Técnicas fundamentales de Biología

Alba Gutiérrez Pastur

Microscopía
 Las lentes de los microscopios aumentan la resolución de los objetos que vemos y el
microscopio es el resultado de combinar dichas lentes para poder potenciar dicha
capacidad de aumento.
 Gracias a la capacidad de visión y al sistema óptico somos capaz de proyectar
imágenes, pero nuestros ojos tienen un límite de resolución (0.1 mm, 100 μm).
- Este límite es el tamaño mínimo de un objeto para poder ser visto.
- El problema es que el tamaño de las células animales ya se encuentra por debajo
del límite del ojo humano por tanto necesitamos de una ayuda para poder verlas.
- Las lentes pueden producir imágenes aumentadas de los objetos, aumentando la
resolución. Pueden combinarse y así potencian su capacidad de aumento.
- Un microscopio es un instrumento formado por lentes combinadas.
 Dos grandes tipos de microscopios:
1. Microscopios Ópticos:
- Utilizan radiación electromagnética, normalmente luz visible.
- Límite de resolución: 0.2 μm.
- Hay muchos tipos de microscopios ópticos, aportando cada tipo información
complementaria.
1.1. De campo claro
1.2. De campo oscuro
1.3. De contraste de fases
1.4. De luz polarizada
1.5. De fluorescencia
1.6. De láser confocal
2. Microscopios Electrónicos:
- Utiliza electrones acelerados mediante campos eléctricos.
- Límite de resolución: 0.001 μm, 1nm.
- Dos tipos principales:
2.1. ME de transmisión (MET)
2.2. ME de barrido (MEB)

 MICROSCOPIO ÓPTICO (ESTRUCTURA)

Un microscopio óptico presenta tres tipos de componentes:
1. Componentes mecánicos:
- Sirven de sujeción dinámica de los sistemas ópticos, de iluminación y de los
objetos que se van a observar. Base (pie), brazo (estativo), platina, tubo,
revólver, tornillos de enfoque, cremallera y cabeza.
2. Componentes de iluminación:
- Lámpara de bajo voltaje con reostato para regular la intensidad.
- Filtros. Seleccionan una longitud de onda.
3. Componentes ópticos:
- Elementos fundamentales del microscopio.
- Conducen la luz y forman las imágenes.
- Dos tipos.
3.1. Prismas:
- Desvían los rayos luminosos de la trayectoria rectilínea del eje óptico del
objetivo para dirigirlos hacia el tubo.
 - Ergonomía
- Separan el haz luminoso proveniente del objetivo en dos haces y dirigen uno a
cada ocular.
- No producen aumento
3.2. Lentes.
- Lentes biconvexas o convergentes.
- Forman la imagen aumentada
- Tres sistemas de lentes en serie: Lente condensadora, Lente objetivo y Lente
ocular.

 Preparaciones y muestras.
- Las muestras histológicas son cortes finos de tejido colocados en láminas de
cristal.
- No pueden ser observadas directamente en un microscopio. Precisan un proceso
previo.
- El tratamiento de las muestras implica tres procesos principales: Fijación, Corte
y Tinción

1. FIJACIÓN.
- Las células son elementos altamente organizados y termodinámicamente
inestables, por ello, requieren energía para mantener su organización.
- Cuando una célula o un tejido se separa del organismo esta muere ya que cesa el
aporte de energía y empieza un proceso de desorganización, alterando de forma
drástica la estructura.
- La fijación es un tratamiento físico o químico que inmoviliza las
macromoléculas celulares. Proteínas y lípidos. Evita la desorganización,
manteniendo la estructura parecida a la del estado vivo/funcional.
- Hay dos tipos:
1.1 Fijación física: Congelación.
1.2 Fijación química: Tratamiento con productos citotóxicos que inducen el
establecimiento de enlaces covalentes cruzados entre proteínas solubles y
estructurales provocando así inmovilización.

2. CORTE
 - Se precisa obtener secciones finas de las muestras para observarlas al
microscopio. Deben ser finas para que la luz las atraviese, si la muestra es
gruesa resulta opaca a la luz y no se forma imagen.
- Se cortan gracias al microtomo. Antes del corte se realiza un tratamiento para
endurecer el tejido. Congelación. Inclusión.
- El microscopio forma una imagen plana de una proyección vertical. Los
elementos en distintos planos de un eje vertical se proyectan en el mismo punto.
Se produce un solapamiento que impide resolver los elementos.

3. TINCIÓN
- Las células y los tejidos tienen en general coeficientes de absorción muy bajos.
Absorción: disminución de la amplitud de la onda (intensidad) al atravesar el
objeto Si no hay absorción, la luz no se modifica al atravesar la muestra, es
transparente. No se forma una imagen. Es necesario realizar un proceso de
tinción con colorantes para aumentar la absorción diferencial.
- Un colorante reacciona químicamente con determinados compuestos de un
tejido. El colorante modifica la absorbancia del objeto y transforma diferencias
químicas invisibles en diferencias de color. Un mismo tejido teñido con
diferentes colorantes puede mostrar un aspecto muy variable.

 Características fundamentales de la luz

- Luz: naturaleza dual, onda y corpúsculo. A efectos ópticos se considera su
naturaleza ondulatoria.
Onda cíclica resultante de la combinación de un campo eléctrico oscilante y un
campo magnéticos oscilante. Radiación electromagnética

- Tres parámetros fundamentales:

1. Longitud de onda (λ). Distancia entre dos ciclos consecutivos.
2. Frecuencia de onda (v). Número de ciclos por unidad de tiempo.
3. Velocidad de propagación lineal (c). Producto de la longitud por la
frecuencia de la onda, c= λ.ν (300.000 km/s.)
- Espectro electromagnético. Comprende una amplia variación de longitudes de
onda. Las radiaciones varían desde λ de nm (10-9) a km (103)
El ojo humano sólo es sensible a la radiación comprendida entre λ 380 nm
(violeta) y 780 nm (rojo-granate)
Espectro visible (0,38-0,78 μm, variación de 0,4 μm)
 Lentes.
- Sistemas que cambian la dirección de la luz por efecto de la refracción.
Refracción: variación de la velocidad y de la dirección de propagación de la luz
en función del medio.
- Índice de refracción de un medio (n): relación entre la velocidad de la luz en el
vacío y la velocidad en el medio.
- Índice de refracción de un medio ni = c/vi
c en el vacío es 300.000 km/s (valor máximo).;
c en el agua es 225.564 km/s.
n agua= 300.000 / 225.564 = 1,33
- Ley de la refracción o ley de Snell.
Al pasar la luz de un medio a otro con distinto n cambian la velocidad y la
dirección de propagación de la luz
El cambio de la dirección de propagación sigue la ecuación: n1Senθ1 = n2
Senθ2
- Una lente cambia la dirección de la luz por dos factores:
1. Índice de refracción. Cuanto más alto, mayor el cambio.
2. Geometría. Determina la recta normal a la superficie Biconvexas.
Convergentes. Bicóncavas. Divergentes.
 - Si tenemos un mismo objeto con localización constante: cuanto menor es la
distancia focal de la lente mayor es el aumento. La distancia focal de la lente
depende de su geometría.
Las características de la imagen final formada dependen de la distancia focal de
la lente y de la localización del objeto en relación a la lente.

 Estructura óptica de un microscopio (campo finito)

La muestra/objeto se coloca entre las lentes condensador y objetivo.
- El condensador no afecta al aumento, aunque sí a la resolución.
- Concentra la mayor cantidad de rayos luminosos sobre el objeto.
- La muestra se sitúa por fuera de la distancia focal del objetivo.
La lente objetivo forma la imagen intermedia

- Se forma en el interior del tubo.

- Imagen real, aumentada e invertida.
La imagen intermedia es el objeto de la lente ocular.

- La imagen intermedia se proyecta en la distancia focal del ocular (*).

- El ocular forma la imagen final.
- Virtual
- Aumentada (A obj x A ocul)
- No invertida en relación a la imagen intermedia. // Invertida en relación a la
imagen final.
 Microscopios con óptica corregida al infinito (óptica infinita)
El objeto se coloca en la distancia focal de la lente objetivo.
- Maximiza el aumento.
- Los rayos lumínicos salen paralelos.
- La imagen intermedia se sitúa en el infinito.
- El objetivo no forma directamente una imagen real.
Es necesario una lente adicional, la lente proyectora.
- Se sitúa dentro del tubo.
- Hace converger los rayos y produce una imagen intermedia real.
Mejor definición que la óptica finita. Óptica de los microscopios modernos
 Parámetro ópticos de un microscopio
1. Aumento
2. Poder de resolución
3. Profundidad de campo visual
4. Contraste
5. Número de campo visual
AUMENTO.
Relación lineal entre el tamaño de la imagen producida por la lente y el tamaño del
objeto. Número de veces que la imagen es mayor que el objeto. El aumento depende de
tres factores:

- Distancia focal de la lente.

El aumento es mayor cuando la distancia focal de la lente es pequeña.
Potencia o poder óptico de una lente.
Inverso de la distancia focal. P=1/f. unidad dioptría (1/m).
3 Dioptrías / 1.75X 5 Dioptrías / 2.25X 8 Dioptrías / 2.75X
- Localización del objeto.
El aumento se incrementa cuanto más cerca se sitúe el objeto del punto focal.
El aumento es máximo cuando el objeto se coloca sobre el punto focal. La lente
forma la imagen en el infinito. Imagen virtual.
La córnea y el cristalino del ojo concentran la luz en la retina sin esfuerzo de
acomodación. Base del microscopio con óptica corregida al infinito
- Número de lentes.
Cuando dos lentes están en serie, la imagen que forma la primera es el objeto de
la segunda lente.
 El aumento de dos lentes se multiplica.
El aumento es más alto cuanto mayor sea el número de lentes colocadas en serie.
Aumento infinito // Aumento vacío // Aumento útil
Existe un límite de aumento útil. A partir de ahí se entra en el aumento vacío.
El límite de aumento útil viene dado por el poder de resolución.

PODER DE RESOLUCIÓN DE UN MICROSCOPIO

La resolución es la capacidad de ver como separados dos objetos próximos.
El límite de resolución (d) es la mínima distancia a la que dos objetos pueden estar y
ser vistos separados.
El poder de resolución es el inverso del límite de resolución. El poder de resolución de
una lente es mayor cuanto menor sea su límite de resolución.
El límite de resolución (d) depende de cuatro factores:
1. La densidad de fotorreceptores del ojo humano, capacidad de resolución.
Constante, K=0,61
2. La longitud de onda (λ) de la emisión empleada.
Cuanto más pequeña es λ, d es más pequeño, y el poder de resolución es mayor (0,38-
0,78 μm).
Cuanto más pequeña, d es más pequeña, mayor poder de resolución.
Dos puntos no pueden resolverse si están separados por una distancia inferior a la λ con
que se iluminan. Fuentes de iluminación con filtros que dejan pasar sólo la luz azul.
3. El índice de refracción (n) del medio óptico que atraviesa la luz entre la lente y el
objeto examinado.
El índice de refracción (n) del medio que atraviesa la luz entre el objeto y la lente
objetivo.
Si n es mayor que 1 se produce una desviación de aproximación a la normal.
Incremento del ángulo de captación de rayos lumínicos.
Aumento de la luminosidad de la imagen
Para aumentar n se pone una gota de líquido n>1 entre la muestra y el objetivo.
Objetivos de inmersión vs (objetivos secos)

- Agua, n=1,33
- Aceite de cedro, n=1,515
- Monobromonaftaleno n=1,66.

4. El ángulo de apertura que forma los rayos más externos que entran en la lente.
Se define el semiángulo de apertura como la mitad del ángulo de apertura, (θ = α/2)
El límite de resolución es inversamente proporcional al seno del semiángulo de apertura
El producto del denominador, nsenθ recibe el nombre de apertura numérica (AN).
El límite de resolución será menor cuanto más pequeño sea el numerador (λ) y mayor el
denominador (AN).
El poder de resolución será mayor cuanto más pequeño sea el límite de resolución.
Ángulo máximo de incidencia que la lente es capaz de focalizar, α = 2θ.
- Una lente convergente recoge rayos lumínicos procedentes de un objeto y los
focaliza en un punto.
- Cuanto mayor es el ángulo de apertura mayor es la cantidad de luz emitida por el
objeto que se utiliza para formar la imagen.
Determina la luminosidad de la imagen. La luminosidad es crítica para formar
imágenes aumentadas porque el aumento produce un descenso de la densidad de luz.
El ángulo de apertura es mayor cuanto más cerca se encuentre la lente del objeto.
- Los objetivos de mayor resolución enfocan muy cerca de la muestra.
- Los objetivos de 40X y 100X presentan un mecanismo de amortiguación.
Se denomina apertura numérica (A.N.) al producto de n por el seno de θ.
La apertura numérica de la lente objetivo es el parámetro óptico más importante de un
microscopio.
Marca el límite del aumento útil.
- El aumento final debe estar entre 500X (A.N.) y 1000X (A.N.) de la lente
objetivo
- Si se pasa de 1000X AN se entra en el aumento vacío.
- La lente objetivo es crítica porque determina la calidad de la imagen intermedia.
El valor máximo obtenido para la A.N en un objetivo es de 1,4. Corresponde a:
- Ángulo de apertura de 143,6º. Sen 71,8=0,95
- Índice de refracción 1,5. Inmersión en aceite.
- Construido en 1886 por Carl Zeiss según diseño de Ernst Abbé

Lente condensadora:
No afecta al aumento pero sí a la resolución.
Condensa luz hacia la muestra.
- Incrementa la intensidad de luz que llega al objeto.
- Aumenta la luz emitida por el objeto para la formación de la imagen.
- Incrementa la luminosidad.
- Incrementa la resolución
Acción aditiva de las lentes condensador y objetivo

El condensador lleva incorporado en la zona inferior un diafragma.

Instrumento mecánico con diámetro variable. Regula el paso de la luz.
Cuando se cierra el diafragma baja la apertura numérica del condensador.
- La imagen pierde luminosidad y definición.
- Gana profundidad de campo y contraste
PROFUNDIDAD DE CAMPO VISUAL
La profundidad de campo es la resolución del microscopio en el plano vertical.
Capacidad de enfocar varios planos horizontales de forma simultánea.
- Distancia entre el primer y último punto del objeto en el eje vertical
reproducidos nítidamente en la imagen
- Parámetro determinado por la lente objetivo.
La profundidad de campo disminuye al aumentar la resolución.
- Inversamente proporcional al cuadrado de la apertura numérica (A.N.)
- Cerrando el diafragma baja la apertura numérica, baja la resolución y aumenta
la profundidad de campo.
CONTRASTE.
Diferencia de intensidad lumínica (amplitud) entre el objeto y el fondo.
- Tiene su origen en la disminución de la amplitud de la onda al atravesar el
objeto.
- Depende de la absorción de luz por el objeto.
- Tratamiento con colorantes.

El contraste se puede modificar con el diafragma.

- Cuando se cierra el diafragma baja la apertura numérica del condensador. La
imagen pierde luminosidad y definición.
- Aumenta la profundidad de campo y el contraste.
NÚMERO DE CAMPO VISUAL
Campo visual es la superficie de la muestra que se ve a través del ocular. Forma
circular. El número de campo visual (FN) es el diámetro en mm de esa superficie
- Parámetro de la lente ocular.
Una lente ocular tiene dos parámetros principales:
 - Aumento lineal
Multiplica los aumentos de la lente objetivo
Nunca puede dar un valor mayor de 1000 veces la apertura numérica de la lente
objetivo
- Índice de campo visual
Número de campo (diámetro en mm de la superficie de muestra) que se
obtendría con un objetivo 1X.
Permite calcular el número de campo para cualquier objetivo. Cociente entre el
FN del ocular y el aumento del objetivo.
FN 20. Objetivos de 4, 10 y 40x. d=20/4=5 mm (objetivo 4X); d=20/10=2
mm(10X) y d=20/40= 0.5 mm (40X).
Se puede calcular el área del campo visual utilizando S = ηr 2.

 Aberraciones ópticas
Distorsión de la imagen en relación al objeto.
- Alteración de la distancia relativa de los puntos del objeto.
Proyección de un punto del objeto en una región más extendida.
- Solapamiento en la imagen de puntos próximos del objeto.
- Pérdida de resolución.
Dos tipos de causas de las aberraciones.
- Imperfecciones de la lente. Problemas técnicos.
- Intrínsecas a la naturaleza de la luz. Aberraciones ópticas.
Tipos de aberraciones ópticas.
- Aberración cromática.
- Aberración esférica.
- Curvatura de campo.
- Astigmatismo.
- Distorsión.
- Coma.
Tres son muy importantes en microscopía.
- Aberración cromática.
- Aberración esférica.
- Curvatura de campo
Se desarrollan mecanismos de corrección.
- El nivel de corrección da lugar a diferentes tipos de lentes.

 Aberración cromática
Se produce cuando se usa luz blanca, λ 380-780 nm.
La disminución de la velocidad en un medio n>1 es diferente para cada λ.
- La luz de mayor λ disminuye menos su velocidad. Tiene menor ángulo de
desviación.
 - La luz de menor λ disminuye más su velocidad. Tiene mayor ángulo de
desviación.
Un punto del objeto se focaliza para cada color en un punto distinto de la imagen.
Se produce superposición en la imagen de puntos próximos en el objeto. Imagen
difusa. Se corrige combinando varias lentes con distinta geometría e índice de
refracción.
- Una lente biconvexa de vidrio Flint se combina con una lente cóncava de vidrio
Crown.
- Las aberraciones de cada lente se compensan y anulan.
No es posible formar imágenes nítidas utilizando una sola lente.
- La construcción de lentes precisas implica el diseño de sistemas complejos de
lentes

 Aberración esférica
Los rayos de un punto se focalizan de modo distinto dependiendo de la distancia al
eje óptico.
- Los próximos al centro del eje (rayos paraxiales) se focalizan más lejos.
- Los lejanos del centro del eje (rayos marginales) se focalizan más próximos.
Dos focos:
- Foco paraxial. Más lejano de la lente.
- Foco marginal. Más próximo a la lente.
La distancia entre los focos paraxial y marginal se denomina aberración de
esfericidad longitudinal (mm)
- Cuanto mayor es la distancia (aberración de esfericidad), menor es la resolución.
La aberración de esfericidad es inversamente proporcional al cubo de la longitud
focal.
- Mayor cuanto menor es la distancia focal. Lentes de alto aumento.
Microscopio.
El uso de diafragmas en las lentes (condensador, objetivo y ocular) suprime rayos
periféricos.
- Disminuye la aberración esférica.
- Disminuye la luminosidad y la definición.
Las aberraciones cromática y esférica se potencian entre sí. Se corrigen de forma
conjunta. Se corrigen combinando varias lentes con distinta geometría e índice de
refracción.
 Corrección conjunta de las aberraciones cromática y esférica.
Las aberraciones cromática y esférica se potencian entre sí.
 Se corrigen de forma conjunta combinando varias lentes con distinta geometría e
índice de refracción.
Las correcciones implican un aumento del número y complejidad de las lentes.
Proceso muy costoso.
Se aplica principalmente a las lentes objetivo, lentes más importantes del sistema.
En función del nivel de corrección se distinguen tres tipos de lentes objetivo:
- Objetivos acromáticos.
Corrección de la aberración cromática para dos colores: rojo y el azul. Extremos
del espectro.
Corrección de la aberración esférica sólo para el verde. Zona central del
espectro.
- Objetivos semi-apocromáticos.
Corrección cromática completa desde el azul al rojo.
Corrección de la aberración esférica para el rojo y el azul.
Contienen lentes de fluorita y por ello se les denomina también objetivos de
fluorita.
- Objetivos apocromáticos.
Tienen corrección completa de las aberraciones cromática y esférica.
Son los más perfectos. Alta complejidad de lentes.

 Curvatura de campo.
Distintos puntos localizados en un mismo plano vertical del objeto se focalizan en
planos distintos.
- Los puntos próximos al centro del eje óptico se focaliza más lejos.
- Los puntos alejados del centro del eje óptico se focalizan más cerca.
El plano focal de una lente es una superficie cóncava hacia la lente, superficie de
Petzval.
- Un objeto plano vertical da lugar a una imagen curvada hacia la lente.
- No se puede enfocar todo el campo visual simultáneamente.
Se corrigen combinando varias lentes con distinta geometría e índice de refracción.
 Corrección de la curvatura de campo
En función de la corrección o no de la curvatura de campo se distinguen dos tipos de
lentes objetivo
- Objetivos de campo curvo
Sin corrección de la curvatura de campo.

- Objetivos de campo plano

Presentan corrección completa de la curvatura de campo.
Enfocan simultáneamente el centro y la periferia del campo.
Suponen un grado mayor de complejidad del sistema óptico.

 Lentes objetivo
Combinando la corrección de aberraciones esféricas, cromáticas y curvatura de
campo, 6 tipos:
 - Acromáticos.
- Semiapocromáticos.
- Apocromáticos
- Plan Acromáticos.
- Plan Semiapocromático.
- Plan Apocromáticos.

 Lentes oculares
Sistema óptico que forma la imagen final.
Aumenta la imagen intermedia y la transforma en una imagen virtual.
Estructura básica.
- Lente superior u ocular. Produce el aumento de la imagen intermedia.
- Diafragma. Elimina rayos marginales.
- Lente inferior o colectora. Aplana y aclara el campo.
Su estructura se puede complicar dependiendo del grado de corrección de
aberraciones.
Dos parámetros ópticos principales.
- Aumento lineal
- Índice de campo visual.

 Parámetros de las lentes de un objetivo

Sin óptica plana. Sin especificación de corrección de curvatura de campo.
Acromático. Corrección baja de la aberración esférica y cromática. (A)
Aumentos lineales (40)
Apertura numérica. Poder de resolución. Límite aumento útil 650X (0.65)
Óptica finita. Distancia en mm entre los focos del ocular y del objetivo. (160)
Grosor en mm del cubre. Actúa como una lente del sistema el microscopio. Seco. Aire
entre el objeto y la lente. (0.17)

 Microscopio óptico de campo oscuro

Microscopio óptico con un sistema de iluminación modificado. Condensador
específico.
 - Presenta antes del condensador un filtro opaco que bloquea el paso de la parte
central del haz lumínico.
- Se forma un cono hueco de luz, con el centro oscuro.
- Sólo llegan a la muestra rayos que inciden de forma oblicua.
- Los rayos oblicuos atraviesan la muestra y quedan fuera del eje óptico del
objetivo.
- No entra luz en las lentes, no se forma imagen.
Sólo entran en la lente los rayos que desvían su trayectoria al atravesar la
muestra.
- Sólo forman imágenes las estructuras difractantes, capaces desviar la luz.
Imagen con muy baja intensidad, pero con contraste muy alto.
- La imagen aparece como un objeto luminoso sobre un fondo oscuro. Alta
sensibilidad.
Las partículas difractantes pueden ser endógenas o exógenas. Tratamientos previos.
 Microscopio óptico de campo oscuro. Iluminación Rheinberg
Variación del campo oscuro. Inventada en 1895 por el microscopista inglés Julius
Rheinberg
Presenta un filtro antes del condensador.
El filtro tiene una región central con un color oscuro y un filtro periférico más
claro de diferente color.
Se forma un cono de luz, con la zona central de baja intensidad y la periferia de otro
color y mayor intensidad.
- La luz de la región central atraviesa la muestra, entra en el objetivo y forma una
imagen de baja luminosidad.
- La luz periférica incide de forma oblicua sobre la muestra.
- Los rayos oblicuos sólo entran en la lente si se desvían al atravesar la muestra.
- Se resaltan en otro color sobre la imagen general las estructuras difractantes
que desvian la luz periférica
Se obtienen imágenes en color con la definición y datos de la iluminación de campo
oscuro.
 Microscopio de contraste de fases
Desarrollado por el físico holandés Frits Zernike en 1930. Premio Nobel en física en
el año 1953.
Microscopio que permite diferenciar zonas transparentes con distinto índice de
refracción.
Permite el estudio de células vivas sin ninguna manipulación previa.
Las células tienen baja absorbancia pero altos índices de refracción que varían de
unas zonas a otras.
- Cuando la luz pasa a un medio con n > 1 se produce una disminución
transitoria de la λ.
- Cuando lo atraviesa y sale al medio con n=1 se recupera la λ inicial.
- Se mantiene un retraso en la fase de la onda, un cambio de fase. Dependiente
de n y de la longitud.
 - Los cambios de fase no son perceptibles a nuestro ojo.
- El microscopio de contraste de fases transforma cambios de fase invisibles en
cambios de amplitud visibles.
La transformación se produce mediante fenómenos de interferencia.
- Las interferencias positivas aumentan la amplitud.
- Las interferencias negativas disminuyen la amplitud.

 Microscopio de contraste de fases

Un microscopio de contraste de fases es un microscopio óptico con dos elementos
adicionales.
Diafragma anular del condensador
- Anillo transparente con la zona central opaca. Forma un cono de luz hueco fino
que atraviesa la muestra y entra en la lente.
- La luz atraviesa la muestra y pueden darse dos situaciones:
Luz no desviada. Pasa por zonas de bajo n. No se desvía y entra en la lente por
la zona periférica.
Luz desviada. Pasa por zonas de alto n. Se refracta, se acerca a la normal y
entra en la lente por la zona central.
Placa de difracción o anillo de fase localizado dentro del tubo de la lente objetivo
- Disco ranurado de material con alto n dentro de la lente objetivo. Presenta dos
regiones:
Zona central gruesa.
Presenta un vidrio grueso con alto índice de refacción.

Región por la que pasa la luz desviada.

Incrementa el desfase (retraso) de la luz desviada.
Anillo periférico fino.
Región mucho más fina con bajo índice de refracción.
Región por la que pasa la luz no desviada. No retrasa la fase de la luz.
Presenta una capa metálica absorbe parte de la luz y disminuye intensidad de la
luz. Equilibra luz desviada y no desviada
El paso por la placa de difracción incrementa el desfase entre luz desviada y no
desviada.
La convergencia de los dos rayos da lugar a una interferencia destructiva.
- El objeto con n alto aparece más oscuro que el fondo.
- Recibe el nombre de contraste de fase oscuro o positivo
Microscopio utilizado ampliamente para la observación de células vivas.
- Básico para estudios de cultivos celulares.
- Una limitación es que las imágenes presentan halos claros alrededor de los
detalles.
La observación de células en cultivo implica poder ver placas de cultivo en el
microscopio.
Existe la limitado de la distancia de trabajo de los objetivos, que es muy corta.
Para solucionar este problema los microscopios de fase pueden ser invertidos.
- La luz y el condensador se localizan en posición superior y los objetivos en la
zona inferior, por debajo de la muestra.
- La platina tiene espacio para las placas de cultivo.

 Microscopio de contraste por interferencia diferencial

Denominado también microscopio de Nomarski o DIC.
- Patentado por el físico polaco Jerzy Nomarski en 1952.
Produce imágenes con un efecto de relieve 3D, sin halos de difracción.
Basado en el principio de la interferencia.
- Convierte diferencias de fase en cambios de intensidad.
- El microscopio bifurca cada rayo lumínico del condensador en dos rayos.
- Los dos rayos van con direcciones ligeramente diferentes.
- Cada rayo atraviesa la muestra por puntos muy próximos pero ligeramente
separados.
- Dependiendo de que haya o no diferencias entre los dos puntos se produce o
no desfase.
- Después de atravesar el objeto los haces son recombinados.
- Las diferencias de fase se convierten en diferencias de amplitud.
El sistema emplea luz polarizada.
- Tras la fuente de iluminación hay un filtro de polarización que produce luz que
vibra en sólo en un plano.
El haz de luz polarizada pasa por un prisma de Wollaston modificado.
- Divide el rayo incidente en dos rayos.
- Los dos rayos presentan planos de polarización perpendiculares.
- No pueden hacer interferencia entre sí.
Los dos rayos van al condensador.
- Del condensador salen paralelos, separados por una distancia próxima al límite
de resolución.
- La distancia entre los rayos varía para cada objetivo, límite 0,2 μm.
Cada rayo atraviesa la muestra por puntos separados, aunque muy próximos.
- Cada rayo es refractado dependiendo del índice de refracción y grosor de la
muestra en el punto por el que pasa.
- Si la muestra es igual en los dos puntos, los dos rayos se desvían del mismo
modo. No se desfasan.
 - Si la muestra diferente en las dos puntos, los rayos se desvían de distinta
forma. Se desfasan.
Los rayos salen de la muestra, pasan por el objetivo y llegan al prisma combinador de
haces de Wollaston.
Prisma combinador de haces de Wollaston.
- Hace confluir los dos rayos y los recombina para generar un único rayo
polarizado.
- El plano de polarización del rayo final depende de la existencia o no de
desfase entre los dos rayos.
Si no hay desfase, se recupera el plano de polarización inicial previo al paso por
el condensador.
Si hay desfase, el rayo final tiene un plano de polarización diferente.
El rayo resultante del prisma combinador es dirigido a un segundo polarizador, el
analizador
- Plano de polarización perpendicular al del polarizador del condensador.
- Los rayos que tienen el plano original, procedentes de rayos en fase, se anulan.
Fondo oscuro.
- Los rayos con plano de polarización distinto, procedentes de rayos desfasados,
se mantienen. Zonas claras.

Bioquímica

1. Papel del agua en los procesos biológicos

 El agua como elemento que define las características vitales

El agua es el fluido más abundante de la Tierra y está mayoritariamente en estado
líquido en el rango terrestre de temperaturas.
Para que las reacciones vitales y las actividades celulares puedan desarrollarse es
necesario un entorno fluido que permita movilidad molecular y celular. El agua es
perfecta para esta finalidad: por ello la vida se inició en un entorno acuoso.
Es la sustancia más abundante de los seres vivos, constituyendo el 70% o más de su
peso, y condiciona los procesos vitales:
- Proporciona el entorno fluido en el que las moléculas de las reacciones y rutas
metabólicas vitales puedan moverse y encontrarse para reaccionar
- El reconocimiento a través de interacciones entre biomoléculas, necesario para
que reaccionen, está influido por las propiedades disolventes y el pH del agua,
que determinan su solubilidad, cargas, estructura.
- Muchas propiedades y funciones biológicas de las biomoléculas y las estructuras
celulares provienen de sus interacciones químicas con las moléculas de agua, y
de la formación de enlaces no covalentes en entorno acuoso.
 - Por su alto calor específico, el agua actúa como tampón térmico, y además
protege de las radiaciones ultravioleta del Sol.

 Estructura de la molécula de H2O

En un átomo de O hay cuatro pares de e- en cuatro orbitales sp3.
En el agua, el átomo central de O une covalentemente dos átomos de H
compartiendo dos de estos pares.
La molécula de agua adquiere una geometría de tetraedro distorsionado, con un
átomo de H en dos vértices y pares de e- sin compartir en los otros dos.
La electronegatividad del átomo de O hace que éste atraiga los e- compartidos en los
enlaces covalentes más que los átomos de H, lo que induce que en cada molécula de
agua haya un momento dipolar neto, es decir, una separación de cargas positiva y
negativa entre los átomos de H y el de O.

 Puentes de Hidrógeno
Por su distribución electrónica, en las moléculas de agua el átomo de O tiene carga
parcial negativa y los átomos de H cargas parciales positivas, por lo que se genera
un momento dipolar.
Debido a ello, entre esas moléculas se forman puentes o enlaces de H, que son
atracciones electrostáticas entre las cargas de sus dipolos.
Cada molécula de agua puede formar hasta 4 puentes de H con otras, actuando en
dos de ellos como donadora (carga +) y en otros dos como aceptora (carga -), por lo
que se forman agrupaciones reticulares de múltiples moléculas.
Los enlaces de H en el agua son cooperativos: su fortaleza es mayor cuantos más
haya. En el agua líquida se hacen y deshacen continuamente formando redes
dinámicas, con un promedio de 3,4 puentes de H por molécula.
En el hielo se forman 4 puentes de H por molécula, dando redes estáticas y
estructuras sólidas con un volumen mayor para una misma masa de agua, lo que
hace que tenga menor densidad que el agua líquida y flote en ella.
La formación de puentes de H condiciona las propiedades químico-físicas y la
reactividad del agua.
 Propiedades físico-químicas del agua
Al compararla con compuestos similares, presenta propiedades poco corrientes
debido a la formación de puentes de H, que atraen a las moléculas entre sí
Tiene puntos de fusión y ebullición muy elevados, por lo que mayoritariamente está
en estado líquido a la temperatura de la superficie terrestre.
La mayoría de los compuestos de peso molecular similar son gases a temperatura
ambiente.
Además, las propiedades coligativas del agua como disolvente (como el descenso
crioscópico o la presión osmótica), que dependen de la concentración del soluto,
tienen valores mucho mayores que los de otros solventes. Ello se debe a su gran
entropía y a la formación de puentes de H con otras moléculas de agua.
También tiene un valor de tensión superficial muy superior a los de otros líquidos
comparables, como metanol, etanol, éter o acetona.
Su alto calor específico es muy útil en el contexto vital, ya que permite que actúe
como tampón térmico.

 El agua como solvente.

Las características del agua como solvente universal en los medios intra y
extracelulares están definidas por su carácter dipolar y por su tendencia a formar
puentes de H.
Por la naturaleza dipolar de su molécula, es un buen solvente para sustancias
cargadas como los iones de las sales en disolución, con los que interaccionan sus
cargas.
También disuelve muy bien gran variedad de moléculas orgánicas no iónicas pero
polares (hidrofílicas), con las que forma enlaces de H, incluyendo alcoholes,
aminas, ácidos, aminoácidos, péptidos, carbohidratos, sulfhidrilos, ésteres, cetonas o
fenoles, y proteínas con grupos polares en su superficie. En esos casos, el agua
forma capas de hidratación, ordenando las cargas de su dipolo hacia las cargas o
dipolos del soluto.
 Como no pueden formar interacciones de carga ni puentes de H con el agua, ésta es
un mal solvente para sustancias apolares o hidrofóbicas (con carácter aromático o
alifático).
Por la misma razón, es un mal solvente para grupos de carácter apolar que formen
parte de moléculas anfipáticas, como los de los fosfolípidos que forman las
membranas celulares o aminoácidos con el doble carácter.
También es un mal solvente para gases no polares, como el N2, el O2 y el CO2.
Por ello es necesario que los dos últimos gases, esenciales en el metabolismo,
utilicen sistemas de transporte desde o hasta el entorno exterior en organismos
multicelulares, en los que las células están alejadas de ese entorno.

 Interacciones débiles entre biomoléculas en un entorno acuoso.

Las interacciones no covalentes o débiles son aquellas que se realizan entre átomos
o moléculas sin compartir electrones.
En los seres vivos, son importantes en muchos aspectos gracias a su efecto
acumulativo y cooperativo, de forma que son cruciales para la estructura y
función de las macromoléculas (DNA, proteínas...), y el autoensamblaje de las
estructuras celulares (membranas, ribosomas)
- Interacciones electrostáticas o iónicas: entre iones o grupos cargados, o entre
ellos y dipolos permanentes. Pueden ser de atracción o de repulsión.
- Enlaces o puentes de H: tienen un 90% de carácter electrostático y un 10% de
enlace covalente.
- Interacciones hidrofóbicas: es un fenómeno complejo debido a la asociación de
sustancias no polares en medio acuoso y el ordenamiento de las moléculas de
agua en torno a ellas. Debidas a la elevada entropía del agua.
- Interacciones de Van der Waals: se dan entre átomos muy próximos

 Puentes de H en biomoléculas.
No sólo se dan en el agua. Son atracciones electrostáticas que se producen por la
interacción entre un grupo donador, formado por un átomo de H unido
covalentemente con O o con N, y un grupo aceptor formado por O o N con un par
de e- libres.
 Las biomoléculas con grupos cargados y no cargados polares se disuelven bien en
agua porque forman puentes de H con las moléculas de agua y ello tiene un efecto
estabilizador.
Los puentes de H también son muy importantes para la estructura de las
macromoléculas

Los enlaces de H son direccionales: la posición de la interacción afecta a su

fortaleza (en las hélices α de las proteínas)

 Moléculas hidrófobas y el efecto hidrofóbico.

Las sustancias hidrofóbicas no pueden formar puentes de H con el agua, por lo
que tienen una solubilidad muy pobre. Alrededor de ellas no se forman capas de
hidratación sino una estructura ordenada de moléculas de agua asociadas entre sí,
llamada jaula de clatrato.

La formación de ésta implica un gran nivel de ordenación de las moléculas de

agua y una disminución de su entropía, lo que es termodinámicamente
desfavorable.
Por ello las sustancias apolares tienden a formar agregados, para que disminuya la
cantidad de moléculas de agua ordenadas, aumente la entropía y el conjunto sea
más estable.
 El efecto hidrofóbico se refiere a esta tendencia a asociarse de las moléculas o
sustancias apolares en solución acuosa para evitar el contacto con el agua. Así,
este efecto no se genera a partir de una fuerza de atracción directa entre las
moléculas apolares, sino de su agrupación espontánea para obtener una mayor
estabilidad termodinámica al minimizar su contacto con el agua.
Este efecto también provoca la asociación de zonas apolares entre biomoléculas o
dentro de ellas, y es uno de los factores principales que interviene en el
plegamiento tridimensional de las proteínas, las uniones entre ellas, la formación de
membranas, o la unión de hormonas esteroides a sus receptores.

 Las moléculas anfipáticas y el agua.

Las moléculas anfipáticas son aquellas que tienen partes polares y apolares,
desarrollando propiedades hidrofílicas e hidrofóbicas al mismo tiempo, como los
ácidos grasos, detergentes, fosfolípidos y otras.
Al disolverlas en agua, las cabezas polares interaccionan con ésta y las colas
hidrofóbicas interaccionan entre sí mediante interacciones hidrofóbicas y de Van
der Waals.

Cuando se disuelven sustancias anfipáticas en agua, tienden a asociarse y son

capaces de formar diversas estructuras:
- Monocapas: en la superficie del agua con la cabeza polar sumergida.
- Micelas: estructuras esféricas de una única capa de moléculas, con las cabezas
polares hacia el agua.
- Bicapas: capas dobles con las cabezas polares hacia ambos lados.

 El agua se une a proteínas.

Como sucede en muchas otras proteínas, las moléculas de agua se unen fuertemente
a la superficie de la hemoglobina mediante puentes de H e interacciones
electrostáticas.
Cuando se disuelven en agua moléculas como las proteínas, que tienen enlaces de
H entre sus propios grupos, algunos de ellos se rompen y se forman nuevos
enlaces de H con el agua, mientras que otros se mantienen por no tener el agua
acceso a ellos
Cadena de agua en el interior de la citocromo c oxidasa
En un canal de H+ de esta proteína de membrana (parte de la cadena de transporte
electrónico mitocondrial) hay cinco moléculas de agua unidas por puentes de H
entre ellas y a grupos funcionales de la proteína Un grupo hemo permite el
transporte de e- impulsados por su potencial de reducción, que a su vez impulsa el
flujo de H+ a través de la membrana, probablemente mediante un “salto de
protones” a través de esta cadena de agua.

 Interacciones débiles y estructura de las proteínas.

Tanto los puentes de H como las interacciones hidrofóbicas y el resto de las
interacciones débiles intervienen en la adopción de la estructura terciaria de las
 proteínas y en las asociaciones entre proteínas. Aunque sean débiles, la
multiplicidad de estas interacciones hace que su efecto acumulativo sea muy eficaz,
y de hecho son los determinantes principales de las características estructurales de
las proteínas
*La mayoría de los aminoácidos apolares se disponen en el interior de las proteínas
formando un núcleo hidrofóbico, mientras que los polares están hacia el exterior
El medio acuoso determina otros aspectos esenciales de la funcionalidad molecular
y celular, como las interacciones enzima-sustrato y la estabilidad osmótica. Una de
las propiedades coligativas es la presión osmótica. Las moléculas de agua tienden a
trasladarse desde una región de mayor concentración de agua a otra de menor.

2. Equilibrios iónicos

 Ionización o disociación del agua.

Los enlaces O-H son polares, por lo que el agua tiene una ligera tendencia a
ionizarse, dando un ión hidroxilo (OH-) y un protón (H+). El proceso es rápido y
reversible, y depende de la temperatura:

El equilibrio está muy desplazado hacia la izquierda y la mayoría de las moléculas

permanece sin ionizar, por lo que el agua pura tiene una conductividad eléctrica muy
baja.
Los H+ son rápidamente hidratados. Así, una molécula de agua cede un H+ a otra
para dar un ión hidronio (H3O+) y un ión OH-, de modo que el agua actúa a la vez
como donador y aceptor de H+

Este proceso se favorece porque los enlaces de hidrógeno y covalente del agua son
fácilmente intercambiables.

Esta cualidad permite una gran movilidad de los H+, vía salto de protones entre
un H3O+ y moléculas de agua unidas por puentes de H, que transcurren en
picosegundos.
 ¿Qué es el pH?
El pH representa la concentración molar de H+ de una disolución acuosa en escala
logarítmica, y se define como el valor negativo del logaritmo decimal de la [H+]:
pH = - log [H+]
De manera similar se define el pOH: pOH = - log [OH-]
Según el valor determinado experimentalmente de la Keq para la ionización del agua:
Keq = [H+] [OH-] / [H2O] = 1,8 · 10-16 M
y como el valor del agua [H2O] = (1000 g / 18 g/mol) / 1 litro = 55,5 M
el producto iónico del agua Kw = Keq · [H2O] = 1 · 10-14 M2 = [H+] [OH-]
y por tanto, - log [H+] - log [OH-] = 14 pH + pOH = 14
En el agua pura, cada molécula de H2O que se disocia provoca la aparición de un H+ y
de un OH-, por lo que [H+] = [OH-] = 10-7 M, y hay pH = 7, que es el valor de pH
neutro.
Cuanto mayor sea la [H+] menor será el pH y la disolución será más ácida Las
soluciones ácidas tienen pH < 7, y las básicas pH > 7. Las neutras, pH = 7
Una diferencia de 1 unidad de pH supone una de 10 veces en [H+]
El pH puede ser negativo (p.e., [H+] = 6 M, pH = - 0,78). Esas condiciones no suelen
darse en los seres vivos

 Las biomoléculas tienen ácidos y bases débiles

Muchos de los compuestos biológicamente importantes son o contienen ácidos o bases
débiles, que se disocian más o menos en función de su pKa y el pH al que estén.
Por ejemplo, las proteínas tienen muchos grupos ácidos y básicos ionizables en los
grupos R de sus residuos aminoacídicos, además de los grupos amino y carboxilo
terminales. Esos grupos ionizables están ubicados tanto en la superficie como en el
interior molecular y pueden tener gran importancia estructural y funcional.
El comportamiento de muchas biomoléculas en los procesos bioquímicos depende de la
presencia o no de cargas en ellas en función de su estado de ionización, que se debe a
su comportamiento ácido-base
Ácidos: donadores de H+ Bases: aceptores de H+
Un donador de protón y su correspondiente aceptor forman un par ácido-base
conjugado (HAc / Ac-)

La disociación de un ácido tiene como resultado la hidratación del H+, que favorece
energéticamente el proceso, mientras que a esa disociación se opone la atracción
electrostática entre el H+ y la base conjugada cargada negativamente.
Un ácido (o una base) fuerte es el que se disocia (casi) totalmente: HCl → H+ + Cl
 Equilibrios de ácidos y bases débiles: Ka y pKa
La constante de equilibrio de la disociación de un ácido o base débil, o constante de
disociación Ka, es característica de cada uno y se define como:
HA ↔ A- + H+ Ka= [H+]·[A- ] / [HA] Cuando [A- ] = [AH] -> Ka =
[H+]
Cuanto mayor sea Ka mayor es la tendencia del ácido a disociarse (es más fuerte) De
forma similar al pH, en la disociación de ácidos y bases se trabaja con el pKa, que es el
pH al que [A-] = [AH]: pKa = - log Ka

pKa pequeño: ácido fuerte pKa grande: ácido débil

 Importancia del control del pH en la vida
El pH afecta a varios procesos esenciales en la vida:

- La solubilidad de las moléculas polares en agua depende de sus cargas y de la

formación de enlaces de H, y por tanto de su estado de ionización, y éste de su
pKa y del pH
- El equilibrio entre el CO2 gaseoso y el HCO3 - disuelto, que permite la
excreción del primero, depende del pH
- Muchos enzimas que catalizan las reacciones vitales tienen un pH óptimo de
actuación
Por ello, la mayoría de los líquidos corporales tienen un pH controlado entre 6,5 y
8,0, que es el llamado rango de pH fisiológico, aunque hay excepciones.
Los procesos bioquímicos dependen de la funcionalidad de los enzimas y otras
proteínas. Los cambios en la carga de sus grupos ionizables en respuesta a cambios de
pH suelen ser importantes para su función, especialmente en las enzimas. La actividad
de éstas suele ser muy sensible a los cambios de pH y tener un máximo a su pH óptimo,
disminuyendo por encima y por debajo. El pH óptimo suele ser el del ambiente
fisiológico en el que actúan.
Por ello, muchos procesos vitales son muy sensibles a los cambios de pH, y el control
del pH de las células y de los fluidos corporales resulta esencial para los seres vivos.
 Disoluciones reguladoras o tampón
El pH se controla mediante el uso de soluciones tampón o reguladoras, formadas por
un ácido débil y su base conjugada, que reaccionan ante la adición de base o de ácido.
En un tampón, la ecuación de Henderson-Hasselbalch relaciona el pH, el pKa y las
concentraciones de ácido y de base conjugada:

Esta ecuación se ajusta a la curva de titulación de todos los ácidos débiles.

En el punto medio de la titulación, las concentraciones de base conjugada y ácido son
iguales, y el pH es igual al pKa.
La capacidad de tamponamiento es máxima en el pKa y se pierde si el pH difiere en
más de 1 unidad de pH. Es decir, la zona tamponante incluye desde aprox. un ratio
base/ácido 1/10 hasta un 10/1.
 Valores de pKa de ácidos débiles biológicos
Hay pocos ácidos débiles con presencia biológica relevante que sean capaces de
tamponar en el rango de pH fisiológico entre 6,5 y 8,0.
Como la histidina y la cisteína como aminoácidos libres son muy poco abundantes, sólo
el sistema CO2 / ácido carbónico / bicarbonato y el dihidrógeno fosfato son
utilizables para tamponar de forma efectiva en ese rango.

 Sistemas de tampones biológicos

De entre los ácidos débiles con presencia biológica relevante (láctico, acético amonio...)
hay pocos cuyo pKa les permita tamponar en el rango de pH fisiológico. Los sistemas
tamponantes más importantes de los seres vivos son:

- Bicarbonato, importante en el plasma sanguíneo. Este sistema usa el CO2, del

que hay una producción inagotable, y además permite su excreción en los
pulmones a través de la sangre. Así, se puede eliminar y obtener fácilmente. En
conjunto actúa con un pKa cercano a 7,4
- Proteínas, con múltiples grupos ionizables de los aminoácidos con valores de
pKa variados, capaces de aceptar o ceder H+. Gracias a su abundancia en las
células y líquidos corporales, su capacidad de tamponamiento es muy fuerte
- Fosfato (dihidrógeno), con concentración intracelular en el rango mM, por su
presencia libre o formando parte de muchos metabolitos. Tiene un pKa = 6,86

 Tampones sintéticos usados en Bioquímica

También MOPS (pKa = 7,2), MES (pKa = 6,15), PIPES (pKa = 6,76)

3. Introducción: Purificación de proteínas.

 - Para poder entender los procesos bioquímicos que tienen lugar en los seres vivos,
es preciso identificar las biomoléculas que participan en ellos, aislarlas y
estudiar sus estructuras, propiedades y funciones. Esto no es fácil porque incluso
las células más simples son estructuras muy complejas constituidas por miles de
compuestos de distintas clases, de las cuales las más interesantes en Bioquímica
y Biología Molecular son las proteínas y los ácidos nucleicos.
- Hay dos tipos generales de técnicas de separación de moléculas en una mezcla:
las analíticas, que permiten el análisis de una o más moléculas de interés en la
mezcla (como las electroforesis), y las preparativas, cuyo objetivo es la
purificación de una de esas moléculas en cantidad suficiente para llevar a cabo su
caracterización estructural y funcional (como muchas cromatografías)
- La información contenida en los ácidos nucleicos tiene mucha relevancia por ser
el material hereditario y codificar las proteínas. No obstante, sus características
químicas son muy homogéneas y sus métodos de obtención similares y simples,
como veremos al final del tema. Además, usando las bases de datos de
secuenciación masiva y las técnicas de PCR (reacción en cadena de la
polimerasa) y transcripción in vitro, es fácil sintetizar un DNA o un RNA con la
secuencia que se desee.
- Las biomoléculas más interesantes a nivel bioquímico, por su variedad
estructural y funcional, son las proteínas. En la mayor parte de los casos, las
proteínas de una célula o un tejido están mezcladas con muchas otras, tanto si
están dentro como fuera de las células. Así, para estudiar una proteína primero
hay que purificarla, separándola de entre los cientos o miles con las que está, y
luego aplicar técnicas que permitan determinar su estructura y función
Introducción Proceso de purificación de proteínas
 Proceso de purificación de proteínas
El proceso general para purificar una proteína de interés consiste en:
1) Seleccionar la fuente de material de partida más adecuada. En general se busca
una que contenga altos niveles de la proteína de interés, que ésta esté lo menos
mezclada posible con otras, y que sea de fácil obtención.
2) Recoger y preparar el material, habitualmente rompiendo tejidos y células para
liberar su contenido y obtener así un homogeneizado o extracto tisular o celular
3) Realizar procesos sucesivos de purificación hasta obtener la proteína deseada
con alto grado de pureza. Lo habitual es usar de modo secuencial diferentes
técnicas preparativas, de forma que aquellas proteínas que copurifiquen con ella
por uno de los métodos no lo hagan usando otros.
4) Realizar ensayos analíticos para monitorizar el avance del proceso de
purificación: en cada paso debe ir aumentando la proporción de la proteína de
interés respecto a las proteínas totales de la preparación.
Respecto al punto 4), para poder determinar el grado de purificación de una
proteína los análisis se llevan a cabo usando sistemas de detección y medida, tanto
 de la proteína de interés como del total de proteínas de la mezcla en la que está, de
manera que ambos niveles se puedan cuantificar.
A continuación, veremos los sistemas de detección y ensayos analíticos más
habituales para monitorizar el proceso de purificación de una proteína, y un
resumen de uno de estos procesos de purificación (hipotético).

 Sistemas de detección de proteínas.

Detección de proteínas específicas
- Ensayo enzimático, si es un enzima
- Medida de unión de un ligando, si tiene
- Medida de un grupo prostético, si tiene
- Inmunodetección: ELISA, Western...

Detección general de proteínas

- Absorbancia a 280 nm
- Detección con colorantes en solución: métodos de Lowry, Bradford o BCA
- Análisis en geles: tinciones con Azul de Coomassie, plata, fluorescentes

 Protocolo y resultados de la purificación de una proteína ficticia

Tras cada paso de purificación se utilizan sistemas de detección adecuados para
medir los niveles de proteína total y de la proteína de interés y cuantificar el nivel de
purificación obtenido.
Actividad total, actividad específica y purificación:
Ambos vasos tienen la misma actividad total: cinco bolas rojas (o proteínas de
interés). Sin embargo, el de la derecha tiene mayor actividad específica de bolas rojas,
porque tiene muchas menos bolas (o proteínas) totales: las bolas rojas están más
purificadas.

 Métodos de separación de proteínas según sus propiedades

Las técnicas de separación de proteínas, o de cualquier otra molécula biológica, para
su análisis o su purificación, se basan en sus diferencias en cuanto a:
a) Tamaño y forma: centrifugación y ultracentrifugación // diálisis y
ultrafiltración // electroforesis desnaturalizante en SDS // cromatografía de
exclusión molecular
 b) Solubilidad: precipitación por sal o por temperatura // precipitación isoeléctrica
c) Carga eléctrica: cromatografía de intercambio iónico // electroforesis en
condiciones nativas // isoelectroenfoque
d) Especificidad de unión: cromatografía de afinidad
e) Polaridad: cromatografía de interacción hidrofóbica // cromatografía en fase
inversa o reversa // cromatografía de adsorción.

4. Técnicas preparativas:
CENTRIFUGACIÓN
Los métodos de centrifugación o ultracentrifugación tienen muchas aplicaciones, que
van desde la recogida de materiales en suspensión como primer paso de una
purificación hasta algunos análisis de tamaño, forma o interacciones moleculares.
Al girar un rotor se crea un campo centrífugo con una aceleración gravitacional g =
ω2 r Cualquier partícula o molécula sometida a él está sujeta a una fuerza centrífuga
Fc:
Fc = m g (1 - ρ/ρp)
Fc = m ω2 r (1 - ρ/ρp) Si ρp > ρ ; Fc es positivo, la partícula sedimentará
Si ρp = ρ; Fc = 0, la partícula no se moverá
Si ρp < ρ ; Fc es negativo, la partícula flotará
Sometida al campo centrífugo, la partícula o molécula se desplazará por el medio con
una velocidad de sedimentación: v = Fc / f = m g (1 - ρ/ρp) / f
f: coeficiente de fricción, relacionado con la forma y el tamaño de la partícula.

 Coeficiente de sedimentación:
El coeficiente de sedimentación s de una partícula o molécula es su velocidad de
sedimentación por unidad de campo centrífugo s = v / g s = m (1 - ρ/ρp) / f
Depende de la masa, la densidad y la forma, que se relaciona con el coeficiente de
fricción f. En general, a mayor masa y mayor densidad, mayor s, pero la forma y
estructura condicionan mucho su valor.
Es característico de cada molécula o partícula, e independiente del campo centrífugo
aplicado: a mayor valor de s, la molécula se moverá más rápidamente en cualquier
campo centrífugo que se le aplique
Se mide en Svedberg: 1 S = 10-13 seg

 Tipos de centrífugas
Centrífugas preparativas
Ultracentrífugas: Preparativas // Analíticas
Microcentrífugas
Airfuge
 Según las características de las moléculas o partículas que queramos separar o
recoger, usaremos una fuerza centrífuga Fc mayor o menor
Fc = m ω2 r (1 - ρ/ρp)
Los dos términos con los que se puede condicionar Fc por parte de la centrífuga son
el radio r y la velocidad de giro ω
Para ello existen rotores intercambiables de tamaños y radios distintos, a los que se
aplican velocidades de giro mayores o menores
Fc = m g (1 - ρ/ρp)
Según las características de las moléculas o partículas que queramos separar o
recoger, aplicaremos una aceleración mayor o menor, que producirá una Fc mayor
o menor.
La fuerza centrífuga relativa o rcf se expresa en x g, es decir, veces la aceleración
de gravedad. Como g = ω2 r, para obtener la rcf adecuada se usan rotores de
distintos radios y capacidades, a los que se aplican velocidades de giro (en
revoluciones por minuto, rpm) mayores o menores

 Rotores
Suelen ser de aleaciones de titanio o de aluminio. Cada centrífuga puede usar uno o
más. Con ellos no se puede sobrepasar el límite establecido de velocidad (rpm)
Hay que mantenerlos bien limpios, para evitar contaminaciones y corrosión, y es
esencial cargarlos de forma equilibrada
a) Flotantes: al girar el rotor, los tubos basculan, dando radios de giro muy
diferentes entre ambos extremos. Permiten una cantidad de muestra reducida
b) Angulares: los tubos están en posiciones angulares fijas dentro del cuerpo del
rotor. Permiten un mayor volumen de muestra
c) Verticales: tubos fijos en vertical, y campo centrífugo es más uniforme. Permiten
una rápida sedimentación de la muestra
d) Zonales: todo el interior del rotor está hueco para permitir un mayor volumen de
muestra. La carga y recogida del material puede ser con el rotor en movimiento
(dinámicos) o con el rotor parado (estáticos)
Para evitar accidentes, los rotores deben ser mantenidos limpios de agentes
corrosivos, y sobre todo, cargarse siempre de forma equilibrada, con tubos del
mismo peso en las posiciones enfrentadas

 Modos de centrifugación
Hay dos tipos de centrifugación, dependiendo del objetivo de la separación y la
cantidad de muestra a procesar:
- Analítica: se usa con muestras pequeñas para evaluar el grado de pureza de una
preparación o bien para estudiar parámetros de una molécula ya purificada,
como su coef. de sedimentación, asociaciones con otras moléculas o cambios
estructurales en distintas condiciones químicas. Se realiza en una
ultracentrífuga analítica, que tiene un sistema óptico incorporado que realiza
las medidas durante la centrifugación.
 - Preparativa: sirve para separar y recoger parte o todos los componentes de una
mezcla de interés. Es la más frecuente en laboratorios de Bioquímica. Existen
tres modalidades de centrifugación preparativa: -
diferencial: la mezcla se centrifuga y se separan dos componentes
heterogéneos: un precipitado o sedimento con las partículas de mayor tamaño
y coeficiente de sedimentación, y un sobrenadante con las de menor
zonal: la mezcla se aplica en la zona superior de un tubo con una solución más
densa, que puede ser homogénea o tener un gradiente de densidad. La
centrifugación separa los distintos componentes en bandas a lo largo del tubo
según sus coeficientes de sedimentación
isopícnica: la muestra se pone en un medio adecuado (como CsCl), que al ser
centrifugado se va concentrando hacia el fondo, generando un gradiente de
densidad y permitiendo la separación de los distintos componentes según su
densidad

Diferencial =>

Zonal =>

Isopícnica =>

 Centrifugación diferencial
En esta técnica, la muestra ocupa la totalidad del tubo. Al aplicar el campo centrífugo,
los componentes con mayor coeficiente de sedimentación avanzarán a mayor
velocidad hasta el fondo del tubo
Tras la centrifugación se separan dos fracciones:

- Precipitado o sedimento (P): componentes que han alcanzado el fondo y

formado una masa compacta
- Sobrenadante (SN): componentes que permanecen en disolución o suspensión

Tanto los sedimentos como los sobrenadantes suelen estar formados por partículas de
distinto coeficiente de sedimentación y no son homogéneos, aunque los sobrenadantes
pueden llegar a serlo si se centrifuga el tiempo suficiente
Se suele realizar en rotores angulares o verticales, porque permiten procesar mayor
volumen de muestra y la sedimentación se consigue en un tiempo menor
Habitualmente, en los procesos de centrifugación diferencial se aplican a una
mezcla etapas sucesivas de centrifugación con campos centrífugos y períodos de
tiempo crecientes, con objeto de separar sus componentes en fracciones
Homogeneización y fraccionamiento celular por centrifugación diferencial
Las células o tejidos se rompen y el homogeneizado celular se somete a
centrifugación a baja velocidad y durante un tiempo corto.
Se obtiene un precipitado con la llamada fracción nuclear y un sobrenadante, que se
puede volver a centrifugar.
Centrifugando los sobrenadantes de pasos sucesivos cada vez a mayor velocidad y
tiempo, se van obteniendo precipitados con las distintas fracciones subcelulares.
Para purificar una proteína se suele partir de una u otra de estas fracciones,
dependiendo de su localización subcelular.

 Centrifugación zonal
Los componentes de una mezcla compleja se pueden separar completamente en un
único paso: la mezcla se aplica en una zona situada en la parte superior del tubo, y los
componentes se separan en bandas según sus coeficientes de sedimentación
Este sistema solo es capaz de separar bien componentes cuyos coef. de sedimentación
difieran por un factor ≥ 2.
Para evitar la sedimentación y mezcla sobre las paredes del tubo se usan rotores
flotantes o bien zonales, por lo que esta técnica suele permitir poco volumen de
muestra.
Para que no haya mezcla por difusión y convección de la muestra con el medio sobre
el que se deposita, éste debe tener mayor densidad (se llama colchón). Si la densidad
de algún componente de la mezcla es menor que la del colchón, no entrará y flotará
sobre él.
El tiempo de centrifugación es esencial. Si es muy largo, todas las partículas acaban
sedimentando
En la centrifugación zonal en gradiente de densidad el medio o colchón de
separación tiene una densidad creciente desde la boca al fondo del tubo, cuya misión
principal es favorecer más la separación disminuyendo las corrientes de convección.
Para formar los gradientes de densidad se usan sales de metales alcalinos (CsCl,
LiBr), hidratos de carbono (sacarosa, glucógeno, glicerol, dextranos, Ficoll), coloides
de sílice (Percoll), y otros. Se escoge uno u otro según las particularidades del proceso.

 Gradientes de densidad
Discontinuos
Depósito escalonado de soluciones de distinta densidad.
Mediante centrifugación zonal, permiten separar y concentrar en las interfases de los
escalones fracciones subcelulares de densidad conocida, que no pueden entrar en el
escalón siguiente
Continuos

- Preformados
Se usan para separar, mediante c. zonal, los componentes de una mezcla en
base a diferencias en sus coef. de sedimentación.
Los más utilizados son gradientes con aumento lineal de la densidad, pero
también pueden ser con aumento en curva. Se generan con un gradientador y
soluciones de baja y alta densidad
- Autogenerados: centrifugación isopícnica (de igual densidad)
Los gradientes se generan durante la centrifugación. Sólo algunos
compuestos, que se concentran por centrifugación (como el CsCl), permiten
generarlos.
En este caso, lo determinante para la separación de los componentes de la
mezcla son sus diferencias de densidad: cada uno se enfoca en una banda en la
zona del gradiente que tenga su densidad.
La separación es independiente del tiempo y permite aplicación de la muestra
de forma zonal o en todo el tubo: cada componente acabará en la zona de su
densidad.

- Precipitación o fraccionamiento con sal

Es un sistema de purificación de proteínas sencillo y barato. Como sal se suele usar
sulfato amónico.
 En general la solubilidad de las proteínas aumenta con la [sal] hasta alcanzar un
máximo, y a partir de ahí disminuye al seguir aumentando la [sal], de forma que
precipita en mayor o menor medida.
La [sal] a la que precipita una proteína depende de sus propias características. P.e.,
en el suero, el fibrinógeno precipita a 0,8 M de sulfato amónico y la albúmina a 2,4
M. Por tanto, se pueden precipitar de forma diferencial las proteínas de una
mezcla sometiendo ésta a [sal] adecuadas.
La precipitación en sulfato amónico es un método manejable y barato, muy
adecuado para los primeros pasos de una purificación. También se puede usar para
concentrar disoluciones diluidas de proteína.
Para precipitar proteínas o ácidos nucleicos también se pueden usar solventes
orgánicos (etanol o acetona) o polímeros orgánicos (polietilenglicol, glucógeno)

Tanto en la precipitación con sal como en otras técnicas, la proteína se obtiene en

una solución con alta concentración salina. Una vez precipitada la proteína, para
eliminar la sal de la preparación se utiliza la diálisis en una bolsa formada por una
membrana semipermeable, que permite el paso y difusión en un volumen grande
de los iones salinos, pero que mantiene en su interior las moléculas de proteína
También se puede usar una cromatografía de exclusión molecular, que separa por
tamaños las moléculas de proteína y los iones salinos.
 Métodos más usados en la separación y purificación de proteínas
Los métodos más usados en los laboratorios de Bioquímica para separar entre sí las
proteínas de una mezcla son los cromatográficos y los electroforéticos. En general
los primeros suelen tener objetivos preparativos y los segundos objetivos
analíticos, aunque no es así en todos los casos.
La separación de proteínas se puede conseguir gracias a sus diferencias en:
- Carga y relación carga/masa (A)
- Tamaño, forma y diámetro hidrodinámico (B)
- Especificidad de unión: llave-cerradura (C)
- Polaridad: hidrofílicas o hidrofóbicas (D)
Los tipos de cromatografía más usados son:
- De intercambio iónico (A)
- De exclusión molecular (B)
- De afinidad (C)
- De interacción hidrofóbica (D)
- De fase reversa (D)
Los tipos de electroforesis más usados son:
- En condiciones nativas: PAGE (A, B)
- En condiciones desnaturalizantes: SDS-PAGE (B)
- Isoelectroenfoque analítico y preparativo (A)
- Bidimensional: 2D-PAGE (A + B)

 Cromatografía
 Es el proceso durante el cual los componentes o solutos de una mezcla, disueltos en
una fase móvil, se van separando entre sí a medida que se desplazan con diferente
velocidad a través de un lecho fijo o fase estacionaria en una dirección definida.
Hay cromatografía plana y en columna, que a su vez puede ser cr. líquida o cr.
gaseosa.
Para la purificación de proteínas se suele usar cromatografía líquida (es decir, con
fase móvil líquida), bien con fase estacionaria sólida o con fase estacionaria
líquida. La matriz es el soporte sólido inerte que constituye o que fija la fase
estacionaria.

 Cromatografía de intercambio iónico (aniónico o catiónico)

Permite separar proteínas en base a sus diferencias en carga.
La fase estacionaria es sólida: es una matriz inerte que tiene unidos grupos con
carga positiva (i. aniónico) o negativa (i. catiónico)
La elución de las proteínas unidas se hace por competencia de cargas con
gradiente de [sal]: las proteínas que se unen más fuertemente necesitan que se
alcancen concentraciones más altas para ser liberadas.

- Flujos altos: corta duración

- Permite altos volúmenes de muestra
- Alta resolución
- Hay intercambiadores aniónicos y catiónicos
- Hay intercambiadores débiles y fuertes, según su carga varíe más o menos al
cambiar el pH

 Cromatografía de exclusión molecular

Permite separar proteínas en base a sus diferencias en tamaño y forma. También
se llama de filtración en gel.
La matriz cromatográfica está formada por estructuras esféricas huecas, que están
embebidas de la fase móvil.
La fase estacionaria es de carácter líquido, y está formada por esa fase móvil
atrapada en las estructuras de la matriz

- Distintas matrices permiten separar en distintos rangos de tamaño

- Flujos bajos (larga duración), poco volumen de muestra y baja resolución
- Condiciones suaves: purificación de grandes complejos
 Cromatografía de afinidad
Separa proteínas en base al desarrollo de interacciones tridimensionales tipo llave-
cerradura, típicas de biomoléculas
La fase estacionaria es una matriz sólida inerte con un ligando al que se une la
proteína de interés. Posteriormente la proteína es eluída con una solución de ligando
libre.
Tipos de ligandos:
Sustratos o inhibidores enzimáticos
Oligonucleótidos, para proteínas que unen DNA o RNA
Anticuerpos
Proteínas A o G

- Alta resolución, gran capacidad y velocidad

- Puede ser general o específica
- Suele ser cara y no siempre es factible
 Cromatografía de interacción hidrofóbica
Aunque la mayor parte de los residuos apolares suelen estar en el interior de las
proteínas, suelen quedar algunos en la superficie. Esta cromatografía separa las
proteínas en base a la mayor o menor presencia de zonas apolares en su superficie,
gracias al desarrollo de interacciones hidrofóbicas entre éstas y la fase estacionaria
en un entorno acuoso. A mayor superficie apolar, mayor interacción.
Se usan fases estacionarias de carácter hidrofóbico moderado, basadas en
polímeros hidrofílicos a los que se han unido ligandos como metilo, butilo o fenilo.
A mayor longitud de la cadena, mayor retención de los solutos Las interacciones
hidrófobas resultantes son relativamente débiles, por lo que no se altera el
plegamiento y se suele preservar la estructura terciaria de las proteínas.
Las interacciones hidrófobas son más intensas al aumentar la fuerza iónica, por
lo que las muestras se aplican en una fase móvil con altas concentraciones de sal,
para favorecer la retención de los solutos.
La elución se suele llevar a cabo con gradientes decrecientes de [sal], que van
reduciendo la fortaleza de las interacciones hidrofóbicas y liberando las proteínas,
primero las de menor superficie apolar.

 Cromatografía en fase inversa o reversa

Se desarrolló para separar sustancias no polares, pero también es capaz de separar
proteínas en base a que su carácter general sea más o menos polar.
En esta cromatografía la fase estacionaria es un líquido apolar inmovilizado sobre
un sólido inerte, mientras que la fase móvil es un líquido más polar. En contacto
con la fase estacionaria, los residuos apolares internos de las proteínas resultan
expuestos y desarrollan fuertes interacciones hidrofóbicas con ella.
Así, las proteínas con un carácter general más hidrofóbico serán más retenidas
que las que tengan un carácter general más hidrofílico, que eluirán antes.
La elución de las proteínas con carácter más hidrofóbico unidas más fuertemente a
la fase estacionaria se consigue aumentando la proporción de algún solvente
orgánico en la fase móvil.
 Tanto las interacciones con la fase estacionaria como la elución provocan
alteraciones en el plegamiento proteico.
Por ello, es un método muy desnaturalizante, que no está aconsejado cuando se
trate de preservar la conformación nativa funcional de la proteína que se quiere
purificar.

 Resumen de las interacciones en distintos tipos de cromatografías

5. Técnicas analíticas

 Electroforesis
Cuando se aplica un campo eléctrico a una solución, las moléculas de soluto con
carga positiva se desplazan hacia el cátodo (-), y las moléculas con carga negativa
lo hacen hacia el ánodo (+). Este desplazamiento se llama electroforesis.
Si ponemos las condiciones para que todas las moléculas tengan carga negativa,
todas irán hacia el ánodo, y si las hacemos pasar a través de las estructuras
reticulares de un gel, las interacciones con ellas retardarán su movimiento. En la
electroforesis, las moléculas de proteína, DNA o RNA son impulsadas por el
campo eléctrico más o menos en función de su relación carga/masa, y son
 retardadas por la red tridimensional del gel más o menos en función de su tamaño
y forma, todo lo cual permite separarlas.
Las electroforesis de ácidos nucleicos se suelen hacer en geles de agarosa, mientras
que las de proteínas se suelen hacer en geles de poliacrilamida (PAGE).
En la técnica de PAGE nativa la carga es la propia de la proteína al pH de la
solución que se use, y la proteína mantiene su estructura tridimensional.

 Electroforesis de proteínas en SDS-PAGE

Es la más usada para analizar mezclas de proteínas. Se hace en presencia de SDS, un
detergente que se une a las proteínas en una proporción de aproximadamente una
molécula de SDS por cada dos residuos aminoacídicos y las desnaturaliza,
dejándolas en disposición extendida y confiriéndoles una carga negativa
proporcional a su masa.
Esto les da a todas la misma forma y relación carga/masa, y permite separarlas en
el gel sólo en función de su tamaño: las proteínas más pequeñas se mueven más
deprisa.

 La SDS-PAGE separa las proteínas en función de su tamaño

Hay una relación semilogarítmica entre el tamaño de las proteínas y su movilidad
en el gel: a menor Pmol mayor movilidad.
Con geles de este tipo y una mezcla de proteínas de tamaño conocido, se puede
calcular el Pmol de otras desconocidas
El rango de discriminación depende de la concentración de poliacrilamida en el
gel: a mayor concentración, el gel separa mejor proteínas de un rango de Pmol más
bajo. El 10% es una concentración adecuada para las proteínas más frecuentes en
las células
 Inmunodetección de proteínas por Western blot
El objetivo de esta técnica es la detección de una proteína de interés en una
muestra compleja usando anticuerpos contra ella, previa separación por SDS-
PAGE de las proteínas presentes en la muestra.
Tras la SDS-PAGE, las proteínas se transfieren electroforéticamente desde el gel
hasta una membrana flexible (nitrocelulosa, PVDF, nylon…) para su mejor
manejo. Luego se incuba con el anticuerpo primario, que se une a la proteína de
interés o diana. Tras un proceso de lavado, se incuba con el anticuerpo secundario
(AC2), que se une al primario y lleva unido un enzima para su detección.
Ambas incubaciones se realizan en una solución saturada de proteína (caseína,
albúmina…), para evitar la unión inespecífica de los anticuerpos a las otras
proteínas de la muestra. También se realizan varios procesos adicionales de lavado.
Finalmente se añade un sustrato cromogénico o luminogénico que produce su
señal al ser transformado por el enzima del AC2. Algunos AC2 no llevan enzima
sino un fluoróforo, por lo que el último paso no es necesario.
 Isoelectroenfoque (IEF)
Las proteínas son moléculas con muchas cargas positivas y negativas de sus
residuos ionizables. Cada proteína tiene un pH isoeléctrico (pI) característico al que
no tiene carga neta porque el número de cargas de ambos signos se iguala. Cuando
el pH es igual a su pI, una proteína no es impulsada por el campo eléctrico.
Gracias a ello se pueden separar por isoelectroenfoque en gradientes de pH. Éstos
se crean con mezclas de anfolitas, que son moléculas pequeñas con grupos ácido y
base débiles de un rango dado de pI (p.e. de 3 a 9). Sometidas a un campo
eléctrico, migran y se ordenan por su pI: en el punto correspondiente a su pI, no
tienen carga y se paran.

 Electroforesis bidimensional (2D-PAGE)

Es el sistema de análisis electroforético más completo de una muestra: las
proteínas presentes en ella se separan en dos dimensiones, primero por su pI y luego
por su tamaño.
La primera dimensión consiste en un isoelectroenfoque (IEF) de la muestra.
Usando una tira de gel con un gradiente de pH determinado, las proteínas se separan
de acuerdo con sus pI. Se obtienen spots de proteínas, cada uno de los cuales puede
incluir una, varias o muchas proteínas con pI similar.
 La segunda dimensión es una SDS-PAGE, que se realiza en sentido perpendicular
usando como muestra la tira de IEF. En esta dimensión se separan por tamaño los
componentes de los spots previamente separados en base a sus pI.
Para demostrar que una preparación de proteína está pura es necesario que aparezca
una única mancha tras un análisis por 2D-PAGE y posterior tinción con azul de
Coomassie o plata

 Purificación de plásmidos por lisis alcalina

Los plásmidos son moléculas de DNA extracromosómico, circulares y de pequeño
tamaño, típicos de bacterias, arqueas y levaduras. No son necesarios para la
viabilidad general de la célula, aunque suelen contener genes de supervivencia o
adaptación, p.e. de resistencia a antibióticos o de uso de nutrientes poco habituales
Los plásmidos se usan como vectores de clonación: moléculas de DNA capaces de
replicarse independientemente dentro de una bacteria, incluyendo fragmentos de
DNA exógenos que hayan sido insertados en ellos. Así, si clonamos un gen en un
plásmido, e introducimos éste en bacterias, al crecer un cultivo de éstas obtendremos
muchas copias del plásmido con el gen de interés, para su manipulación, estudio o
expresión.
Como sistema hospedador se suele usar una de las múltiples cepas de laboratorio de
la bacteria Escherichia coli. Para los procesos de clonación y manipulación del
plásmido, se necesita un sistema para purificarlo a partir de bacterias. Uno de los
más usados es el llamado de lisis alcalina.

 Electroforesis de DNA
Para los procesos de clonación, manejo y análisis del DNA, es necesario usar un
sistema que permita separar los fragmentos de DNA según su tamaño. En una
electroforesis en gel de agarosa, los fragmentos de DNA se ven impulsados por el
campo eléctrico y retardados por la malla tridimensional del gel Todas las moléculas
de DNA tienen la misma forma de doble hélice con esqueletos de desoxirribosa-
fosfato. Debido a la presencia regular del fosfato, todas tienen una fuerte carga
negativa distribuida uniformemente.
Como tienen la misma relación carga/masa y la misma forma, se separan sólo por
su tamaño: hay una relación semilogarítmica inversa con la movilidad, avanzando
más cuanto menor es su tamaño.

Espectrofotometría y colorimetría
 Espectro de radiaciones electromagnéticas
Las radiaciones del espectro electromagnético se pueden clasificar en base a su longitud
de onda (λ). Éstas presentan un rango continuo de variación a lo largo del espectro, por
lo que las λ que definen los límites de cada región corresponden a valores orientativos,
pudiendo haber radiaciones con cualquier valor posible de λ
Energía asociada a la radiación: E = h f = h · c / λ
h: cte. de Planck f: frecuencia (hercios o ciclos/seg)
c: velocidad de la luz λ: longitud de onda
Intensidad, I: cantidad de energía que atraviesa la unidad de área, perpendicular a la
dirección de propagación, por unidad de tiempo
Espectroscopías: técnicas de análisis molecular basadas en el estudio de las
interacciones entre las radiaciones electromagnéticas y las moléculas

 Absorción de la radiación UV-visible por la materia

Cuando la radiación electromagnética atraviesa una materia o un medio, parte puede
sufrir reflexión, dispersión, refracción o difracción, y parte puede ser absorbida. Cuando
hay absorción, a veces tiene lugar una emisión posterior, que provoca fluorescencia o
fosforescencia.
Un átomo o una molécula no pueden absorber radiación con cualquier valor de energía,
sino que los valores capaces de ser absorbidos están determinados por las características
atómicas y moleculares.
Si a las moléculas de un medio llega una radiación cuya l implica una energía asociada
DE con un valor equivalente a la diferencia entre dos niveles electrónicos (basal E0 y
excitado E*), se produce absorción y tendrá lugar una transición electrónica de las
moléculas entre esos niveles. En estos casos, la intensidad de la radiación I tras
atravesar el medio es menor que la intensidad incidente I0. Se dice que el medio tiene
cromóforos.
También hay fenómenos de absorción de energía de menor cuantía, debidos a
transiciones entre niveles vibracionales o a oscilaciones moleculares.

 Ecuación de Lambert-Beer.
La espectrofotometría es la medición de la cantidad de energía radiante que absorbe un
sistema químico en función de la longitud de onda. Para medir esta absorción en la
región ultravioleta-visible-infrarrojo del espectro se usan los espectrofotómetros.
En los estudios espectrofotométricos no se mide directamente la luz absorbida, sino
magnitudes basadas en las intensidades de la luz incidente (I0) y transmitida (I o It),
como la Absorbancia (A o Abs) y la Transmitancia (T), ambas adimensionales:
A = log ( I0 / I ) T = ( I / I0 ) 100 A = log 1 / T
Según la Ley y ecuación de Lambert-Beer: A = ε · c · l y T = 10 –εc l
La absorbancia es directamente proporcional a la concentración de soluto c y al espesor
del medio l (o camino óptico). Por tanto, si conocemos el factor e, con un camino óptico
constante, la medida de A se puede usar para hacer medidas de concentración
El coeficiente de extinción molar ε se define como la Abs de una disolución 1 M de un
soluto para un paso óptico de 1 cm, a la longitud de onda que se esté midiendo. Los
espectrofotómetros permiten medir Abs y T a diferentes longitudes de onda.
 Variación de la Absorbancia y la Transmitancia en función de la concentración
La absorbancia varía de forma directamente proporcional a la concentración de soluto.
La transmitancia varía de forma exponencial inversa en función de la concentración de
soluto.
La absorbancia de una disolución es la suma de las absorbancias de sus componentes
Ello permite descontar la contribución del disolvente al realizar la medida experimental
de la Abs de un soluto en disolución
También se puede medir la Abs de un solo compuesto en una mezcla que contiene
varios, restando la Abs del llamado tubo blanco, que contiene todos menos el de interés

 Aplicaciones de la espectrometría de absorción al estudio de las biomoléculas

Espectroscopía de absorción UV-visible y espectrofotometrías de ácidos nucleicos y
proteínas
Colorimetrías: análisis de concentraciones con cromóforos coloreados

- Cálculo de la concentración de proteína a partir de medidas de absorbancia

Turbidimetrías

- Medida de la concentración de células de un cultivo

Ensayos enzimáticos

- Medida de la velocidad de una reacción catalizada por un enzima

Enzimoinmunoensayo (ELISA)

- Reacción colorimétrica para detectar inmunocomplejos de anticuerpos con una

proteína diana de interés

 Espectroscopía de absorción de biomoléculas

Las proteínas, los carbohidratos y los ácidos nucleicos son moléculas complejas que
pueden absorber radiación a lo largo de un amplio intervalo del espectro, es decir de
una amplia gama de niveles de energía
Así, muchas biomoléculas pueden absorber energía de baja intensidad y experimentar
diferentes tipos de vibraciones y oscilaciones moleculares. Por ello la espectroscopía
infrarroja puede proporcionar información sobre su estructura molecular
Aunque la mayoría no absorben luz visible en cantidades significativas, hay algunas
proteínas coloreadas porque tienen grupos prostéticos (como el hemo) o iones
metálicos (como Cu2+ o Zn2+), que les confieren absorción en el rango visible
La espectroscopía de absorción UV-visible se puede aplicar para la detección y
cuantificación de ácidos nucleicos y proteínas, registrando su absorbancia a 260 ó 280
nm, respectivamente
Los ácidos nucleicos absorben en la zona del UV gracias a sus bases nitrogenadas,
con una lmax a 260 nm. Así, la medida de la A260 se usa para medir la concentración de
DNA y de RNA
1 U Abs260 = 50 mg DNA / ml
1 U Abs260 = 40 mg RNA / ml

 Espectrofotometría de ácidos nucleicos

Además, las medidas de A260 se pueden usar para estudiar la desnaturalización de los
ácidos nucleicos, o sus interacciones con proteínas u otros ligandos
Si se representa la A260 de una disolución de un DNA en función de la temperatura se ve
una curva sigmoidal
A temperatura baja está como DNA de doble hélice o dsDNA, y el apilamiento de las
bases en su interior provoca una restricción de su capacidad de absorción
Al aumentar la temperatura, el DNA se va abriendo o desnaturalizando, dando hebras
sencillas o ssDNA. Por ello desaparece el bloqueo de la absorción por las bases y
aumenta la A260: es el efecto hipercrómico
La temperatura de fusión o melting Tm es el punto medio en la desnaturalización del
dsDNA a ssDNA. Es característico para cada molécula de DNA porque su valor
depende de su composición en bases: a mayor contenido de G+C, más alta es su Tm
La Tm también aumenta con la fuerza iónica o concentración salina
Ambas características tienen repercusiones de gran interés a nivel biológico y técnico

 Espectrofotometría de proteínas
La región de mayor absorción por las proteínas es el intervalo 180-220 nm, debido a las
transiciones electrónicas que provoca la absorción de energía por los enlaces
peptídicos. Sin embargo, esta zona no se suele usar para realizar medidas, porque hay
muchos otros compuestos biológicos que también absorben en ella
En el intervalo de 230-300 nm hay absorción por los grupos aromáticos de Trp, Tyr y
Phe. Por ello, para medir la concentración proteica normalmente se suele usar la A280,
ya que a esa l no absorben muchos otros compuestos. Aunque varía con las proteínas
porque depende de su composición en aminoácidos, aproximadamente: 1 U A280 ≈ 1 mg
de proteína / ml
Como mencionamos, algunas proteínas tienen grupos prostéticos o iones metálicos, que
suelen presentar absorción en la zona del visible, con lmax características de cada uno a
las que se pueden medir y estudiar las proteínas correspondientes
 Colorimetría. Determinación de la concentración de proteína
Además de la medida directa, la concentración de proteína se puede medir mediante
métodos colorimétricos basados en la generación de cromóforos por un método
químico. En general, estos métodos dan mayor especificidad y sensibilidad

 Recta (o curva) patrón

Cuando no se conoce o no es aplicable el coeficiente de extinción molar e, que permite
correlacionar absorbancia y concentración de un compuesto, hay que realizar una recta
de calibrado o recta patrón para cada experimento
Esta permite calcular la correlación entre cantidad de proteína y absorbancia, y por tanto
calcular la concentración de una muestra problema de Abs conocida
Una vez conocida la cantidad de proteína en la muestra problema, la dividimos por el
volumen de la misma añadido al tubo de ensayo, para calcular su concentración

 Turbidimetrías
Un turbidímetro mide la turbidez de una muestra, que se debe a la presencia de
partículas sólidas en suspensión en una solución. Éstas absorben o dispersan la luz,
provocando una absorbancia aparente. Como en este caso no se mide solo absorción de
luz, se suele hablar de densidad óptica (OD)
Un ejemplo clásico es la medida de la A600 para estimar la concentración o densidad de
bacterias en un cultivo, que suele ser un parámetro experimental de interés para medir
su tasa o fase de crecimiento. Ésta suele afectar a muchos parámetros del ciclo vital y
del metabolismo celular

 Ensayos enzimáticos
Consisten en realizar una medida de la velocidad inicial V0 de una reacción enzimática
mediante la medida del aumento de la absorbancia del producto de la reacción en
función del tiempo, que es proporcional a su aumento de concentración. Se puede hacer
usando productos coloreados, fluorescentes o luminiscentes
Cuando la concentración de sustrato es saturante, V0 es proporcional a la cantidad o
concentración de enzima
 Sustratos cromogénicos
Lo más habitual es usar un sustrato cromogénico sintético que no absorbe luz de una λ
determinada, y que el enzima transforma en un producto que sí la absorbe
Entre los sistemas cromogénicos más empleados están los que usan el para-nitrofenol
o la para-nitroanilina (pNA) como producto final coloreado, que tienen un máximo de
absorción a 405-410 nm
Para ello se sintetiza un sustrato en el que el cromógeno esté unido a un radical
mediante un enlace susceptible de ser atacado por el enzima que se desea medir. Esa
unión provoca que el cromógeno no absorba, pero al romper el enlace lo hace

 Inmunodetección de proteínas por ELISA (Enzyme-linked immunosorbent

assay)
En cada pocillo, la absorbancia es proporcional a la cantidad de proteína diana de
interés, que se puede medir usando como referencia una recta patrón o de calibrado

Hay distintas variantes de ELISA, en función del tipo de análisis que se haga

Fisiología animal
PRNCIPIOS ÉTICOS DE LA EXPERIMENTACIÓN ANIMAL
1. INTRODUCCIÓN:
 Cabe recalcar que cualquier persona que utilice animales para experimentación
debe tener unos conocimientos previos y haber pasado unos exámenes
 El uso de animales de laboratorio está perfectamente regulado por legislación
 Antes era poco habitual hablar de la ética de la investigación.
- El científico no tenía que adoptar ninguna postura moral particular
- No necesitaba sentirse especialmente comprometido con la sociedad que lo
sustentaba
- No creía que tuviera que responder ante las consecuencias de la actividad
en investigación
 No cualquiera puede decidir o aplicar los valores con los que se debe proceder
para tratar estos animales, por tanto, se cree que lo más beneficioso para ambas
partes sea que la persona que decida esta manera de proceder sea una persona
 que tenga mucho conocimiento en animales y que los conozca muy bien tanto a
nivel de organismo cómo a nivel físico por ello se delega este trabajo al hombre
de ciencia. Más si está especializado en animales o trabajó con ellos.
- Esta persona puede elegir, ya que dispone de los medios más adecuados
para interrogar a la naturaleza y esto le permite situarse en una posición de
autoridad y privilegio cognoscitivo.
- La persona que experimenta con animales y el profesional que le dio esos
conocimientos para poder realizar el trabajo, deben asumir la mayor
repercusión de sus propios actos y por ello la mayor obligación ética en su
trabajo.
 En los últimos años se ha dado más a conocer este trabajo con animales, lo que
ha suscitado diferentes opiniones tanto en la comunidad científica como en
población. Entre ellas nos encontramos intensos debates opiniones encontradas y
acciones marcadas con vehemencia. Ante este tema, como otros muchos, la
población está dividida en varios grupos según su opinión:
- Grupos que son totalmente contrarios a experimentar con animales y entre
ellos nos encontraríamos dos subgrupos: moderados y extremistas
- Otra parte ve necesario y acepta esa experimentación con animales
siempre y cuando esté justificada y haya una razón por la que se deba
proceder a experimentar con ellos.
- Un tercer grupo en la población que no se involucran en el tema
 Dentro de los grupos contrarios nos encontramos:
- Grupos moderados (PETA, People for the ethical treatment of the animals)
se denominan moderados, ya que no proceden de maneras violentas para
poder eliminar esa experimentación animal. Ellos buscan liberar o defender
a esos animales ya que actúan en base a un sentimiento de amor hacia esos
animales. Lo que hacen es sesgar la información para evitar que estos
sufran y así defenderlos. No solo intentan evitar la experimentación animal,
sino que también intentan que no se utilicen como comida, vestimenta o
entretenimiento. Ellos defienden que los animales son capaces de sufrir al
igual que los humanos y esos animales también tienen interés en dirigir sus
propias vidas, por lo tanto, los humanos no somos nadie para utilizarlos
como medio y así obtener un fin.
- Dentro de los grupos radicales recalcamos el papel de un filósofo: Peter
Singer que escribió Animal Liberation. Este libro defiende que todos los
animales somos iguales: seres vivos, y que no hay diferencia cualitativa
radical entre hombres y el resto de animales, ya que todos somos células
que funcionan coordinadamente. Por tanto, estos grupos no se rigen por un
sentimiento de afecto, sino que se rigen por una fundamentación teórica la
cual defiende que somos totalmente iguales y que no tenemos derecho a
imponernos o creernos superiores los seres humanos frente a otros grupos
animales.
 A raíz del movimiento anti-experimentación animal también hay asociaciones o
grupos que se proclaman como defensores de los derechos animales y defienden
 los derechos morales de estos diciendo que son iguales que los del hombre. Por
ello están en contra de cualquier utilización de los animales.
- La Liga francesa contra la vivisección
- El frente de liberación animal (ALF) en Inglaterra y USA

Estos grupos de defensa animal se concentran en Inglaterra y Estados Unidos,

son los países que más movimientos a favor de los animales tienen, por tanto,
también donde se encuentran más grupos radicales.
 EL frente de liberación (ALF)
- Los objetivos de alf son:
1. LIBERAR a los animales que se encuentran en los supuestos lugares de
abuso como laboratorios, granjas industriales, granjas peleteras, granjas
destinadas al consumo cárnico y derivar esos animales a buenos hogares
donde puedan vivirlas vidas en naturaleza y libres de sufrimiento
2. INFRINGIR daños económicos en aquellas empresas o laboratorios que
se beneficien de la explotación de los animales
3. REVELAR el horror y el trato o atrocidades que se les dan a los
animales a puerta cerrada. Siempre con acciones directas que no sean
violentas, y así alertar a la población.
- Toman todas las precauciones necesarias para prevenir el daño en cualquier
animal, humano y no humano. Ellos no buscan en ningún momento dañar,
pasar por encima u obligar; simplemente quieren liberar y dar a conocer
dicha situación, pero siempre desde el pacifismo.
- Si se cumpliesen estos objetivos, tendrían un gran impacto ya que si
liberásemos todos esos animales que se encuentran en granjas o
laboratorios, los ecosistemas sufrirían un gran impacto al recibir tal
cantidad de animales con los que antes no contaban y habría rivalidad por
comida, desarrollo y supervivencia.
También supondría grandes cambios en la sociedad debido a una
disminución de recursos, tanto alimenticios, como de desarrollo científico.
Debemos tener en cuenta un punto importante y es que esos animales se han
criado y crecido en unas condiciones determinadas las cuales no son
similares a las condiciones que se dan en la naturaleza. Esto supondría que la
gran mayoría de los animales que se liberen terminarían por morir debido a
que no conseguirían adaptarse. Deberán luchar por encontrar alimento o por
sobrevivir con el resto de animales que se encuentran y han crecido en el
medio externo.
- Sus propios objetivos se contraponen a las técnicas que ellos mismos
utilizan, ya que realizan:
Amenazas y ultrajes
Intimidación
Pintadas y vandalismo
Obstrucción
Destrozos criminales
Robos
 Contaminan productos
Incendios intencionados
Por tanto, esa cláusula que decían de no dañar o destruir, ante este método de
proceder no se cumple.
 Acoso a investigadores
Hay muchos casos, pero uno conocido fue el de neurocientífico de la
Universidad de California, el cual había llegado a lograr muchísimos avances
ante el Alzheimer, pero decidió retirarse debido a constantes amenazas sufridas
durante años por experimentar con animales.
Este caso fue publicado en la revista Nature con el fin de dar también a conocer
el trato que sufrían científicos o personas que trabajaban en el laboratorio con
animales de mano de esos grupos anti-experimentación animal
A raíz de eso también se creó una asociación: People´s Petition para poder
defender a las personas del campo de la ciencia que trabajan con animales de
esas continuas amenazas o agresiones.
 People´s Petition
- Defienden que la investigación médica es esencial para desarrollar nuevos
tratamientos tanto médicos como veterinarios.
- Ven necesario mantener la experimentación animal para lograr avances,
pero también justificando que tiene que haber una causa real para ese trato
del animal y mantener un cuidado y un bienestar de los animales dentro del
laboratorio.
- Defienden que esas personas que realizan investigación con animales
tienen derecho a poder trabajar igual que el resto de personas, sin miedo a
constantes amenazas.
 La población vuelve a tomar diferentes posturas incluso dentro de la misma
comunidad científica apoyando o criticando el uso de animales. Esto termina
produciendo que se ponga en tela de duda la continuidad de la experimentación
en animales incluso dentro de la comunidad científica.
 En 1978 en un comité internacional sobre el animal de laboratorio al servicio del
hombre celebrado en Francia se creó una comisión internacional de la cual se
decretaron los principios de ética de la experimentación animal:

1. Los progresos de conocimiento humano y notablemente los de la biología, la

medicina del hombre y de los animales son necesarios.
2. El hombre tiene necesidad de utilizar los animales para comer vestirse o
trabajar.
3. Toda persona que practica la experimentación biológica debe tener el
conocimiento de que el animal está dotado de sensibilidad, memoria y que es
capaz de sufrir, sin poder escapar del dolor.
4. El experimentador es moralmente responsable de sus actos.
5. Los experimentos deben ser realizados por biólogos o personal cualificado
bajo control directo. Las condiciones de mantenimiento preferiblemente
deben de estar controladas por un veterinario o un científico competente
sobre la materia.
 6. Los estudios con animales tienen que conducir a la adquisición de unos
conocimientos razonables y justificados.
7. Siempre que sea posible deben de utilizarse métodos alternativos: sistemas
biológicos in vitro, modelos matemáticos o diseños estadísticos.
8. Se usarán los animales mejor adaptados a esta investigación, procurando
utilizar el menor número posible y realizar el menor número de
experimentos.
9. El experimentador debe velar que las condiciones de mantenimiento del
animal de laboratorio sean las mejores y cubrir todas las necesidades antes,
durante y después de las intervenciones.
10. Tiene que deber de ahorrarle al animal todo tipo de sufrimiento físico o
psíquico inútil y debe delimitar el dolor cuando sea inevitable.

- El ser humano necesita conocer a fondo su organismo, así como, los

mecanismos bajo los que éste funciona para poder desarrollar curas o
entender ciertos aspectos que nos permitan evolucionar en el campo de la
ciencia.
- Para ello es inevitable que utilice animales, debido a la similitud que estos
tienen con los seres humanos, así como, también es necesario descubrir los
organismos de otros animales aparte del ser humano.
- Siempre tendremos en cuenta que los animales tienen sentimientos y
padecen dolor, por tanto, intentaremos reducir al máximo el número de
experimentos para evitarles estrés o generar dolor de manera innecesaria.
- Para evitarle ese sufrimiento y no alterarlos se opta porque la gente que
trate con esos animales sean biólogos o veterinarios los cuales tienen
amplios conocimientos o personas experimentadas que supervisen el
trabajo de otras que no lo sean.
- Todos estos experimentos estarán justificados científicamente, no se puede
proceder a realizar el experimento sin un objetivo claro y antes de realizarlo
se estudiarán diferentes alternativas para evitar el uso de animales.
- Todos estos animales tienen que estar supervisados y mantenerse con unas
condiciones de cuidado e higiene básicas. En el caso de que el experimento
se vuelva algo doloroso para el animal deberá limitarse el dolor.

2. LEGISLACIÓN:

 ¿A quién vamos a proteger? Al animal

 ¿Qué vamos a regular? El uso de animales en investigación y docencia
 ¿Qué vamos a intentar preservar? El bienestar animal minimizando el daño y
dolor causado debido a la investigación
 El 1 de enero del 2013 entró en vigor una nueva directiva europea que regula la
experimentación con animales la cual es de obligado cumplimiento por todos los
Estados miembros de la Unión Europea y de obligada transposición al ordenamiento
jurídico de cada país.
 Un mes después se creó un Real Decreto en el cual se establecen las normas básicas
aplicables para la protección de los animales utilizados en experimentación y la
docencia. Esto nos permite realizar experimentos en animales cumpliendo
únicamente estos parámetros:
- Deben realizarse en centros debidamente registrados
- Por personal capacitado con la formación adecuada
- Solo pueden actuar profesionales tras haber obtenido el permiso
correspondiente
 Hay distintos niveles de capacitación de personal para la experimentación animal y
según su nivel podrán realizar unas u otras actividades sobre el animal:
A Cuidadores (Graduados en ciclos o grados en ciencias de la salud)
B Experimentadores (Grado en ciencias de la salud + curso teórico/práctico +
examen)
C Investigadores (Graduado y doctorado + curso teórico/ práctico)
D1 Responsables en el bienestar animal (veterinarios especializados en animales de
laboratorio)
D2 Responsables de salud animal (veterinarios especializados en animales de
laboratorio)

Habilitación o curso único Formación continua (renovación cada 8

años)
Cuidadores Cuidado de animales y eutanasia
Experimentadores Eutanasia y realización de procedimientos
Investigadores Diseño de los procedimientos a realizar
Responsables del bienestar animal Supervisión del bienestar animal
Responsables de salud animal Veterinario designado

 En el bioterio de la Universidad de Oviedo:

- Hay zonas limpias en las cuales se encuentran los animales en las
condiciones necesarias para su bienestar, a ellas solo accede personal
acreditado el cual se ha vestido de una forma totalmente estéril con batas
gorro y patucos para no alterar los animales ni alterar las condiciones del
medio limpio.
- Hay un quirófano para animales más grandes como cerdos u ovejas los
cuales utilizan estudiantes de medicina sobre todo para saber cómo
proceder en sus futuras cirugías; esos cerdos y ovejas proceden de granjas
las cuales solo producen animales de experimentación y también tienen
unas condiciones de bienestar y de salud diferente al resto de granjas de
producción.
- Hay laboratorios más pequeños para cirugías menores de animales como
ratas o ratones los cuales no se pueden mezclar entre ellos ya que se
estresan y no es bueno para la salud del animal.
- Hay una resonancia magnética para ratones a los que previamente se ha
anestesiado para poder realizar el estudio, también se les suministran
 ciertos analgésicos en el momento en el que se cree que el animal puede
estresarse o sufrir dolor siempre y cuando los medicamentos no interfieran
en los resultados del experimento.
 Se han creado comités éticos para asegurar que los aspectos éticos sean tenidos en
cuenta a lo largo de la investigación. Están formados por una serie de personas
expertas en experimentación con diferentes puntos de vista, puede haber filósofos
los cuales aporten esa visión sobre la ética del animal, licenciados en derecho para
tratar tema legal y otras muchas ramas que aporten variedad de opiniones desde
diferentes campos y puntos de vista. La función de estos es aprobar o denegar la
realización de un experimento en función de una serie de parámetros estudiados.
 En marzo del 2002 se creó en la Universidad de Oviedo el comité de ética el cual
aprobará los proyectos que utilicen animales y exige que todos los investigadores
que manejen los animales sean conocedores de ello, es decir, que tengan una
formación anterior.
 A la hora de proceder con un experimento primero tienes que realizar el diseño y
estudiar una serie de parámetros que serán los que revisará ese comité de ética para
denegar o aprobar el proyecto de tu experimento. Los parámetros estudiados son:
- Debe tener una justificación social y científica
- Deben justificar la necesidad del uso de animales
- Revisarán la capacidad del equipo investigador
- Mirarán la validez científica y el diseño metodológico
- Además del cumplimiento de la normativa, autorizaciones, permisos…
- Deben presentar un escrito el cual aborden diferentes puntos cómo
comentar el objetivo del experimento explicando el diseño. Aportar una
valoración de los resultados que esperan conseguir con dicho experimento.
Explicar métodos alternativos al uso de animales si los hubiese. Indicar la
especie animal idónea para proceder con el experimento. Explicar fases o
procedimientos donde el animal puede llegar a sufrir las cuales evitarán en
la medida de lo posible. Mencionar el personal que estará implicado y
mencionar titulaciones, experiencia, cursos y acreditaciones.
 Experimentación en humanos para proceder con esta situación se ha creado una
declaración, denominada declaración de Helsinki, es el documento más
importante de la ética de la investigación con seres humanos. No son leyes pero
son las bases sobre las que se asentaron las leyes relacionadas con los
experimentos con humanos.
 Los principios básicos en este tipo de investigación:

1. El más importante es el respeto por el individuo, el derecho a la

autodeterminación y el derecho a tomar decisiones informadas
consentimiento informado incluyendo la participación en la investigación
tanto al inicio como durante el curso de la investigación.
2. Premia el bienestar del sujeto sobre los intereses de la ciencia o de la
sociedad.
 3. Las consideraciones éticas deben venir siempre del análisis precedente de
las leyes y regulaciones.
4. Debemos reconocer la creciente vulnerabilidad de los individuos y los
grupos necesita especial vigilancia. Desde un principio debemos informar
sobre todos los puntos que se llevarán a cabo en el experimento al individuo
y solo en el caso de que hayamos obtenido su consentimiento podremos
proceder con el experimento.
5. El consentimiento es muy importante antes de proceder con el experimento.
Que el individuo nos haya dado su consentimiento al principio del
experimento no quiere decir que este no se pueda retractar en algún punto
del experimento y abandonar.
6. En el caso de los menores de edad o gente que no que no tenga todas sus
capacidades físicas y síquicas en orden debemos recurrir a un sustituto el
cual vele por el interés del individuo y este será el que nos dé su
consentimiento.
 Comité de ética de experimentación en humanos de Asturias se encuentra en el
HUCA y este se encarga de apobar o denegar los experimentos planteados. Está
formado por 21 miembros entre ellos varios médicos de diversas ramas, un
licenciado en derecho, un graduado en filosofía, un representante de la facultad de
Oviedo y una persona que haga de secretaria
 ¿Y si mi proyecto no ha sido evaluado por un comité de ética?
- No conseguirás financiación
- No tendrás acceso a los pacientes y los animales
- No publicarás los resultados en revistas científicas
- Siempre debe ser evaluado

 Ética de la responsabilidad:
- Autorregulación: balance riesgo/ beneficio
- Legislación sobre experimentación animal
- Evaluación y seguimiento por comités de ética
- Regla de las 3 Rs: reducción, reemplazo y refinamiento

3. ¿EL FIN JUSTIFICA LOS MEDIOS?

 Para poder realizar una evaluación correcta imparcial y equilibrada hay que tener
muy claro el valor de lo que estamos comparando, pondremos en una balanza:
- Perjuicio que se le ocasiona al ser vivo en el experimento
- Beneficio que obtendremos de la investigación y de las prácticas con ese
ser vivo
 Fases de producción de una vacuna:
- Primera fase en la que se hace una revisión de la bibliografía científica que
hay sobre el tema, es decir, experimentos realizados ver hacia donde
 podemos progresar en ese estudio y una vez que tienes clara la parte teórica
luego está la práctica.
- En el laboratorio el primer paso siempre suele ser el uso de programas
estadísticos, cálculos matemáticos, también ensayos in vitro con tejidos o
células.
- Si es un fármaco lo primero haces diseños sobre el
- Después de diseñarlo se prueba su eficacia, primero en animales, siempre
se eligen los animales que mejor se adapten y sean más idóneos a ese
fármaco
- Ante los resultados obtenidos probaremos en humanos, ambos géneros y
diferentes grupos de edad.
- Tras confirmar su eficacia ya podemos permitir la comercialización.

 Elementos básicos que intervienen en la decisión:

- Los conocimientos de la persona a realizar el experimento, su ética y moral
- La opinión o punto de vista personal que también se puede ver influenciado
por la presión social
- La legislación que hay detrás de este tipo de experimentación, la cual, es de
obligado cumplimiento
 A título personal debemos tener en cuenta una serie de factores a la hora de trabajar
con seres vivos más concretamente animales:
- El animal es un sujeto y no un objeto, no se le puede cosificar ni tratarlo
como si su valor fuese solamente un medio para conseguir un fin
- Los animales también tienen derecho moral y esto quiere decir que los
animales y su existencia no han sido apreciados solamente en función de
las necesidades del hombre y de su utilidad, sino que son sujetos
participantes
 A raíz de esto se desarrolla el concepto de “especieismo” se plantean dos preguntas:
- ¿Existe realmente una jerarquía de derechos entre las diferentes especies?
- ¿Son las personas más importantes que los animales?

 Esta cuestión de diferenciación entre personas y animales genera controversia

debido a que cuantas más similitudes presenta un animal respecto al ser humano
más rechazo nos genera a la sociedad utilizarlo en experimentos. Volvemos a
enlazarlo con el tema de los antiviviseccionistas más radicales.
Ellos opinan que existe una verdadera igualdad entre las diferentes especies.
Para ellos el sufrimiento de los animales es totalmente inaceptable al igual que lo es
en humanos.
Se basan en la declaración de Helsinki en la cual se obliga a tener un consentimiento
informado por parte del ser humano para poder proceder con el experimento y ellos
justifican que eso es injusto ya que no es posible obtener dicho consentimiento por
parte de los animales.
 Pese a todos estos debates a lo largo de la historia se han hecho muchos
experimentos en animales los cuáles han llegado conseguir curas que han erradicado
enfermedades, que en el pasado, eran muy virulentas y se cobraban muchísimas
vidas, ejemplos como la polio, hepatitis B, rubéola, sarampión, difteria o malaria.
También gracias a estas experimentaciones muchos científicos han conseguido
ganar premios nobel y avanzar muchísimo en el campo de la ciencia pudiendo
explicar y entender mecanismos complejos como la transmisión del impulso
nervioso.
 El factor tener en cuenta a la hora de elegir unos animales u otros para proceder en
experimentación es la complejidad de su organismo y la similitud que éste pueda
presentar respecto al organismo humano. Los animales más similares a nosotros
serían ratas, ratones y chimpancés tanto en el genoma como en los órganos que estos
presentan.

4. ALTERNATIVAS:

 Se entiende por alternativa a cualquier técnica que:

REEMPLACE el uso de animales
REDUZCA el número de individuos a manipular durante el exp.
REFINE el método de trabajo para disminuir el dolor o malestar
 Estos tres puntos a seguir se conocen como Regla de las tres Rs de Russell y Burch.

1. Reemplazo (técnicas):
- Sustitución de animales vivos vertebrados por embriones de animales
invertebrados ya que debido a su menor desarrollo del sistema nervioso se
cree que tienen menos capacidad de sentir dolor o tener sentimientos, estos
embriones deben estar en una fase de edad concreta y también recurrimos a
cultivos celulares de microorganismos.
- Trabajos con órganos o humores (fluidos como sangre o líquido
cefalorraquídeo) asilados de animales.
- Técnicas “in vitro” utilizando cultivos de órganos, tejidos o células. A
partir de una pequeña muestra del animal.
- Sistemas físico-químicos mimetizantes de funciones biológicas, intentar
recrear un ambiente como puede ser un órgano concreto replicando la
temperatura, acidez, fluidos y en ese caso se prueba a ver cómo reacciona
ente los cambios que nosotros queremos producirle pero totalmente aislado
al animal obteniendo los mismos resultados.
- Simulaciones de procesos fisiológicos y modelos matemáticos de
relaciones estructura actividad basados en propiedades fisicoquímicas de
principios activos, con ordenadores. Programas que recrean las condiciones
de la zona del animal o de la cavidad u órgano de estudio, es muy útil para
docencia, pero en el caso de la investigación, no tanto, ya que para realizar
el modelo final del programa necesitamos habernos basado en un estudio
piloto para el que necesitamos el uso de animales para desarrollar el
proyecto basándonos en información de las muestras del animal, el
 ambiente y condiciones que luego recrearemos con el software. Por lo que
no se reemplaza, sino que solo reduces. Modelos matemáticos predictivos.

2. Reducir (técnicas):
- El ajuste de la calidad genética, sanitaria y ambiental de los animales para
lograr una mejor dispersión de los datos y como consecuencia la
disminución de los animales necesarios para la utilización de técnicas de
diseño experimental sofisticadas para la misma finalidad. Coger solos los
individuos mejor adaptados a nuestro experimento, con la calidad genética
buena la cual vienen garantizada por los lugares de los que obtenemos los
animales. Basarnos en cálculos estadísticos del tamaño muestral para poder
ajustar el número exacto para nuestro experimento.
- Planificación de las experiencias para compartir los mismos animales a lo
largo de las diferentes pruebas que haremos durante el exp.
- Establecimiento de bancos de datos, facilitando el acceso a literatura
especializada y estímulo de la publicación de los resultados negativos con
la finalidad de evitar repetición de experimentos.
En muchos casos las revistas no quieren publicar los resultados negativos, pero
esto sería básico y muy necesario ya que antes de hacer un experimento los
investigadores lo que hacen es consultar la información en artículos ya
publicados y en función de que ya haya dicho experimento el proyecto se anula,
pero si no obtenemos información dado que el exp. ya se ha realizado, pero ha
obtenido resultados negativos volveríamos a repetirlo fallando de nuevo y no
estaríamos contribuyendo a dicha reducción.

3. Refinamiento (técnicas):
- Perfeccionamiento de métodos para detectar el dolor
- Utilización de técnicas no invasivas o telemétricas, con dispositivos
externos al cuerpo.
- Empleo de análisis radiológicos para detectar tumores o deterioro orgánico
sin espera sintomatología aparente. Nos permite anticipar la eutanasia
evitando así el padecimiento prolongado del animal.
- Uso de analgésicos, tranquilizantes o anestésicos cuando las circunstancias
lo permiten teniendo en cuenta no alterar el experimento.
- El aprendizaje y la experiencia que realice los procedimientos. Cuanta
mayor es la experiencia se espera un manejo y precisión durante los
procesos a seguir.

 Severidad de los procedimientos:

- Leve: técnicas no invasivas de diagnóstico de imagen, biopsias menores,
implantación de dispositivos externos, criar animales modificados
genéticamente.
 - Moderada: pruebas de toxicidad crónica, carcinogeneidad, cirugía bajo
anestesia general, jaulas metabólicas
- Severa: dispositivos cuyo fracaso sería letal para el animal, irradiaciones
con dosis letales, inducción de tumores invasivos, aislamiento en especies
gregarias, deporte o explotación del animal.

5. SEGURIDAD E HIGIENE EN EL TRABAJO DE LABORATORIO Y DE

CAMPO
 Bioseguridad: es el conjunto de medidas preventivas mínimas que tienen como
objetivo proteger la salud y la seguridad del personal, disminuyendo o eliminando
los riesgos producidos por agentes biológicos (escaparse un virus, materiales
punzocortantes), físicos (rotor de una centrifugadora salga volando, electricidad,
poca luz), químicos (ácidos o gases de las reacciones, aerosoles, desinfectantes),
mecánicos y psicológicos( relaciones interpersonales, excesivas horas de trabajo y
peor rendimiento por falta de concentración).
- Antes de trabajar en un laboratorio debemos saber cuales son los riesgos a
los que nos enfrentamos para poder tomar las medidas de protección y
prevención necesarias. Así como reconocer las zonas de riesgo del área de
trabajo. (1Er mandamiento)
- Siempre existen normas y reglamentos de seguridad, pero nunca van a ser
eficaces al 100% ya que contamos con el factor humano que altera esas
condiciones. Para ello debemos tomar actitudes conscientes y responsable
acatando las normal y no realizando actos imprudentes.

 Principios básicos de la bioseguridad: (en laboratorios con muestras biológicas)

1. Universalidad: debemos asumir que todo organismo vivo puede ser portador de
un agente infeccioso.
2. Uso de barreras protectoras, para disminuir o evitar el contacto con líquidos o
materiales potencialmente infectados.
- Los factores potenciales de riesgo derivan de las materias primas (muestras
biológicas), la infraestructura (el laboratorio y sus materiales o maquinaria)
y las conductas humanas.
- Debemos utilizar elementos de protección como: bata, guantes, gafas,
mascarilla, extintores, lavaojos, mamparas de protección y de extracción de
gases. Además, debemos seguir unas medidas universales de protección
comunes a todos los laboratorios y en el momento de trabajar en uno
debemos aplicar estas medidas más las propias de dicho laboratorio:
1. Lavado de manos: tras realizar cualquier tipo de contacto con muestras u objetos
que han estado en contacto con fluidos o del suelo.
 Prelavado con agua y jabón
 Limpieza de uñas
 Aclarado
 Secado con papel o al aire
 Cierre del grifo con el papel de secado
 2. Barreras protectoras:
 Primarias: son los equipos de protección a nivel individual o personal (EPI o
EPP), guantes de látex o de nitrilo que protegen contra virus, mascarillas,
gafas de protección frontal y lateral, bata hasta las rodillas y siempre
abrochada, calzado cómodo y cerrado, evitar llevar joyas, uñas largas y el
pelo suelto.
 Secundarias: medidas de protección del propio laboratorio como rejillas de
ventilación, desagües…)
3. Objetos punzocortantes:
 Agujas y jeringuillas: debemos evitar dejar agujar en la mesa, no tirarlas a la
basura común, no meterlas en los bolsos de la bata.
 Bisturíes: después de usarlo debemos lavarlo y desinfectarlo con solución de
lejía al 1% para guardarlos en cajas rígidas y así evitar cortes por contacto o
roce.
4. Trabajar en ambientes seguros
 Evitar colocar los elementos cáusticos y ácidos en baldas altas de las
estanterías para evitar derrames o caídas
 Usar equipo de protección al manipular ácidos o alcalinos
 No pipetear con la boca…
5. Adecuada eliminación de desechos
6. Uso de señalización

 Niveles de bioseguridad: es el conjunto de normas que han de cumplir los

laboratorios en los que se manipulan microorganismos infecciosos, muestras de
tejidos humanos o animales de laboratorio. En cada nivel tendremos en cuenta los
tipos necesarios de barrera que se adapten a dicho nivel: primarias (equipos de
protección), secundarias (instalaciones) y terciarias (contención del edificio).
 Hay 4 niveles:
 Nivel 1. Manipulación de agentes que no producen enfermedad en adultos
sanos. El acceso a laboratorio no es restringido, no se requiere equipo
 especial, el personal debe estar supervisado por profesionales cualificados y
protección básica. Barreras primarias y secundarias.
 Nivel 2. Agentes patógenos en el hombre. El personal debe tener experiencia
con el manejo de patógenos, acceso restringido, precauciones en cuanto a
objetos punzocortantes contaminados, cuentan con gabinetes preparados para
trabajos biológicos, requieren supervisión y protección adecuada. Barreras
secundarias.
 Nivel 3. Agentes patógenos con potencial de transmisión por aerosol.
Laboratorio con diseño y características especiales todo se realiza utilizando
vestimentas y equipos de protección. Se debe ventilar el aire con flujo de aire
direccional controlado, presión negativa y filtros HEPA. Acceso restringido,
cuenta con duchas y puntos para dejar la ropa que se usa en el laboratorio y
esta sea lavada tras su uso y todos os procedimientos se realizan en cabinas
de seguridad biológica. Barreras primarias y secundarias.
 Nivel 4. Agentes peligrosos o patógenos con un alto riesgo de enfermedad,
con transmisión por aerosol o por medios desconocidos. Alto riesgo debido a
la exposición a patógenos, el personal muy cualificado y entrenado en el
manejo de estos agentes, uso de trajes especiales que cubren todo el cuerpo,
mantienen una presión de aire negativa para evitar que los agentes nocivos
escapen al ambiente además de trabajar siempre en cabinas de protección
Biológica. Barreras primarias y secundarias.
- Buenas prácticas de laboratorio: son un sistema de calidad que involucra
a la organización de un laboratorio de investigación. Dicho sistema
establece las condiciones bajo las cuales se planifican, realizan, controlan,
registran, archivan e informan los estudios realizados por un laboratorio.
Las BPL forman parte del trabajar con calidad y cubren aspectos sencillos
del trabajo diario en el laboratorio que deben documentarse.
Los objetivos de las BPL son:
 Mantenimiento de la infraestructura
 Registros
 Manejo y disposición de muestras
 Control de reactivos y limpieza del material de vidrio del laboratorio
En el desarrollo y documentación de las BPL debemos considerar: los aspectos que
puedan afectar a la precisión y la influencia que estos tienen en la desviación de los
resultados.
Ante esto tenemos dos tipos de factores que afectan a los resultados:
1. Factores inherentes a la metodología (objetos que utilizamos en las prácticas y
tienen cierto margen de error)
2. Factores resultantes de cómo se aplica dicha metodología

 Normas generales de uso del laboratorio:

 Antes de realizar cualquier práctica debemos leer el guion de dicha práctica.
 Al entrar al laboratorio obedecer al profesor y dirigirnos a nuestro sitio asignado
con nuestro material previamente seleccionado y dispuesto en nuestro puesto de
trabajo por el profesor.
  Evitar desplazamientos innecesarios por el laboratorio
 Antes de comenzar la práctica asegurarnos de que contamos con todo el material
necesario para llevarla a cabo. Evitar tener material innecesario en la meseta de
modo que este dificulte nuestro trabajo.
 Manejar los productos, reactivos, ácidos, microscopio con cuidado y si tenemos
dificultades consultar siempre en primer lugar al profesor. Todo el material que
se deteriore por el mal uso, bajo criterio del profesor, será reemplazado por el
alumnado que ha sido responsable de dicho deterioro.
 Al usar portaobjetos o cubreobjetos tomarlos de los lados para evitar mancharlos
o contaminarlos para las futuras muestras que depositemos o cubramos con
ellos.
 No arrojar cuerpos sólidos a los fregaderos ni materiales poco solubles y siempre
verterlos en el fregadero con el grifo previamente abierto.
 No mantener mecheros o las luces de los microscopios encendidos si no se están
usando.
 Tras terminar debemos limpiar, ordenar y desconectar aparatos para dejar todo
tu puesto de trabajo listo para otro.
 Por último, lavar las manos

6. RADIACIONES IONIZANTES:
 ¿Qué es son las radiaciones ionizantes? Y sus tipos
 La radioactividad es la desintegración espontánea de átomos inestables
denominados radionucleidos y la energía excedente emitida de dichas
desintegraciones es radiación ionizante.
- Radiación α
- Radiación β
- Radiación γ
- Rayos X
-Radiación de neutrones
 Conceptos y términos básicos
 Actividad: toda la energía emitida por un isótopo radioactivo hacia un objeto u
organismo
 Dosis absorbida: la cantidad de radiación recibida por el cuerpo u organismo
desde el isótopo
 Dosis equivalente: el daño biológico que produce la radiación en el organismo o
cuerpo y depende del tipo de radiación (α, β, γ …)
 Dosis efectiva: daño biológico real que sufre la zona concreta del organismo
cuerpo que ha sido alcanzado por la radiación
 Terrestres
Naturales
Cósmicas

Fuentes Centrales nucleares

radiactivas

Medicina
Artificiales
Investigación

Industria

 Fuentes naturales cósmicas: a medida que nos vamos alejando de la superficie

terrestre los niveles de radiación recibidos aumentan. Estos niveles se miden
en MiliSieverts (Sv)
 Fuentes naturales terrestre: viene producida por isótopos radioactivos que se
encuentran en el interior de la corteza terrestre y nosotros accedemos a ellos a
través de nuestra alimentación, bebida y en suspensión en el aire. Radón altas
concentraciones en nuestro país en función de la zona.
Los isótopos radiactivos más peligrosos para los organismos son aquellos que
tengan una semivida más larga ya que el organismo estará más tiempo
expuesto a esa radiación.

 Medidas de protección radiológica:

 En centros de trabajo donde hay gente expuesta a radiación alta deben hacer
primero un estudio para poder establecer unas medidas de protección extra para
los trabajadores en función de la exposición que éstos tengan a la radiación.
1. Se clasifican los trabajadores según el trabajo que desempeñen y la exposición
que éstos tengan a la radiación en función a su puesto de trabajo
2. Se distribuyen y clasifican los puestos de trabajo en diferentes zonas
3. Se aplican las normas y medidas de control en función de las zonas de radiación

 La máxima radiación anual permitida para la industria son 50 Sieverts. En

función de la categoría de los trabajadores de dichas empresas deberán tener un
material u otro de protección.
- Categoría A:
Deben llevar una dosimetría personal individual y otra en la sala de trabajo
 De forma mensual se les realiza una lectura y registro de la radiación
acumulada
Se les realiza una revisión médica anual
Controles de contaminación interna en base al riesgo que sufran ante la
exposición y la instalación en la que se encuentren
- Categoría B:
Una lectura y un registro dosimétrico anual
Una revisión médica anual
Controles de contaminación interna si se cree que pudieran estar expuestos a
esa radiación
 Aplicaciones médicas de las radiaciones ionizantes:
 Radiodiagnóstico:
- Radiografía convencional: 2D e imágenes estáticas
- Fluoroscopía
- Tomografía Axial Computerizada: 3D e imágenes estáticas

 Radioterapia: usa partículas similares a las de los rayos X pero con una mayor
energía capaz de penetrar en el cuerpo se utiliza para tratar el cáncer ya que
actúa sobre el tumor destruyendo las células malignas e impidiendo que crezcan
y se reproduzcan.
 Medicina nuclear: basado sobre todo en pruebas del tracto intestinal o del
estómago y para ello las personas deben tomar un control que no es más que un
contraste que no es más que un radiofármaco el cual contiene uno o más átomos
radioactivos ligados a una molécula transportadora esto es ingerido por el
paciente y se va observando el avance de estos átomos radioactivos debido a la
radioactividad que liberan a medida que van avanzando por el tracto intestinal
para poder detectar si hay estrechamientos o demás problemas
 Radioinmunoanálisis

 Aplicaciones en la agricultura
 Se radian los suelos o campos de cultivo para mejorar la producción, así como
también se irradian los productos que se obtienen de la tierra para mejorar la
conservación de dicho alimento.

 Aplicaciones medioambientales
 Se utiliza la radiación para erradicar plagas, detectar la calidad de aguas
subterráneas, conocer la calidad de los suelos y estimar cálculos sobre la
contaminación del aire y del agua.
 Efectos biológicos
 Puede ser de dos modos:
 Acción indirecta sobre la célula:
Al no actuar directamente sobre la célula actúa sobre la molécula que más
abundante es en los organismos vivos, el agua. La interacción con el agua da
como resultado, radicales libres. Son altamente reactivos y crean daños en el
organismo dado que estas moléculas son muy inestables y tienden a oxidar a
otras moléculas como proteínas haciendo que pierdan funcionalidad llegando a
producir lecciones en la célula.
 Acción directa sobre la célula:
En este caso de la radiación interactúa con macromoléculas como ADN, ARN o
proteínas; ionizandolas y dando lugar a moléculas alteradas. Tiene como
resultados daños en el ADN siendo éstos los que tienen mayor transcendencia
biológica porque esta es la molécula que guarda la información para un correcto
funcionamiento celular y la cual se transmite a la descendencia.

Irradiación
Externa
SIn contacto con la
SOL
fuente de radiación
Inhalación
Efectos biológicos Externa AEROSOLES O GASES
PIEL
Contaminación
Ingestión
Interna

Penetración

HERIDAS DE LA PIEL

 Radiotoxicidad:
 toxicidad debida a las radiaciones ionizantes emitidas por un radionucleido
incorporado al organismo o por los productos resultantes. Depende de las
características radiactivas del isótopo inestable, de su estado físico químico y del
metabolismo del organismo.
 Esta radiotoxicidad se ve reducida si la semivida del isótopo es corta por tanto se
elimina rápido del organismo también si la energía desprendida por el isótopo no
es muy grande o si el organismo es capaz de metabolizar dicho radionucleido.
 En base a si afecta a la célula directa o indirectamente los efectos serán distintos.
Los dividiremos en dos grupos:
 1. Somáticos:
A corto plazo: enrojecimiento de la piel o muerte del organismo
A medio plazo: efectos retardados como el cáncer
2. Genéticos:
A largo plazo: ya que solo los podemos ver en la siguiente generación
debido a que se transmiten a la descendencia

 Métodos de protección radiológica

 Sabemos que vamos a trabajar con isótopos radiactivos buscaremos
radionucleidos que tengan una radiotoxicidad menor
 Debemos establecer zonas concretas de trabajo para mantenerlas observadas y
poder medir los niveles de radiación que genere dicho isótopo.
 Debemos proporcionarnos equipo y material apropiado, así como dosímetros
personales y dosímetros que registren los niveles de radiación de la sala de
trabajo.
 Para poder trabajar con este tipo de materiales se deben de cumplir una serie de
pautas establecidas por un comité internacional de protección radiológica:
- Cuando queremos utilizar isótopos radiactivos debemos justificar el uso que
les queremos dar y proponer métodos alternativos para evitar el uso de ellos
y solo utilizarlos como alternativa final
- Se debe cumplir que todas las exposiciones ante dicho isótopo deben tener
las dosis de radiación más bajas posibles y también se cuenta con la
limitación de que la suma de las dosis recibidas no debe sobrepasar los
límites
- No se puede tener o usar materiales o equipos radiactivos sin autorización
además son obligatorios unos medios de protección radiológica y deben ser
usados en cada tipo de instalación donde se tenga materiales o equipo
radioactivo
- Se establecen y señalan unas zonas específicas de posible riesgo en varios
niveles: de libre acceso, vigilada y controlada.
7. LA REDACCIÓN CIENTÍFICA
 Es necesario publicar nuestros hallazgos en el mundo de la ciencia, para así
continuar con el progreso y desarrollo de nuevas ideas y evitar la duplicidad de
esfuerzos o despilfarrar tiempo realizando experimentos, para los que otros ya
habrían podido encontrar conclusiones y respuestas. Además, al publicar
podemos ver diferentes puntos de vista y seguir trabajando en nuevas
investigaciones a raíz de la que ya está publicada

 Es necesario que un científico escriba y publique:

 El trabajo científico completo hasta que se publiquen los resultados
 Los artículos científicos son una parte esencial del proceso de investigación, así
que es tan básico hacer la investigación, como escribir los resultados de manera
correcta exacta y clara.
 Las palabras que se utilicen deben considerarse con tanto cuidado y precisión
como el que sea utilizado a la hora de realizar los experimentos en el laboratorio.
 El investigador debe aprender a usar las palabras y no llegará a estar plenamente
formado hasta que no alcance la capacidad de publicar su trabajo
 Para publicar un artículo científico de manera correcta se deben de seguir las
pautas de la redacción científica ya que el único propósito de los artículos de
investigación es informar sobre los resultados de una investigación.

 Tipos de redacción científica:

 Trabajo bibliográfico
  Trabajo fin de grado/máster
 Tesis doctoral
 Artículo científico
 Notas de prensa
 Resúmenes de conferencias
 Comunicación oral o paneles en conferencias
 Informes técnicos o libros

 Artículos científicos
 ¿Qué es un artículo/documento científico?
- Es un informe escrito y publicado, que describe resultados originales de una
investigación. Además, debe ser preciso claro y breve.

 ¿Cuál es la estructura de un artículo científico?

- Introducción: donde se explica de forma breve que se estudió o cuál es el
experimento central de este artículo
- Métodos: ¿cómo se estudió? o ¿cómo se llevó a cabo dicha investigación? y
los materiales o programas empleados
- Resultados: se explica y concluye con los hallazgos de nuestro estudio
- Discusión: se interpretan, discuten y analizan los resultados obtenidos

 ¿Cuáles son las reglas de un artículo/documento científico?

1. Enunciar resultados; No es una obra aislada ya que se apoya en
documentos anteriores como contexto de partida y a la vez se obtienen
resultados que podrán ser la base de documentos posteriores
2. Ser arbitrado o revisado; Los artículos antes de su publicación deben pasar
por un proceso de estricta revisión antes de ser aceptados para publicar
3. Responder a pautas convencionales; La estructura, el lenguaje y los
procedimientos seguidos para cada artículo deben basarse en convenciones
métodos y costumbres internacionales que son propias a cada rama del
conocimiento.
 Tenemos 3 tipos de artículos de investigación:
1. Trabajo original: se plantea o desarrolla una hipótesis o problema
2. Caso clínico: en este se reconoce un fenómeno como raro o no descrito
3. Revisión de tema: este documento interpreta y ensambla literatura científica
ya publicada

 Estructura de un artículo científico:

- Título: debe ser fiel al contenido, llamar la atención del lector y no contener
más de 15 palabras
- Autores: mencionaremos un máximo de 6 autores en orden de importancia,
en base a la participación en el artículo
- Lugar: debemos identificar la institución o instituciones donde se ha
realizado el trabajo
 - Resumen o abstract: es una de las partes más importantes del artículo
donde se sintetiza la información de todas las partes del documento, no debe
sobrepasar las 300 palabras
*No en todos los trabajos científicos se utilizan abreviaturas. En este caso, debemos
incluir una hoja o un documento donde expliquemos qué significa cada abreviatura.
Haremos una lista en orden alfabético para poder incluir una abreviatura en un texto. La
primera vez debemos poner la palabra completa y a continuación, entre paréntesis, dicha
abreviatura para poder seguir utilizándola a lo largo del texto.
 Distintas secciones de un documento científico:
1. Introducción: (1 pág.) debe responder a la pregunta de porque empezaste a
realizar este trabajo y el propósito de la introducción es resumir el contenido del
estudio y establecer los objetivos e hipótesis claramente.
- Deberá incluirse toda la problemática a tratar incluso lo escrito por otros
autores el objetivo y la hipótesis de nuestro trabajo
- en ella debemos considerar el propósito el conocimiento actual y la
importancia de nuestro tema
2. Métodos: (2-3 págs.) debe responder a la pregunta de qué fue lo que hiciste y el
propósito de los métodos es aportar suficientes detalles para poder repetir el
estudio.
- Se deben explicar los procedimientos seguidos para realizar el estudio con
lujo de detalles. Con el fin de que estos se puedan replicar en un futuro sí se
quiere repetir el experimento.
- Se debe explicar con detalle el proceso y además utilizar métodos conocidos
para aportar más valor y fiabilidad a nuestro documento científico
a. Diseño del estudio: para seleccionar el diseño del estudio se procederá
con la técnica de enmascaramiento; consta de 3 fases: simple ciego,
doble ciego o triple ciego. En el simple ciego el científico sabe qué tipo
de tratamiento está suministrando a la población, pero los sujetos de
dicha población no lo conocen por tanto pueden recibir un placebo o un
medicamento. En el doble ciego tanto el investigador como el sujeto
desconoce el tratamiento con el que va a proceder. En el triple ciego
tanto el análisis como la evaluación de los datos se hace sin conocer la
identidad de los grupos.
b. Definición de la condición a estudiar: aquí se debe explicar la
enfermedad qué queremos tratar y el tiempo que vamos a estar realizando
el experimento a los individuos de nuestra población
c. Definición de la población: debemos explicar el tipo de individuos, el
sexo y la presencia ausencia del efecto que estamos estudiando.
d. Selección de los sujetos del estudio: debemos explicar de dónde
proceden los sujetos, cómo hemos captado esos sujetos, la técnica de
muestreo que hemos podido realizar para atraerlos hacia nuestro
experimento y los criterios que hemos seguido de inclusión o exclusión
para seleccionar a la población de nuestro estudio.
 e. Tamaño de la muestra: debemos razonar el número de sujetos
necesarios y el tamaño de la población con la que partimos.
f. Explicación detallada de las intervenciones: debemos explicar el tipo
de tratamiento que hemos suministrado a nuestra población y mencionar
las pautas de administración del fármaco, hormonas o agentes químicos
la vía, el número de dosis, la duración del tratamiento…
g. Definición de las observaciones: debemos explicar la variable estudiada
en nuestro experimento y el método usado para poder obtener los
resultados
h. Procedimientos estadísticos: “resultados no significativos equivalen a
resultados no demostrados”. Si hemos realizado varias pruebas debemos
de mencionar en qué parte del artículo se utilizó cada una, si son pruebas
de uso frecuente se describe la primera vez y las siguientes se
mencionan, debemos mencionar el paquete estadístico utilizado y el nivel
de significación.
3. Resultados: (2-3 págs.) debe responder a la pregunta de qué fue lo que hallaste
y el propósito de los resultados es describir la muestra y utilizar los análisis
adecuados para contrastar las hipótesis.
- Se debe mostrar si los datos obtenidos apoyan o no a la hipótesis planteada
previa a la investigación. Esta parte es una de las más importantes del
documento ya que en ella se centra lo principal y la sustancia que nos
permite aceptar o rechazar la hipótesis que nosotros habíamos propuesto.
a. ¿Qué datos incluir?: Debemos incluir hechos observados y
comprobados y estos deben estar en relación con el material de estudio.
b. ¿Para qué se ofrecen los datos?: Se muestran en tablas o gráficos para
posteriormente poder interpretarlos.
c. ¿Cómo se ofrecen los datos?: De forma clara y concisa incluyendo solo
la información trascendente y representativa.
4. Tablas y figuras: (3-6 formas) debe responder a la pregunta de que muestra los
resultados y el propósito de las tablas y figuras es clarificar los resultados.
5. Discusión: (2-3 págs.) debe responder a la pregunta de qué es lo que significa y
el propósito fusión es interpretar los hallazgos en el contexto de la bibliografía
adecuada.
Primero debemos mencionar los lugares de donde hemos obtenido la
información externa a nuestro trabajo, así como indicar cada keyword para dar
con esos artículos. Además, debemos mencionar el filtro que hemos utilizado en
base a la antigüedad de los artículos el idioma en el que está escrito el tema
central del que trata para poder explicar con cuáles nos hemos quedado
finalmente. En este apartado se busca interpretar todos los datos recopilados a lo
largo del documento. Podemos empezar con un resumen del campo de
investigación central de nuestro documento. Detallamos los resultados que
hemos obtenido comparándolos con resultados obtenidos en estudios de otros
investigadores y esos resultados pueden ser en contra de nuestros hallazgos o
que confirmen nuestros hallazgos. Debemos incluir un párrafo final de
conclusión donde se destacan los hallazgos principales de nuestra investigación
y siempre con aportaciones positivas del artículo ya que si el lector llega al final
 y solo le disculpas del autor por aportar poco con su documento resulta
decepcionante y da mala imagen
- Hay que aportar nuestro punto de vista y aportar nuestra opinión
6. Referencias: (20-35 citas) debe responder a la pregunta te que más se ha
investigado en este campo y el propósito de las referencias es citar la literatura
más reciente y relevante.
Sistemas de referencia hay 3 tipos: autor-fecha (Harvard-APA , numérico
(Vancouver) y autor-título
Extensión total del documento (12-20 págs.)

Fisiología vegetal
Homogeneización y extracción
 Queremos extraer de un tejido o conjunto de células una o varias moléculas para su
posterior análisis”. Por lo tanto, el proceso de extracción deberá permitirnos obtener
la mayor cantidad de moléculas, con la mayor pureza posible, a la vez que
preservamos su integridad estructural y, si es requerida, funcional.
 ¿Qué tipo de biomoléculas podemos querer purificar?
- Metabolitos: primarios como el almidón, celulosa, aminoácidos y secundarios
como alcaloides terpenoides, esteroles, fenoles.
- Ácidos nucleicos: DNA genómico, DNA plasmídico, DNA mitocondrial, RNA
mensajero, RNA ribosómico y RNA regulador.
- Proteínas: totales, específicas a un orgánulo o ara recuperar una actividad
enzimática específica.
- Otros: determinar valores de pH, Redox…

 Particularidades de los tejidos vegetales.

Las extracciones vegetales pueden llegar a considerarse más complicadas dado a:
- La dureza del tejido (homogeneización)
- La presencia de pigmentos y oxidantes
- Presencia de azúcares Soluciones y
- Gran cantidad de enzimas líticas en el peroxisoma y pequeñas vacuolas protocolo de
liberadas durante a extracción extracción

 Técnicas más empleadas en biología vegetal

1. Homogeneización mecánica: pulverización de muestras en mortero
- Las muestras se trituran en un baño de Nitrógeno líquido (-196 C). La baja
temperatura cristaliza las muestras, lo que permite su pulverización.
- La baja temperatura bloquea cualquier actividad enzimática, evitando la
degradación de las muestras si bien pueden desnaturalizarse (levemente) algunas
proteínas.
- Paso estándar en la extracción de biomoléculas con fines ómicos.
 - Rotura basada en el impacto con bolas metálicas o de vidrio. Este sistema se
puede emplear para pulverizar muestras, previamente congeladas en N2 líquido o
para extraer compuestos en una solución de extracción.
- La agitación produce un calentamiento de las muestras. Generalmente hay que
enfriarlas cada 8-10 segundos de molienda.
- Muy útil para romper tejidos vegetales duros (madera, raíz, algunos tipos de
yemas) o células vegetales con pared gruesa.
 Politrones: Sistemas rotor-estator
El sistema consiste en un rotor que gira a alta velocidad dentro de un
cilindro fijo perforado (estator). Estas perforaciones permiten el flujo de
muestra a través del homogeneizador.
Puede controlarse la velocidad de giro del rotor empleandose velocidades
altas para la total ruptura celular y velocidades más bajas para preservar
orgánulos.
Muy útil en tejidos vegetales no muy duros.
 Prensa de French
El sistema consiste en una célula de presión formada por un cilindro y un
émbolo de acero, una prensa hidráulica, y un pequeño orificio acoplado a
una llave o válvula.
Las células explotan debido a los cambios de presión que se producen al
abrir la llave.
Se utiliza en cultivos de microalgas, protoplastos, o células. No es útil
para tejidos.
 Baños y sondas de ultrasonidos
Aplicación de ultrasonidos a suspensiones celulares, de orgánulos, o
incluso de fracciones (i.e. tilacoides).
Se puede aplicar a volúmenes variables de muestra (5µL-1L), en función
del empleo de un baño o de una sonda.
Genera mucho calor, las muestras deben refrigerarse frecuentemente.
Ejemplos de otros usos: Solubilización y limpieza de proteínas.
Fraccionamiento inespecífico de ácidos nucleicos.

 Fraccionamiento celular
- Por fraccionamiento celular se entienden una serie de técnicas basadas en la
ruptura de las células y la separación orgánulos o moléculas en función de sus
propiedades biofísicas. Este fraccionamiento puede ser total (recuperamos todos
los orgánulos en distintas fracciones) o parcial (recuperamos solo aquellos que
nos interese analizar). En función del tipo de recuperación deseada se emplearán
unos u otros métodos.
- Si queremos recuperar un solo tipo de orgánulos la estrategia es más sencilla
Ejemplo de extracción de núcleos:
1. Se homogeneizan las células a intensidad baja. Solo queremos romper
membrana celular y pared.
 2. Una vez homogeneizado, añadimos detergente, a una concentración que va a
romper cloroplastos y mitocondrias, pero no núcleos. Tras varios lavados
obtendremos una fracción nuclear más o menos limpia.
3. El empleo de un gradiente de densidad nos permitirá separar nuestros núcleos de
los contaminantes que aun queden en la muestra
 Fraccionamiento celular: gradiente de densidad
- Esta estrategia se basa en la creación de un gradiente empleando un densificante
(sacarosa, ficoll, percoll ) el cual se define superponiendo capas a concentración
decreciente.
- Por ejemplo, un gradiente de sacarosa puede consistir en una capa al 70%, otra al
30% y otra al 10% (esto varía en función del orgánulo o molécula a purificar).
- La muestra se coloca en la parte superior del gradiente, y se centrifuga a elevadas
rpm. Las partículas atravesarán el gradiente hasta que alcanzan un punto en que
su densidad se corresponde con la capa que los rodea (o esta es menor que la
siguiente capa). La fracción podrá ser purificada y analizada

 Solución de extracción
- La solución de extracción ha de permitir una correcta solubilización de la
partícula problema, a la vez que la preserva de cualquier tipo de alteración que
pudiese ocurrir durante el proceso extractivo (oxidaciones, digestiones, rupturas).
- Principales componentes de las soluciones de extracción:
1. Solvente (agua, metanol, cloroformo, diclorometano, acetonitrilo…)
2. Tampón (cada molécula requerirá un rango de pH específico para ser estable)
3. Detergentes (necesarios para la correcta solubilización de proteínas y membranas)
4. Antioxidantes (DTT, Beta-mercaptoetanol,…)
5. Quelantes (EDTA, EGTA,… capturan iones metálicos bivalentes. Protegen
ácidos nucleicos al inactivar las nucleasas mediante la captura de su cofactor.)
6. Sal (NaCl, KCl, necesaria para la precipitación de ácidos nucleicos)
7. Agente caotrópico(sales de guanidina, urea,. Desorganizan la red tridimensional
del agua que rodea a las macromoléculas, afectando las interacciones no covalentes
y ayudando a solubilizar proteínas y ác. nucleicos. Permite los puentes salinos)
8. PVP o PVPP (requerido para secuestrar y eliminar polifenoles y otros pigmentos)
9. Inhibidores específicos (inhibidores de nucleasas, fosfatasas, proteasas, etc.
1 Solventes
El solvente universal para la mayor parte de las extracciones es el agua. No obstante, en
determinadas situaciones se deberán emplear otro tipo de solventes:

- Solventes orgánicos no-polares: Hexano; extracción de lípidos

- Solventes orgánicos polares apróticos: Acetona; extracción de met. Secundarios,
precipitación de proteínas, Acetato de etilo; extracción de metabolitos
secundarios, Acetonitrilo; solubilización de proteínas, metabolitos secundarios y
DMSO; solubilización
 - Solventes orgánicos polares próticos: Etanol Metanol Propanol Isopropanol
(extracciones de metabolitos, proteínas, y ácidos nucleicos)
2 Tampones
El mantenimiento del pH durante el proceso de la extracción puede ser crítico, por lo
que el empleo de tampones es recomendable. La elección de tampón dependerá del
rango de pH que queramos mantener, así como de su compatibilidad con nuestro
protocolo de extracción.
3 Detergentes
Los detergentes son moléculas anfipáticas. Sus grupos polares forman puentes de
hidrógeno con el agua, y sus partes apolares interacciones hidrofóbicas. En
consecuencia ayudan a solubilizar (membranas, proteínas,…). Además, al reducir la
tensión superficial del agua actúan como surfactantes.
Tipos:

- Detergentes Iónicos (aniónicos, catiónicos). SDS, detergente aniónico,

desnaturalizante CTAB, detergente cationico.
- Detergentes No iónicos (Triton X100, NP40), ambos son no-desnaturalizantes
- Detergentes zwitteriónicos (i.e. CHAPS, CHAPSO), también son no
desnaturalizantes
- Sales biliares (i.e. Ác. Desoxicólico): aislamiento de membranas, proteínas de
membranas, etc.
4 Sales caotrópicas y otros agentes desnaturalizantes
La desnaturalización es un proceso por el cual las proteínas y ácidos nucleicos pierden
su estructura funcional (cuaternaria, terciaria). Implica la ruptura de enlaces covalentes
(puentes disulfuro), enlaces no covalentes dipolo-dipolo, y fuerzas de Van der Waals.
Las sales caotrópicas son compuestos que desorganizan la red tridimensional del agua, a
través de los puentes de hidrógeno, afectando a su interacción con otras
macromoléculas. También afectan a otras uniones intramoleculares no covalentes

- Compuestos caotrópicos: Urea, Sales de guanidinio (Cloruro, Tiocianato)

- Compuestos reductores (DTT, 2-mercaptoetanol)
- Detergentes (SDS)
- Algunos ácidos, compuestos alcalinos o solventes orgánicos también pueden
ejercer de agentes desnaturalizantes
5 Enzimas e inhibidores
La adición de determinados tipos de enzimas a la solución de extracción podrá mejorar
el rendimiento final de la misma.

- Proteasas (Proteinasa K, tripsina)

 - Digestión de pared (celulasa, macerozima)
- Ácidos nucleicos (RNasa, DNasa)

Del mismo modo podremos emplear inhibidores específicos cuando deseemos proteger
una biomolécula específica. Empleando inhibidores de RNasas, de Proteasas, de
fosfatasas, etc. Uno de los inhibidores más empleados en la extracción de ácidos
nucleicos es el EDTA. Este compuesto es un quelante, es decir, va a unirse a cationes
metálicos bivalentes. Estos cationes son cofactores de las nucleasas. Al retirar del medio
a los cofactores, la actividad de las nucleasas se reduce.
6 Antioxidantes y otros compuestos
Los antioxidantes van a prevenir la oxidación de las muestras debido a su alta capacidad
reductora. Esto es especialmente importante en muestras vegetales, puesto que algunos
pigmentos tienen tendencia a unirse de forma covalente a ácidos nucleicos y proteínas.
Los antioxidantes más comúnmente empleados son el 2-mercaptoetanol y el Ditiotreitol
(DTT). Concentraciones altas desnaturalizarán las proteínas, pero a baja concentración
preservarán la oxidación de residuos sulfidrilo.
A la solución de extracción se le podrán añadir sales (>3M NaCl reduce la
solubilización de azúcares). El cloruro de litio se emplea para precipitar el RNA o en
gradientes de densidad. Otros compuestos pueden ser necesarios para la estabilidad de
moléculas particulares o para mantener la actividad enzimática (i.e. Espermidina como
estabilizante del ARN).
 Soluciones de extracción clásicas

 Extracción dedicada, ejemplo de extracción de ADN

- El objetivo de una extracción dedicada es la purificación de una molécula. Es
decir, obtener una fracción lo más enriquecida posible. En caso de no obtener
 unos mínimos, esta fracción podrá ser purificada mediante otras técnicas
(cromatográficas, electroforéticas, etc.
1. Ruptura de las células. (Nitrógeno líquido)
2. Adición de solución de extracción con tampón, detergente, DTT, RNasa A,
EDTA y NaCl
3. En este momento tendremos DNA en solución además de pigmentos, proteínas,
azúcares y restos celulares.
- Alternativas para obtener ADN más puro sin tantos restos: tendríamos que
capturar nuestro ADN de la solución e ir eliminando poco a poco las otras
moléculas.
1. Adición de solución de extracción
2. Lavado con fenol: cloroforomo: IAA consigue que el ADN se mantenga en la
fase acuosa, mientras que en la fase orgánica lavaremos los pigmentos, y las
proteínas que serán disueltas por el fenol o desnaturalizadas por el cloroformo en
ambos casos son retiradas de la fase acuosa.
3. En este momento tendremos DNA en solución, mucho más limpio, pero también
tendremos azúcares, sales y químicos de la solución de extracción

 Extracción en fase sólida: Adsorción a sílice

Las columnas de sílice permiten una rápida y eficiente purificación de ácidos nucleicos.
La solución de homogeneización ha de ser rica en sales, e incluir una sal caotrópica.
Esta sal, desestabiliza la capa de agua que recubre las macromoléculas, y permite que
los iones sodio interaccionen a la vez con sílice y con el ácido nucleico, formando un
puente salino.
 Estrategia para la extracción combinada de biomoléculas

 Análisis de biomoléculas
Colorimetría
 ¿Por qué es útil la colorimetría en biología vegetal?
 Es útil ya que cada compuesto químico interacciona de forma específica con la
luz. Por ello, podemos utilizar esta propiedad de la materia para identificar
compuestos químicos y determinar su abundancia en una muestra.
 ¿Por qué vemos los colores? Radiación electromagnética.
 La radiación electromagnética es un campo electromagnético variable que lo que
hace es transportar energía de un lugar a otro y nosotros somos capaces de
percibir los colores nosotros somos capaces de distinguir los colores debido a que
una parte de la radiación emitida es absorbida por las partículas del objeto que
estamos mirando y eso es percibido por los conos y los bastones que tenemos en
nuestros ojos. En función de la longitud de onda con la que se transmita esa
radiación percibiremos unos colores u otros.
 ¿Qué le puede ocurrir a la luz?
 Refracción se produce un cambio en la dirección de la onda al pasar de un medio
a otro
 dispersión cuando atraviesa un material las ondas de luz se separan en relación a
las longitudes de onda de cada 1 los arco iris
 difracción es un fenómeno físico y en él las ondas se desvían cuando encuentran
un obstáculo o al atravesar una rejilla
 Qué ocurre cuando la radiación atraviesa nuestra muestra
 Absorción los analíticos de la muestra absorben parte de la radiación esto es
propio de cada molécula
 Transición electrónica la luz V puede ser absorbida por los electrones de
Valencia promocionándolos a un estado excitado si la energía de la onda es la
correcta esos electrones ocuparán un orbital vacío la energía que absorben se
disipa en forma de calor o calor + fluorescencia o fosforescencia
 Emisión proceso en el que los electrones excitados vuelven al estado
fundamental emitiendo luz qué estás emisiones son radioactivas y pueden ser
fluorescentes o fosforescentes la energía de la luz emitida siempre va a ser
menor que la longitud de la onda incidente.
 Transmitancia y absorbancia
 Transmitancia óptica (T)fracción de luz incidente a una longitud de onda
definida que pasa a través de una muestra T igual AY partido de y sub cero
 Absorbancia óptica(A) grado en el que se atenúa la luz cuando atraviesa una
muestra menos logaritmo de 10 te
 Ambas son útiles en una región específica del campo electromagnético de 160 a
780 nanómetros

 Ley de Lambert-Beer
 Limitaciones de la ley de Lambert
 Limitaciones reales cuando hay altas concentraciones la distancia entre las
moléculas que van a absorber esa radiación disminuye hasta tal punto que cada
molécula altera la distribución de la carga de las moléculas vecinas
 limitaciones químicas se produce cuando el analito reacciona con el disolvente
dando lugar a productos y estos tienen propiedades de absorción diferentes a las
del analito
 limitaciones instrumentales la ley solo se cumple de forma estricta con
radiaciones monocromáticas es decir que solo poseen una única longitud de
onda y éstas en la práctica no se consiguen ya que debido a los instrumentos que
se poseen solo se obtienen radiaciones con bandas de longitudes de onda más o
menos simétricas
 Espectrometría

Monocromado
r

 Fuente de radiación
- Lámpara de Deuterio: longitud de onda corta
- Lámpara de Tungsteno: región visible
- Arco de Xenón: longitud de onda larga
 Selector de longitudes de onda: monocromadores
 Recipiente para muestra: cubetas de cuarzo sílice y plástico
 Detector de radiación: fotodiodos o fotomultiplicadores
 Tipos de espectrofotómetros
 - Haz sencillo
- Doble haz
- Diodos: la diferencia es que toda la luz que atraviesa de la muestra en lugar
de pasar por una única ranura de salida sale por un agujero dividido entre 64
a 4096 ranuras
- Fibra óptica
- Lectores de placas (UV-Vis/Fluo): capaz de medir fluorescencia
 Cuantificación de ADN y proteínas
 Medición entre la relación de absorbancia a 260 contra barra 280 nanómetros
si la pureza sale de 1,8 hacia arriba tenemos ADN puro
 Método de Bradford el reactivo aislado es rojo y cuando reacciona con
proteínas vira a azul dependiendo de la intensidad del color que tome la
muestra lo mediremos con un espectrofotómetro y detectaremos la cantidad
de proteínas que contiene nuestra muestra
 Cuantificación por fluorescencia los ácidos nucleicos y las proteínas
desnaturalizadas no presentan fluorescencia, pero son capaces de interactuar
con moléculas F dos horas produciendo así esa fluorescencia
 Clorofila
 La clorofila produce florescencia y gracias a ello se puede utilizar como
indicador del Estado fisiológico de las plantas haciendo una relación entre la
florescencia variable partida de la florescencia máxima de la planta nos indica
unos valores estando los óptimos entre 079 a 084 y los valores menores a estos
indican que la planta está sufriendo algún tipo de estrés.
Cultivo in vitro de tejidos vegetales
 Es un cultivo en un medio nutritivo, bajo condiciones estériles y controladas, de
semillas, embriones, órganos, explantos, tejidos células y protoplastos de plantas
superiores y algas. Con unas condiciones de temperatura, luz, humedad, pH…
 A partir de un cultivo celular animal no podemos obtener de manera natural un
organismo completo dado que las células se diferencian en distintos niveles y del
más complejo que alcanzan que sería las células madre no pueden volver a
niveles inferiores de manera natural por el contrario en plantas mediante un
esqueje si podemos obtener un organismo completo y esto se debe a que la
planta de manera natural puede hacer y deshacer los diferentes niveles de
diferenciación celular.
 La clave de los cultivos vegetales es la manipulación de las hormonas vegetales:
ya que el exceso de algunas de ellas provocan procesos como enraizamiento o
caulogénesis, y debemos conseguir un balance entre las concentraciones de cada
una conseguiremos obtener un callo que son masas de células no diferenciadas
vegetales.

 Conceptos de los cultivos vegetales:

 Morfogénesis se produce a partir del explanto inicial mediante la formación de
raíces o tallos en posición normal o en posición no normal (adventicia). Además,
puede ser indirecta, si se produce después de la formación de un callo, o directa
si se produce directamente del explanto.
  Embriones somáticos: estructuras bipolares que presentan las propiedades
morfológicas de los embriones zigóticos. Si los embriones vienen de un callo
son indirectos y si se forman directamente del explanto serán directos.
 Preparación del cultivo:
 Preparación de la planta madre
 Establecimiento del cultivo en condiciones de asepsia: el medio de cultivo es
semisólido y contiene vitaminas, aminoácidos, nutrientes, azúcares, pH en
función del explanto que tengamos.
 Multiplicación de brotes (micropropagación): posee ventajas ya que tenemos
una reproducción clonal, nos permite repetirlo un número ilimitado de veces, los
ciclos reproductivos son independientes del ambiente y se poden reproducir
muchas veces, además producimos pantas libres de enfermedades gracias a las
condiciones de asepsia.
 Enraizamiento: hay 2 opciones
1. Enraizando in vitro: simplemente tomamos los brotes obtenidos y los
extraemos a un cultivo libre de reguladores de crecimiento o que solo
contenga auxinas para que crezcan esas raíces y todo esto se da en la
cámara de flujo laminar
2. Enraizado ex vitro: los brotes obtenidos los transferimos a un sustrato
sólido para ello este sustrato debe estar libre de organismos patógenos y
los brotes deben tener las hojas bien desarrolladas para que puedan
desarrollar la fotosíntesis y así seguir creciendo
 Aclimatación para que se adapten a las condiciones del medio externo
 Sistemas de cultivo
 Sistema RITA: consta de un recipiente con dos cámaras una superior a una
inferior. En la inferior ponemos el medio de cultivo y en la superior el explanto
y mediante una bomba, el medio inferior líquido pasa hacia arriba y se pone en
contacto con los explantos para que reciban los nutrientes necesarios durante un
tiempo y luego se separan.
 Sistemas de biorreactores: funciona del mismo modo que el anterior, pero en
este el contacto entre plantas y medio de cultivo se van separando y uniendo,
pero de forma continua.
 Parámetros importantes
 Luz: el fotoperiodo es el tiempo que necesita cada planta de exposición a la luz
al día y ese fotoperiodo es el mismo tanto para cultivos in vitro como para las
plantas que se encuentran de forma natural en el medio externo
 Temperatura: varía en función de cada especie y esta la regulamos con lámparas
 Intercambio de gases y humedad
 Organización de un laboratorio de cultivos vegetales:
 Zona de lavado y almacenaje de vidrio
 Zona de preparación y esterilización de medios: debemos esterilizar los
explantos, recipientes, instrumentos y ambiente.
 Cámaras de cultivo: son dispositivos donde se ponen a crecer los cultivos, deben
poder controlar como mínimo fotoperiodo y temperatura.
Técnicas de cultivo celular
 ¿Por qué y para qué cultivar? In vivo vs in Vitro
 Es más cómodo cultivar células en vez de in vivo por varias razones:
- Cuestiones éticas y morales
- Dependemos de una variedad de células además de un número de células
muy amplio por organismo y cada tipo llevaría a cabo una serie de
mecanismos y procesos muy variados los cuales a nivel de organismo son
muy difíciles de aislar.
- Además, estos cultivos nos permiten desarrollar mejores técnicas referidas a
los mecanismos celulares que en un futuro podrían llegar a permitirnos
reemplazar los cultivos in vivo.
 A día de hoy, hay muchos tipos de investigaciones que se desarrollan gracias a
estos cultivos
- Descubrimiento D los genes que hacen que una célula totalmente
diferenciada pase a ser una célula madre
- Estudio en el campo de la epigenética
- Formación de órganos a partir de estudios in vitro
 Definición:
 Un cultivo celular son todas aquellas técnicas que nos van a permitir el
mantenimiento de las células in vitro manteniendo al máximo sus propiedades
fisiológicas bioquímicas y genéticas con el fin de conseguir estudiar el
comportamiento de las células animales librándolas de variaciones sistemáticas
que se darían dentro del animal en vivo.
 Remarcar la diferencia de trabajar con cultivos celulares en este caso lo que se
busca es gracias a ese cultivo conocer los mecanismos celulares y por el
contrario trabajar en cultivos celulares sería utilizar esas células in vitro para
desarrollar tú nuevos mecanismos celulares como el caso de producir órganos in
vitro.
 Historia
 Rosa Harrison considerado uno de los padres del cultivo in vitro lo que hizo
fue para un trozo de tejido de una rana ponerlo en un cultivo y de ahí
observar cómo las neuronas migraban y emitían neuritas para ponerse en
contacto con otras neuronas.
 Establecimiento de las líneas celulares: células HeLa eran células tumorales
las cuales se introducían en el cultivo y eran capaces de auto propagarse de
manera autónoma de forma infinita.

 Tipos de cultivos
 Cultivos histotípicos: un único tipo de células
 Cultivos órganotípicos: dos o más tipos celulares
 Cultivo de órganos: puede ser un órgano completo o un fragmento para
mantenerlo debemos aislarlo en una interfase líquido gas y en un ambiente
húmedo
 Cultivo de explante: poco habitual en cultivos animales y de lo que consta es
coger un trozo del tejido de un órgano y dejar que las células de éste se
propaguen por la placa del cultivo de manera autónoma
 Cultivo de disgregación: se elimina la estructura del órgano y la matriz
extracelular lo obteniendo así una monocapa de células

 Cultivos primarios: todo aquel que partiendo de un tejido disgregado

cualquier tipo de cultivo celular aislado que partiendo de un tejido u órgano
 disgregado se encuentra en una placa de cultivo antes del primer subcultivo.
Para poder obtener ese cultivo lo primero que haremos será:
1. Obtener un trozo de la muestra
2. Aislar el tejido que realmente nos interesa
3. Diseccionarlo y disgregarlo a nivel celular
4. Cultivarlo en una placa o frasco de cultivo

 Cultivo secundario: tras la expansión del cultivo primario en la placa las

células se separan de la placa y se transfieren a otra nueva con un medio
fresco creando así en su cultivo. Tras varios sub cultivos iremos obteniendo
algunas células que han conseguido sobrevivir pero también encontraremos
células muertas las cuales tenemos que retirar para que no estorben al
desarrollo de las que se mantienen tras sucesivos su cultivos iremos aislando
células inmortalizadas obteniendo así un único tipo celular y estableciendo
líneas celulares que no es más que tras sucesivos sus cultivos incluyendo
transformaciones oncogénicas bien sean espontáneas o inducidas
obtendremos células inmortalizadas que se dividen de forma continua
creando así la línea celular.

 Hay dos tipos de proliferación celular en base de como interactuan las

células con el sustrato:
 1. En suspensión: si las células se pueden llegar a desarrollar y dividirse sin
falta de interactuar y unirse al sustrato de la placa, células del sistema
inmune.
2. Adherentes: estas células son la gran mayoría y necesitan establecer
uniones con el sustrato para poder mantenerse vivas
 Morfología celular:
- Células redondeadas como linfoblasto viven pegadas al sustrato
- Células con morfología epitelial: más aplanadas las cuales pueden llegar a
expresar algún elemento de unión con el sustrato, y se van pegando unas a
otras
- Células tipo fibroblasto: con formas poligonales las cuales viven en
suspensión.
 Ventajas de los cultivos celulares
 Nos permiten un mayor control de las condiciones de medio como el pH,
condiciones de osmolaridad…
 Nos permite tener una mayor regulación sobre los procesos que se dan entre las
células, uniones, relación entre células.
 Podemos replicar cultivos de una forma sencilla así como conservarlos
congelándolos o descongelandolos de manera fácil.
 Nos permiten tener una homogeneidad la cual en los órganos o tejidos no se
obtienen ya que hay gran variedad de tipos celulares los cuales podemos aislar y
los cultivos tienden a homogeneizarse con la evolución de las células.
 También nos ayuda a trabajar a mayores escalas

 Desventajas de los cultivos celulares:

 Necesitas mucha experiencia para poder manejar bien los cultivos y tener las
condiciones de esterilidad óptimas para que estos se desarrollen ya que estos se
contaminan de forma sencilla.
- Contaminación cruzada: se prodruce cuando pipeteas de un medio a un
cultivo y en la pipeta al no tener cuidado te llevas otros tipos celulares o
restos no deseados los cuales vas adepositar en el cultivo que tienes
preparado.
 Ambiente: lograr un lugar d etrabajo muy limpio, sin mucha gente, con
condiciones de esterilidad y con puntos de eliminación de elementos biológicos
 Coste inicial debido a tener que adquirir equipamiento tanto personal como a
nivel del laboratorio
 Se pierden las condiciones propias de tejido de origen ya que al eliminar
otros tipos celuares para aislar uni concretos eliminamos la influecia de las
células vecinas también la influencia de otros tejidos sobre las células de este.
Además que estamos sometiendo a las células del cultivo a una presión evolutiva
que las fuerza para que solo sobrevivan las mejor adaptadas.
 Equipamiento, rutina de trabajo, obtención y mantinimiento de cultivos.
Técnicas de disociación.
 Equipo básico: lo más importante la campana d eflujo laminar para mantener la
esterilidad; baño termostatizado para mantener los cultivos en la temperatura
necesaria; incubador de CO2; microscopio invertido; neveras y congeladores;
 autoclave para mantener la esterilidad; microcentrífuga y depósitos de nitrógeno
líquido.
 La superficie de cultivo debe tener una cierta polaridad para permitir el anclaje
de las células y eso se consigue con un tipo de poliestileno tratado para que
función de mejor manera.
 Disgregación: para ello debemos conocer bien de donde partimos para poder
saber si hay más cartílago, tejido óseo o la abundancia de la matriz celular y los
elementos que esta contiene. Siempre tener en cuenta la biología celular.