por ello
que se debió trabajar con precaución, tratando de infligir el menor estrés celular debido a la
manipulación. Éstos fueron colocados en cajas Petri con medio MS y auxina 2,4D, de concentración no
especificada. Esta auxina es utilizada ampliamente en el cultivo in vitro para la formación de callos. De
acuerdo a Espinosa et al. (2012), en un experimento donde se trabajaba con diferentes
concentraciones de 2,4D, independientemente de la concentración del factor de crecimiento, los callos
se formaron en todos los explantes. En este experimento no se pudo observar la formación propia del
callo, pero si se vio un crecimiento general sin diferenciación, tras 15 días después de la resiembra.
Algunos callos presentaron una coloración rojiza-café. De acuerdo a Cuéllar (1997), esta pigmentación

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se genera en ciertas variedades de azúcar debido al estrés que sufren las células en su fase adulta,
secretando mayor cantidad de fenoles.

Previamente se había realizado el protocolo para germinación de geranios. De las semillas

sembradas, sólo dos germinaron. Las 15 restantes fueron colocadas en medio MS con los reguladores
de crecimiento (ANA y BAP), esperando ver si germinaban. Después de 30 días de haberlas
sembrado, se propuso que se encontraban en estado de latencia. Las dos semillas con germinación
positiva fueron utilizadas para la presente práctica. Una de ellas presentaba un crecimiento celular muy
pequeño, por lo que se tomó la semilla y sólo se colocó en el medio MS con hormonas. La segunda
planta ya presentaba un tallo de aproximadamente una pulgada y una hoja. La hoja fue cortada a la
mitad con ayuda de las pinzas y bisturí y cada parte fue colocada dentro de la misma caja que la
semilla anterior. El tallo fue tomado con las pinzas y con el bisturí fue cortado con cuidado en cuatro
segmentos más la semilla, a la que se le dejó un pequeño fragmento de tallo. Cada una de las
secciones fue colocada dentro del medio de la misma manera que los previos.

Para este proceso de callogénesis, se realizaron dos observaciones, a los 8 y 15 días. A pesar
que los resultados finales se generaron a partir de la última observación, la primera sirvió como
cuidado de contaminación, ya que si se encontraban hongos, el medio y el material vegetal debía ser
desechado. El medio utilizado consistía en medio MS con hormonas de crecimiento ANA y BAP a una
concentración de 1g/L cada una. ANA (Ácido Naftilacético) es una auxina que contribuye a la
elongación célular, además fomentan el desarrollo de callos y la formación de raíces a partir de éstos.
Las auxinas son capaces de borrar la “programación genética” de tejidos diferenciados. BAP
(Benciladenina) es una citoquinina que promueve la división celular y organización de callos. Así
mismo, promueve la formación de brotes y diferenciación de los explantes (Mazariegos, 2011). Para el
cultivo de tejidos vegetales, es de suma importancia saber las concentraciones de fitohormonas que se
utilizarán de acuerdo a las necesidades propias del experimento. Para la formación de callos, se ha
visto que una concentración más o menos igual de las dos hormonas permite que las células sigan
indiferenciadas, pero en crecimiento (Universidad Politécnica de Valencia, 2003).

Conclusiones
Alexia
La callogénesis es un proceso indispensable en el cultivo vegetal in vitro. La toti potencialidad
de las células vegetales permite la “des diferenciación” bajo el estímulo de fitohormonas como auxinas
y citoquininas. El objetivo de la práctica se cumplió con éxito, ya que se pudo realizar tanto la
resiembra de callos de caña de azúcar, como la formación misma de las células sin diferenciar a partir

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de explantes de geranio. Así mismo, se pudo analizar a grandes rasgos la diferencia de crecimiento de
callo a partir de diferentes secciones de la planta y cómo influye el medio en el que se encuentran las
células para crecer, diferenciarse o mostrar estrés.

Rafael
Se logró obtener el conocimiento sobre el fundamento de la técnica de callogénesis. Esta
técnica en lo personal se me hace una técnica muy viable para la reproducción de alguna especie así
como también para la modificación genética de las mismas, ya que al obtener células des
diferenciadas es más sencillo modificarlas.

Andrea
Para esta práctica se estuvo trabajando con callos, una masa amorfa de apariencia
desorganizada, indiferenciados y de rápido crecimiento con ayuda de hormonas endógenas. El cultivo
in vitro es de gran importancia y cuenta con muchas aplicaciones a nivel profesional, nos ayuda a la
propagación continua y acelerada de determinado tejido de plantas. Es necesario cuidar la
esterilización de materiales para evitar la aparición de hongos, ya que la contaminación es muy común
en el cultivo in vitro.

Carlos
En conclusión, se pudo observar que el proceso de callogénesis es de suma importancia en la
micropropagación in vitro. Es de los pasos más importantes, ya que si no se forma un callo exitoso, no
se puede inducir ni la embriogénesis somática ni la organogénesis. Se aprendió que se necesita hacer
en condiciones de suma asepsia y que los callos necesitan tener constante medio para no sufrir estrés
por falta de nutrientes.

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Cuestionario Anexo 1
1. ¿Cuáles son las etapas para desarrollar un sistema de regeneración in vitro?
Para un sistema de regeneración in vitro (organogénesis) se presentan 7 etapas:
a) Establecimiento de la fuente de tejido vegetal, donde se selecciona el tejido para iniciar los cultivos.
Comúnmente se utilizan semillas para obtener material vegetal joven, meristemos o embriones
inmaduros.
b) Establecer un protocolo de desinfección del material vegetal. Generalmente utilizando soluciones de
hipoclorito de sodio, cloruros y/o etanol.
c) Obtención de células des diferenciadas en medios inductores de callos (concentración equitativa de
auxinas y citoquininas).
d) Formación de brotes en medios con más alta concentración de citoquininas respecto a las auxinas.
e) Elongación de los brotes adicionando giberelinas.
f) Inducción de raíces en medios con alta concentración de auxinas.
g) Adaptación de los cultivos a las condiciones ex vitro
Para un sistema de regeneración in vitro (micro propagación) se presentan 6 etapas:
a) Establecimiento de la fuente de tejido vegetal, donde se selecciona el tejido para iniciar los cultivos.
b) Establecer un protocolo de desinfección del material vegetal. Generalmente utilizando soluciones de
hipoclorito de sodio, cloruros y/o etanol.
c) Las semillas o yemas se colocan en medio de cultivo estéril, y en aproximadamente de 7-15 días
comienza la germinación o regeneración de nuevos tejidos.
d) De los cultivos del paso anterior, se realizan sub-cultivos y resiembras aumentando el número en cada
repetición.
e) Enraizamiento de los brotes en medios con auxinas como único regulador de crecimiento.
f) Adaptación de los cultivos a las condiciones ex vitro.
(Castillo, 2012) (Rico Reséndiz, 2013)

2. ¿Por qué se forman los callos in vitro y que hormonas se requieren para lograr la callogénesis?
Los callos son masas de células no diferenciadas que se encuentran en constante división. Son como
conclusión células que contienen en sí la característica de ser totipotenciales. Los callos no tienen patrones
predecibles de organización. Una de las características importantes de callo, desde un punto de vista funcional,
es su irregular crecimiento, teniendo el potencial para desarrollar raíces normales, brotes y embriones que
forman plántulas.
Para la formación de callos in vitro los medios de cultivo suelen estar suministrados con reguladores de
crecimiento. Para esto comúnmente se utilizan tanto auxinas como citoquininas. Por las primeras se utilizan
comúnmente el ácido naftalenacético (ANA), el Ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D) y el ácido indolacético (AIA)
entre otras. Por las segundas se utilizan comúnmente la 6-bencilaminopurina (BAP), la Benciladenina (BA) y la
kinetina por mencionar algunas.

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 (Matos Acurero & Sánchez, 2011) (Córdova, Cobos, Imán, & Castro, 2014) (Ortega, Soria, Taipe, & Reyes, 2013)

3. ¿Qué tipo de explante se utiliza para la formación de callo?

Varios factores deben ser tenidos en cuenta en la elección del explante apropiado para el establecimiento de
los cultivos in vitro, entre ellos esta principalmente el objetivo del cultivo:
a. Estudios básicos. En este caso los explantes pueden ser diversos. Si lo único que se desea es obtener
callos para algún estudio fisiológico, se puede utilizar cualquier órgano, tejido o célula viva. Una buena
fuente son explantes de semillas en germinación.
b. Obtención de plantas con sanidad controlada. El explante ideal son los meristemos, consistentes del
domo y de primordios foliares.
c. Micropropagación. Los ápices terminales y los segmentos uninodales de ramas jóvenes constituyen
excelentes explantes.
d. Obtención de híbridos interespecíficos. El explante cultivado es el embrión cigótico en estadios
tempranos de su desarrollo. Con la misma finalidad también se utilizan ovarios u óvulos fecundados.
e. Obtención de plantas de semillas con embriones rudimentarios. Los explantes pueden ser semillas
(por ej. orquídeas) o bien, se aíslan los embriones en un estado temprano de desarrollo como en el caso
de yerba mate o de algunas variedades de duraznero.
f. Obtención de plantas haploides. Los explantes más utilizados son las anteras, aunque también pueden
emplearse microsporas aisladas, óvulos y ovarios no fertilizados.
g. Inducción de variación somaclonal. Se pueden utilizar varios explantes, pero si la finalidad de su
utilización es la aplicación en planes de mejoramiento genético de plantas, los explantes utilizados deben
posibilitar la regeneración de plantas enteras.
h. Producción y/o conversión de sustancias útiles. Explantes de raíces suelen ser muy utilizados.
i. Obtención de híbridos somáticos. Protoplastos. En la mayoría de los casos se aíslan los protoplastos
de mesófilos de hojas y de suspensiones celulares.
j. Conservación e intercambio de germoplasma. Los meristemas son los explantes preferidos para el
desarrollo de sistemas de conservación a mediano y largo plazo (críoconservación con nitrógeno líquido)
y para el intercambio de material genético.
k. Establecimiento de suspensiones celulares. A partir de explantes extraídos de semillas en
germinación (hipocótilo, epicótilo, cotiledones, raíces).
(Levitus, Echenique, Rubinstein, Hopp, & Mroginski, 2010)

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Ejemplos de p ropagación in vitro de especies en México
Anexo 2
Esbeydi Martínez, C. (2014). Cultivo in vitro mediante embriogenesis somatica y transformacion genetica
de maiz (Zea mays L.).

Al ser el maíz uno de los alimentos más consumidos en nuestro país, es importante desarrollar metodologías
para una reproducción aumentada. Debido al problema de la sequía, muchas veces los agricultores sufren para
poder producir cultivos de maíz.

El principal objetivo de la investigación era obtener plantas transgénicas de maíz que acumularan trehalosa. Para
lograrlo se utilizó una línea de maíz que había sido anteriormente probada para obtención de callo embriogénico
a partir de embriones inmaduros. Se evaluó la capacidad regenerativa utilizando como explantes embriones
inmaduros y embriones maduros. Los resultados mostraron que puede inducirse callo embriogénico en ambos
tipos de explantes. En ambos casos el callo pudo ser regenerado de manera exitosa hasta la obtención de
plantas el problema es que algunas plantas completas presentaban anormalidades en los aparatos
reproductivos. A pesar de esto llegaron a la conclusión que los embriones inmaduros y los embriones maduros
son dos explantes aptos para generar callo embriogénico.

Rico Reséndiz, F. E. (2013). Establecimiento de un sistema de regeneración in vitro de acacia

angustissima via organogenesis directa.

La Acacia angustissima es un arbusto de pequeño tamaño que crece principalmente en los Estados Unidos,
México y en algunos países de Centroamérica. De esta planta se pueden utilizar sus semillas las cuales
contienen un alto contenido de proteínas, fibra y taninos, su cultivo es utilizado como forraje y como alimento
para ganado. Algunos pueblos indígenas utilizan este arbusto como medicamento.

El objetivo del trabajo era establecer las condiciones de un sistema para la regeneración in vitro de esta especie.
A su vez se estableció un protocolo de desinfección y germinación de las semillas para obtener plantas jóvenes.
Estos cultivos jóvenes fueron los utilizados como fuente de tejido vegetal, utilizando 5 tipos de explantes, en
donde el cotiledón presentaba la mejor opción. Se evaluó la inducción del callo utilizando medio MS con
BAP+2,4-D y un segundo medio MS con CIN+2,4-D a diferentes concentraciones. Para la inducción de brotes se
probaron diferentes concentraciones de BAP+ANA, sin obtener resultados. Se probaron medios adicionados con
ANA para la inducción de raíz. Y se logró una tasa del 45% de sobrevivencia a condiciones ex vitro.

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Referencias
Castillo, A. (2012). Propagación de plantas por cultivo in vitro: una biotecnología que nos acompaña hace mucho
tiempo. Obtenido de Instituto Nacional de Investigación Agropecuaria:
http://www.inia.uy/Publicaciones/Documentos%20compartidos/111219220807102417.pdf

Córdova, A., Cobos, M., Imán, S., & Castro, J. (2014). Un método eficiente para la inducción de callos in vitro en
Myrciaria dubia (Kunth) Mc Vaugh "Camu Camu". Scientia Agropecuaria, 25-34.

Cuéllar, J. M. (1997). Propagación vegetativa in vitro a partir de hojas jóvenes de caña de azúcar (Saccharum
officinarum L.). Obtenido de Agronomía Mesoamericana:
http://www.mag.go.cr/rev_meso/v08n01_074.pdf

Esbeydi Martínez, C. (2014). Cultivo in vitro mediante embriogenesis somatica y transformacion genetica de maiz
(Zea mays L.). Chapingo, Estado de México: Universidad Autónoma Chapingo. Obtenido de
http://www.chapingo.mx/horticultura/pdf/tesis/TESISDCH2014063009127253.pdf

Espinosa, A. et al. (4 de diciembre de 2012). Efecto del tipo de explante y la concentración de ácido 2,4-
diclorofenoxiacético en la formación de callos en Morus alba L. Obtenido de Pastos y Forrajes:
http://scielo.sld.cu/scielo.php?pid=S0864-03942012000400006&script=sci_arttext

Germoplanta. (2015). Callogénesis. Obtenido de http://germoplanta.com/index.php?

option=com_content&view=article&id=33&Itemid=37

Levitus, G., Echenique, V., Rubinstein, C., Hopp, E., & Mroginski, L. (2010). Biotecnología y Mejoramiento
Vegetal II. Buenos Aires: ArgenBio.

Matos Acurero, Á., & Sánchez, A. (2011). Evaluación de reguladores de crecimiento. Multiciencias, 11(1), 7-14.

Mazariegos, C. A. (Mayo de 2011). Evaluación de tres concentraciones de auxinas (ANA) y cinco de citosinas
(BAP) en la propagación in vitro del piñon (Jatropha curcas L.). Obtenido de Instituto de Investigación
Agronoóicas: http://biblioteca.usac.edu.gt/tesis/01/01_2629.pdf

Ortega, G., Soria, N., Taipe, M., & Reyes, C. (2013). Inducción al proceso de callogenesis in vitro a partir de
cotiledones y ejes embriogenicos de semillas maduras de Guarango (Caesalpinia spinosa). Sangolqui.

Ovando, I. (2013). Manual de Cultivo de Tejidos Vegetales para Ingenieros Biotecnólogos. Obtenido de
http://exa.unne.edu.ar/biologia/fisiologia.vegetal/Manual%20c%20in%20v.pdf

Rico Reséndiz, F. E. (2013). Establecimiento de un sistema de regeneración in vitro de Acacia angustissima vía
organogénesis indirecta. Obtenido de Universidad Autonoma de Queretaro:
http://ri.uaq.mx/bitstream/123456789/1142/1/RI000704.pdf

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Universidad Politécnica de Valencia. (2003). La relación auxina/citocinina regula la morfogénesis en cultivos de

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