2º Parcial

2º PARCIAL BIOTECNOLOGÍA
MICROBIANA
JORGE CARRIÓN DÍAZ

GABRIEL MANZANO RECHE
Grado Biotecnología: Biotecnología Microbiana
TEMA 9: Producción
de Ácidos Orgánicos
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INTRODUCCIÓN
Los ácidos orgánicos presentan diversos usos en la actualidad, como aditivos, en la industria química, etc.
Es importante destacar que todos los ácidos derivados del ciclo de Krebs se pueden producir en grandes
cantidades. También los derivados indirectamente (ácido itacónico), los que derivan directamente de la
glucosa (ácido glucónico) o los formados como producto final a partir de piruvato y etanol (ácido láctico y
acético).
Para sus diferentes producciones existe competencia entre producción microbiana y química:
• Ácido cítrico: microbiana
• Ácido láctico y acético: química y microbiana
• Otros: tecnología microbiana desarrollada, pero no frecuentemente implementada
ÁCIDO CÍTRICO
Se lleva produciendo a nivel industrial desde 1923; siendo actualmente el 99% de la producción dada por
fermentaciones microbianas. Usado, ordenado de mayor a menor medida, en industria de alimentos y
bebidas; farmacéutica; química; y metalurgia.
Como bien sabemos, se trata de un metabolito primario tipo II que proviene del ciclo de Krebs. Es
producido por Aspergillus Niger (cepa usada en industria, existen otras), a partir de la glucólisis de
glucosa, de donde se obtiene piruvato y entra en el ciclo de los ácidos tricarboxílicos. De esta manera
formará citrato, que va a presentar dos retroinhibiciones al nivel de piruvato quinasa (va a detener la
glucólisis, constituyendo esta retroinhibición el cuello de botella en la producción de ácido cítrico) y de la
fosfofructoquinasa (sufre retrorregulación por citrato).
Debido a esto último, requerimos de mutantes, pero en este caso trabajaremos con la cepa silvestre en
la que iremos modificando las condiciones de cultivo y seremos capaz de eliminar esas retroinhibiciones.
Entrando en materia, Aspergillus es un hongo: célula eucariota y con mitocondrias. Dicho esto, la
producción del citrato se va a producir en el interior de la mitocondria, por lo que es intracelular, pero
nosotros vamos a hacer que sea extracelular para obtenerlo por filtración. Para sobreproducir nuestro
ácido, necesitaremos tener las siguientes condiciones:
PH ÁCIDO
Se va a necesitar un pH muy ácido, en torno a 2 (1,6 - 2,2). Podríamos pensar que no es condición óptima
para nuestro hongo, y así es; pero como se trata de un metabolito primario de tipo II, nos la suda.
MEDIO DEFICIENTE EN MN2+
Este requisito, junto con el anterior (pH ácido), hacen que

el citrato se produzca extracelularmente.
Para que nuestro metabolito (citrato) sea extracelular, se
va a requerir de un transportador de malato - citrato. En
primer lugar, vamos a necesitar un precursor de citrato,
en este caso va a ser el malato, el cual proviene de la
transformación del piruvato en oxalacetato en el citosol.
Este último (oxalacetato) se va a introducir en la
mitocondria como malato, y mediante su unión con otros
precursores va a dar lugar a citrato que va a ser
transportado al exterior mitocondrial como citrato y
posteriormente al exterior celular como ácido cítrico.
Y ahora diréis porqué pollas la deficiencia de Mn2+ y el pH
ácido. Pues resulta que estos procesos de transporte se
van a ver potenciados en deficiencia de Mn2+, y el pH
ácido es debido a que se requieren protones para que el
citrato pase a ácido cítrico y pueda salir al exterior celular.
2
ALTA CONCENTRACIÓN DE NH4+
Va a servir como fuente de nitrógeno, pero hay que controlarlo para mantener el pH ácido
El paso de fosfoenolpiruvato a piruvato es nuestro cuello de botella, que es el paso que va a catalizar
piruvato quinasa
En los microorganismos que producen citrato,
entre ellos Aspergillus niger (mirar si es solo
Aspergillus o también los otros), vamos a
encontrar un conjunto de reacciones
anapleróticas que hacen que el fosfoenol
piruvato pase al ciclo de Krebs sin tener que
pasar a piruvato, eliminando ese cuello de
botella que nos limitaba.
Como vemos en la imagen, gracias a la
presencia de determinadas enzimas vamos a
ser capaces de llevar a cabo este tipo de
reacciones, pasando de fosfoenol piruvato a
oxalacetato sin pasar piruvato, y, por lo tanto,
sin utilizar piruvato quinasa que era el punto
flaco de nuestro proceso (como Hazard en el
Real de Madrid).
La enzima fosfoenolpiruvato carboxiquinasa es la que depende y se potencia con el NH4+ y es la que nos
va a permitir este proceso, de ahí a que se use altas concentraciones de NH4+ a pesar de que esta molécula
alcaliniza el pH.
OTRAS REACCIONES ANAPLERÓTICAS

Otras reacciones anapleróticas son la de PEP carboxilasa y la del ciclo del glioxilato, que ya no tienen nada
que ver con la alta concentración de NH4+, pero me la coméis porque no se dónde meterla.
Para aprovechar el citrato que se pierde, el ciclo del glioxilato es un atajo del ciclo de Krebs, en el que el
citrato pasa a malato que es un precursor del citrato. Es decir, que el poco citrato que se gasta es
transformado en nuevos precursores de citrato.
Este ciclo del glioxilato hay que inducirlo y no lo tienen muchos microorganismos, este se activa cuando
hay poca concentración de glucosa. Esto se produce cuando estas al final del proceso ya que al principio
la concentración de azúcares será alta, lo que nos indica que este citrato es un metabolito primario de
tipo II, ya que en estas condiciones Aspergillus no va a estar creciendo a velocidad máxima
La adición de acetato o n-alcanos como fuente de C en ausencia de glucosa va a producir la inducción de
este proceso.
ALTA CONCENTRACIÓN DE AZÚCAR
Se va a requerir una alta concentración de azúcar, entorno a 120 - 250 g/L, que va a tener dos funciones
principales:
• Va a activar la producción de Fructosa 1-6 Bifosfato, eliminando la retroinhibición sobre la
fosfofructoquinasa que ya no se inhibe por el citrato y la otra retroinhibición la anula
parcialmente
• Se comienza a producir mucho glicerol. El citrato está dentro del ciclo de los ácidos tricarboxílicos
y se va a transformar en otros ácidos, pero nosotros no queremos eso. Este glicerol hace que
baje o que se anule la actividad de esas enzimas del ciclo que gastan citrato, pero esto no se
consigue al 100%. Además, potencia a citrato sintasa, de forma que gracias a la producción de
glicerol se va a acumular citrato.
CONDICIONES AEROBIAS
Aspergillus necesita oxígeno, sino lo tiene se va a parar la producción de nuestro metabolito
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Para concluir, destacar que como el citrato es un metabolito primario van a ser consumidos en parte por
el microorganismo para crecer.
MEDIO DE CULTIVO
Como hemos dicho anteriormente, el citrato es un metabolito primario de tipo II, es decir, que su
producción no va a estar asociado al crecimiento. Para producirlo, en primer lugar, haremos que nuestros
microorganismos crezcan en gran cantidad (trofofase) y para ello usaremos pH 5, que es el ideal para el
crecimiento de nuestro microorganismo.
El ácido cítrico se va a producir casi llegando a la idiofase, por lo que vamos a tener que forzar un estrés
en nuestro microorganismo para que este no siga en trofofase, y esto se va a realizar mediante una
disminución de pH, que va a ser el propio sistema el que la va a producir de forma local, debido a la
exportación de ácido cítrico, que conforme vaya pasando el tiempo, va a producir que la bajada de pH
ocurra de manera global en el tanque.
Con respecto a las fuentes de carbono hay que seguir suministrándolas porque sino ya entraríamos en
idiofase y nosotros no queremos eso. Por lo tanto, nuestro medio de cultivo es el siguiente:
• Fuente de Carbono: se suelen utilizar melazas o jugo de glucosa, pero tener cuidado con los
metales que puedan tener ya que pueden evitar esa deficiencia de Mn2+ que necesitamos.
También se puede usar almidón, pero dependerá de si nuestro Aspergillus produzca amilasas.
• Fuente de Nitrógeno: con la alta concentración de NH4+ messirve, pero controlar para que no
suba el pH
• Fuente de Fósforo: la concentración de fósforo en la trofofase tiene que ser más 10 mM y en
idiofase menos de 10mM
• Fuente de Azufre: medir índice NPK
• Sal
• Metales:
o Hierro (0,05 – 0,5 ppm): es importante que esté en ese rango (favoreciendo la
producción de ácido cítrico) porque este hierro puede potenciar la formación de otros
ácidas reduciendo rendimientos y la posterior purificación
o Cobre: Aspergillus es un hongo filamentoso y que además produce micelio, donde la
viscosidad no va a ser constante, lo que va a impedir la utilización de biorreactores
sumergidos. Si somos capaces de controlar el micelio del hongo podemos usar un medio
líquido (fermentador sumergido), pero si no, tendremos que usar un medio sólido
(fermentador en superficie), donde no hace falta agitar porque la oxigenación se
produce de forma natural, pero la posterior separación será más complicada. Esto se
puede controlar con la concentración de cobre, que a determinadas concentraciones va
a limitar la formación de micelio
o Mn2+: baja concentración como hemos visto anteriormente
o Zn
o Mo
• pH: el pH inicial es 5 para que se inicie la trofofase ya que es un metabolito primario, pero
conforme se vayan produciendo los ácidos se va a acidificando poco a poco el medio. Cuando el
pH es menor a 3 se va a suprimir la formación de ácido oxálico y glucónico.
• Agua
RENDIMIENTO
Teóricamente se van a producir rendimientos mayores al 100% (g ácido citrico / g fuente de C)
En realidad no se llega a esos rendimientos por pérdidas en el metabolito primario.
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PROCESO DE PRODUCCIÓN
• Inóculo: suspensión de esporas (producidas en medio sólido a 24ºC durante 10 – 14 días)

• Cultivo semilla: esporas + medio (15 % azúcar) + cianida a 32 ºC durante 24 horas (pellets de 0,2
– 0,5 mm de diámetro). pH cae a 4,3 lo que va a ser importante para la formación de micelio)
Vamos a poder elegir fermentador en superficie o fermentador sumergido. Sabemos que Aspergillus es
muy sensible a la falta de oxígeno, de forma que este tiene que ser insuflado y además habrá que agitar
para que llegue a todas las zonas. La agitación se va a ver condicionada por el micelio, por lo que es posible
que no haya una buena agitación, por lo que se perderá efectividad al no haber buena oxigenación.
FERMENTACIÓN EN SUPERFICIE
Este tipo de fermentador lo vamos a elegir si no sabemos controlar el micelio y este va a crecer
masivamente en bandejas con medio sólido donde crece en superficie formando micelio sin límite de
oxígeno.
En este caso el medio de cultivo (sólido o líquido) se va a preparar sobre bandejas de entre 3 -5 cm de
grosor de medio, que se inoculan (spray o corriente de aire; 2 – 5 *107 esp/m2).
• Medio sólido: 28 ºC durante 90 horas

• Medio líquido: (20 % de la producción total: 30ºC; idofase alas 30 horas. Se para el proceso a los
8 – 14 días. 1,5 kg ácido cítrico/m2
FERMENTADOR EN SUMERGIDO
Este tipo de fermentador se va a elegir cuando sabemos controlar el micelio o este resulta muy corto.
Necesita el uso de antiespumantes que van a evitar la formación de espumas durante la agitación. La
producción de ácido cítrico no se suele hacer en cultivo contínuo por la formación del micelio.
Son un 25 % más baratos en infraestructuras, pero gastan más energía y necesitan personal más
especializado. Hay que tener en cuenta tres factores:
• Material fermentador resistente a ácido o acero inoxidable: no puede liberar metales. Se suelen
usar fermentadores de entre 120 – 220 m3.
• Formación y estructura del micelio: hacen falta pellets pequeños y sólidos (depende de (fe/cu).
A veces se inocula con las esporas en vez de con el cultivo semilla.
• Aporte oxígeno > 20 – 25 % de saturación
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PROCESO DE DOWNSTREAM
El ácido cítrico lo vamos a tener en medio líquido, donde nuestro parámetro de control va a ser el pH. La
característica diferencial para separar el ácido cítrico es su producto de solubilidad, que los va a
diferenciar del resto de los componentes del sistema. De esta forma, lo vamos a purificar como un cristal,
un cristal de citrato de calcio.
Para llevar a cabo la recuperación del ácido cítrico tendremos que llevar a procesos:
1. En la mayoría de ocasiones vamos a tener mucho ácido cítrico y un poco de ácido oxálico que va
a precipitar antes que el cítrico. Por ello, en primer ligar lo que vamos a hacer es quitar del medio
este oxálico, para ello, añadiremos Ca2+, de forma que se formará oxalato cálcico (sólido). En
este medio tendremos un sobrenadante, donde está el cítrico y luego sólidos (micelio junto con
oxalato de calcio).
2. Separación del micelio y oxalato cálcico (sólidos) del resto de componentes mediante
centrifugación.
3. Adición de más cantidad de calcio. Tendremos que ajustar también las condiciones de pH, el
medio tiene que tener pH neutro, alcanzándose de esta forma las condiciones óptimas de
precipitación del citrato cálcico.
4. Filtración donde en este caso nos quedaremos con el precipitado (citrato cálcico)
5. Adición de ácido sulfúrico que tiene una mayor afinidad por el calcio que el ácido cítrico,
formándose de esta forma sulfato cálcico.
6. Filtramos de nuevo y lo que nos queda en el filtro será el sulfato cálcico, mientras que lo que nos
queda en el sobrenadante va a ser ácido cítrico 100 % puro y ya estaría listo para la venta.
7. Si hay impurezas podemos usar carbón activo.
ÁCIDO LÁCTICO
Fue el primer ácido producido industrialmente (desde 1880). Su producción se realiza mediante métodos
biológicos y químicos. Solo se comercializa el L – ácido láctico. La producción microbiana supone unas
2000 toneladas de ácido láctico por año.
Es un producto de fermentación que se va a obtener a partir de microorganismos fermentadores

homolácticos. Es un metabolito primario de tipo I, por lo que su producción va a estar asociada al
crecimiento, y además es extracelular.
Lo van a producir las bacterias del ácido láctico que son quimiorganotrofos, que son Gram + y catalasas-.
La catalasa - significa que estas bacterias son anaerobias o anaerobias facultativas. La catalasa es una
enzima que rompe el H202, un producto tóxico derivado del metabolismo aerobio de azúcares. Es lógico
que las bacterias del ácido láctico sean catalasa – porque son anaerobias
Estas bacterias van a oxidar la glucosa mediante una fosforilación a nivel de sustrato. En una respiración
el aceptor de electrones es externo, pero en una fosforilación a nivel de sustrato va a ser interno, en este
caso el piruvato, que va a aceptar los electrones del poder reductor (con un rendimiento neto de 2ATP) y
en vez de seguir oxidándose se reduce a lactato y oxida a NADH2. Este piruvato reducido va a ser
excretado como lactato (producto extracelular que se va a encontrar en el sobrenadante).
El rendimiento es más alto que el del ácido cítrico debido a que el ácido cítrico era requerido por la
bacteria, por lo que solo excreta lo que le sobra. En el caso del lactato, este no va a ser requerido por la
bacteria, de forma, que el rendimiento va a ser mayor.
Rendimiento teórico 2 mol de lactato / mol de glucosa y el real es el 90% * rendimiento teórico.
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MEDIO DE CULTIVO
• Fuente de carbono o energía: melazas o cualquiera que rinda glucosa
• Fuente de Nitrógeno: fosfato amónico ((NH4)2HPO3). El amonio va a servir como fuente de N2 y
como tampón de pH. Amonio sube el pH mientras que el lactato va a bajar el pH de forma, que
el amonio va a compensar esta bajada de pH. Nuestro punto de control va a ser el pH. El fosfato
sirve como fuente de fósforo
• Fuente de Azufre: medir índice NPK
• Fuente de Fósforo: por encima de 10 mM para que se entre en trofofase
• Agua
• pH: acidófilas (5,5 – 6,5)
• Temperatura: relativamente alta. Forman parte de el microbiota comensal humana, por lo que
su temperatura óptima rondará entre los 45 – 50ºC.
• Condiciones anerobias
• Vitamina B: requeridas por las bacterias del ácido láctico
PROCESO DE PRODUCCIÓ N INDUSTRIAL
Industrialmente debemos tener en cuenta que el pH va a ir bajando debido a la excreción del ácido láctico,
por lo que se puede producir que salgamos de la zona de confort del microorganismo, haciendo que este
reduzca su crecimiento y, por tanto, produciendo menor cantidad de ácido láctico (metabolito primario
tipo I). Para evitar esto se añade Carbonato Cálcico, que nos ayuda a neutralizar el exceso de ácido.
También puede servir retirar el ácido láctico.
1. Filtración o centrifugación para la eliminación de la biomasa

2. Adición de calcio para que el láctico precipite a lactato cálcico (sólido)
3. Filtramos y nos quedamos con el precipitado
4. Adición de ácido sulfúrico para retirar el calcio, se forma sulfato de calcio.
5. Filtramos de nuevo y nos quedamos con el sobrenadante
6. Eliminación de impurezas y purificación del ácido láctico
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OTROS ÁCIDOS
ÁCIDO GLUCÓNICO
El ácido glucónico lo producen los

microorganismos que oxidan la glucosa con la
glucosa oxidasa (enzima necesaria para producir el
glucónico) como Aspergillus níger y Acetobacter
suboxydans. Cuando crecen en presencia de
glucosa, producen ácido glucónico. Es un
metabolito primario de tipo I y extracelular que se
va a extraer de la misma forma que el ácido láctico.
Necesitan oxígeno, así como una fuente de carbono que rinda glucosa. Se usa en la industria del metal,
comida y cuero
Tener cuidado que el glucónico lo producen tanto bacterias (Acetobacter suboxydans) como hongos
(Aspergillus niger), de forma, que el medio de cultivo va a ser distintos en estos dos casos. Tener en cuenta
el pH y que los hongos requieren más nitrógeno que las bacterias. También tener en cuenta que
Aspergillus puede producir micelio, por lo que la extracción del producto se puede complicar. Fuente de
fósforo por encima de 10 mM para que se entre en trofofase.
Realmente lo único que vamos a necesitar de ellos es la glucosa oxidasa, por lo que podemos extraerla de
ellos o hacerla recombinante e inmovilizada y no emplear microorganismos.
ÁCIDO ITACÓNICO
Se usa Aspergillus itaconicus, hongo ambiental quimiorganotrofo. Debemos añadir calcio, porque hay una
enzima que es la encargada de degradar el ácido itacónico y se ve inhibida en presencia de calcio.
Se usa en la industria de los plásticos y en la del papel.
Para el proceso industrial se usan células inmovilizadas. Va a ser muy importante la adición de Ca para
inhibir la enzima del ácido itacónico oxidasa que produce ácido succínico e itartárico no deseados.
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TEMA 10: Producción

de alcoholes: Etanol.
Otros
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INTRODUCCIÓN
Hasta recientemente se ha usado el petróleo y sus derivados para la producción de energía y como
materia prima de la industria química. Sin embargo, en la actualidad se empieza a potenciar la producción
microbiana de materias primas mediante fermentaciones.
Para que sea rentable la producción de materias primas a partir de los hidratos de carbono de los cultivos,
han de cumplirse los siguientes requisitos:
• Transporte barato
• Bajo coste para la conversión de los polímeros en monómeros
• Que se puedan usar cultivos mixtos para metabolizar diferentes substratos
• Que se puedan usar termófilos para ahorrarse el enfriamiento, aumentar la cinética y disminuir
las contaminaciones
• Que se pueda realizar la fermentación en anaerobiosis
• Que se pueda hacer un proceso continuo
• Que tenga un bajo coste de recuperación del producto y de concentración
Todos los alcoholes van a ser metabolitos primarios de tipo I y extracelulares, excepto el glicerol que
tendremos que hacer algo para excretarlo.
ETANOL
USO
Se ha fabricado para consumo desde hace miles de años.
• Materia prima para la industria química: se ha fabricado mediante microorganismos desde el

inicio de la Microbiología Industrial. Ha habido unos años en que se ha preferido la síntesis
química, pero ahora se vuelve a la síntesis microbiana. Principalmente en USA, Alemania y
Brasil.
• Como biocombustible para coches: Brasil (> 30% petróleo se ha substituido por bioetanol),
Sudáfrica y USA
MICROORGANISMOS
• Levaduras fermentadoras: Saccharomyces cerevisiae, S. mibilis, Candida, Kluyveromyces,

Pichia. Usan glucosa, fructosa, sacarosa.
• Cultivos mixtos: levaduras + mo hidrolíticos/fermentadores de azúcares no fermentables por
levaduras: Zymomonas, Clostridium.
• Microorganismos modificados genéticamente: Bacteria ALK2: Tolerancia al alcohol, a la alta
temperatura y a la alta concentración de azúcares. Se usan si queremos usar residuos vegetales
como fuentes de carbono.
El principal productor de etanol es Saccharomyces Cerevisiae, que su principal problema es que no resiste
las altas concentraciones de azúcar. Va a ser sensible al propio etanol que ella produce, lo que va a hacer
que salga de la trofofase y se va a ralentizar mucho la producción.
Para evitar esto, se realizan procesos de mutagénesis para obtener mutantes o bien, usar otros
microorganismos que sean más resistentes a etanol como Zymomonas que es similar a Pseudomonas.
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PREPARACIÓN DEL MEDIO DE CULTIVO
El etanol se obtiene de una oxidación de la glucosa y en la mayoría de ocasiones no usaremos glucosa,

pero sí compuestos que rinden glucosa como almidón (amilopectina + amilosa), que se van a requerir
amilasas.
ALMIDÓN
Para usar el almidón hay que hacer una pre-hidrólisis, usando una mecánica o enzimática (con amilasas
inmovilizadas o poniendo un microorganismo que produzca amilasa, donde el tiempo en el que tenemos
que tener este cultivo va a ser de vital importancia, para evitar que ese microorganismo se lleve más de
lo que deba). Destacar que el proceso de degradación enzimática se va a dar en condiciones mejores si
calentamos un poco.
Esto se puede hacer en una o en dos fermentaciones:
• Un fermentador: primero se hacen crecer a los microorganismos que van a ser capaces de
degradar el almidón y a medida que vayan liberando azúcares simples se fomenta el desarrollo
de Sacharomyces
• Dos fermentadores: En el primero se usa como fuente de carbono almidón, y se cultivan en este
los microorganismos que van a ser capaces de hidrolizarlo, de forma que se va a formar un caldo
rico en los productos hidrolíticos que será transferido al segundo fermentador (con una
membrana de filtración) donde inocularemos con Sacharomyces o Zymomonas. Esto se utiliza
cuando no sabemos controlar el ritmo de producción de los microorganismos hidrolíticos
En primer lugar, se va a requerir un pre-tratamiento, en el que los tubérculos o los granos se van,
posteriormente se produce la hidrólisis del almidón por los microorganismos hidrolíticos generando
azúcares más sencillos (maltosa y glucosa) que ya van a poder ser usados por nuestros microorganismos
fermentadores.
MELAZAS
Contienen fundamentalmente sacarosa, además de una fuente de nitrógeno, e incluso de P y S, debido a
que es una fuente de carbono impura.
Tienen el problema de que tienen mucho SO2 que inhibe el crecimiento de muchas cepas de
Saccharomyces, lo que posteriormente usaremos como agente selectivo.
MADERA O DESECHOS DE LA IN DUSTRIA DE LA MADERA

Madera → Celulosa (glucosa) + Hemicelulosa [pentosas (xilosa) + hexosas (glucosa, galactosa y manosa)
+ ácido urónico] + lignina
La madera y los desechos de poda están formados por celulosa y hemicelulosa, envuelta en una red de
lignina, que impide el acceso de los microorganismos a la celulosa y hemicelulosa. Lo que ocurre es que
hay muy pocos microorganismos que sean capaces de degradar la lignina (métodos químicos muy
complejos).
DEGRADACIÓN DE LA LIGNINA
Recientemente, se ha descubierto un hongo (Phanerochaete chrysosporium) que va a producir unas
enzimas extracelulares, la lignina peroxidasa (metabolito primario tipo II), que van a degradar la lignina.
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Consiste en poner al microorganismo en trofofase y cuando se haya alcanzado suficiente densidad óptica
limitamos un poco la fuente de carbono del medio, de forma que el microorganismo va a comenzar a
producir estas enzimas para degradar la lignina.
Es importante el EPS, debido a que estas células extracelulares gracias al EPS, se van a concentrar, que va
a permitir una actividad más eficiente.
DEGRADADORES DE CELULOSA Y HEMICELULOSA

Degradadores de celulosa y hemicelulosa pueden ser aerobios o anaerobios
Vamos a distinguir diferentes microorganismos que van a ser capaces de producir enzimas que degradan
la celulosa y la hemicelulosa. Estas enzimas van a ser metabolitos primarios de tipo II. Distinguimos:
• Trichoderma: celulasas extracelulares (aerobios)

• Cellulomonas fimi: celulasas extracelulares (aerobio)
• Clostridium thermocellum: celulosoma asociado a la pared celular (intracelular). El celulosoma
contiene endoglucanasas, exoglucanasas y xylanasas. (anaerobio)
Es importante el EPS, debido a que estas células extracelulares gracias al EPS, se van a concentrar, que va
a permitir una actividad más eficiente. No va a ser importante en Clostridium al producir celulasas
intracelulares.
CONCLUSIÓN
De esta forma, para utilizar la madera como fuente de carbono, en primer lugar, vamos a tener que hacer
un pretratamiento con microorganismos degradadores de lignina, posteriormente otro tratamiento con
microorganismos degradadores de celulosa y de hemicelulosa. Finalmente, se llevaría a cabo la
fermentación.
Los productos de las hidrólisis de la celulosa es glucosa, y de la hemicelulosa es una mezcla de pentosas y
hexosas. Estas pentosas no pueden ser usadas por muchos microorganismos, de forma que vamos a
perder una fracción de Carbono que no va a poder ser usada. Por ello vamos a tener que hacer un cultivo
mixto con un microorganismo que si pueda usar esas pentosas.
BIOSÍNTESIS
El etanol es un metabolito primario de tipo I extracelular derivado de la fermentación alcohólica, proceso

a través del cual la glucosa se oxida a piruvato, y posteriormente, ocurre una fosforilación a nivel de
sustrato para conseguir energía en forma de ATP.
El etanol vamos a tener un alto rendimiento porque el microorganismo no va a necesitarlo y es un

producto de fermentación que se extrae. El alcohol es caro porque el proceso de downstreaming es
complejo, ya que en la destilación hay que controlar muy bien la temperatura.
Se produce en presencia y en ausencia de oxígeno. Es más eficiente en condiciones de anaerobiosis que

en aerobiosis, lo que plantea un problema, ya que en los fermentadores industriales es muy difícil retirar
el O2 desde el minuto 0.
ANAEROBIOSIS
En este caso el intermediario es el acetaldehído, que va a aceptar los electrones, transformándose en
etanol que va a ser llevado al exterior.
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Al ser un metabolito primario de tipo I vamos a tener que hacer que nuestros microorganismos se
encuentren en condiciones de crecimiento óptimas. En cuanto a las condiciones aerobias o anaerobias,
destacar que como hemos dicho anteriormente, es muy complicado iniciar desde el minuto 0 las
condiciones de anaerobiosis, de forma que lo normal va a ser que al comienzo el cultivo tenga oxígeno.
Durante el proceso de producción hay que tener cuidado con el etanol que se está produciendo para
evitar llegar al límite del microorganismo. El rendimiento de nuestro proceso va a depender de la
resistencia de los microorganismos a su propio producto de fermentación. Para solucionar esto podemos
utilizar por ejemplo un fermentador continuo, de forma que el etanol se va a extraer conforme se va
produciendo.
El parámetro de control de nuestro proceso va a ser la densidad. La densidad tiene que ir bajando debido
a que el alcohol es menos denso que el agua, de forma que cuando la densidad se estabiliza va a significar
que la fermentación ya se ha parado.
El proceso de escalado consiste en el paso de nivel de laboratorio a nivel industrial. Vamos a tener un
aumento del volumen de inóculo desde el nivel de laboratorio hasta llegar a tener la suficiente biomasa
como para inocular un fermentador industrial. Durante este proceso de escalado se tiene que mantener
una temperatura ambiental (30ºC) y pH en torno a 5 -7, y, además, la densidad se tiene que ir controlando.
Todo lo que se refiere a escalado del inóculo es en aerobiosis, donde también se va a producir etanol,
pero de manera menos eficiente.
Los microorganismos anaerobios facultativos son aquellos es los que va a ocurrir lo que se denomina como
Efecto Pasteur, proceso por el que:
• Condiciones de oxígeno → fosforilación oxidativa

• Condiciones sin oxígeno → fosforilación a nivel de sustrato
Sin embargo, hay una forma de que se produzca fosforilación a nivel de sustrato desde un primer
momento sin encontrarnos en condiciones anaerobias, y es mediante lo que se conoce como Efecto
Crabtree.
• Cuando hay mucha cantidad de azúcar, por encima de 1g/L, se va a inhibir la fosforilación
oxidativa a pesar de que haya O2 en el medio, y se va a dar fosforilación a nivel de sustrato.
Por ello, para hacer más efectivo nuestra producción, en nuestro cubato vamos a tener que añadir azúcar
al inicio del proceso, y no más, debido a que conforme pasa el tiempo, se van a pasar a condiciones
anaerobias, produciéndose por tanto fosforilación a nivel de sustrato
El efecto Crabtree solo se produce en Saccharomyces y NO con Zymomonas
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EJEMPLO DE PROCESOS DE PRODUCCIÓN
Hay microorganismos capaces de degradar las pentosas. Una vez realizada la hidrólisis de celulosa y
pentosa, obteniendo hexosas y pentosas, vamos en primer lugar, realizar una separación química de las
hexosas y pentosas, donde las hexosas pueden ser usadas por Saccharomyces, y las pentosas las usaremos
para aquellos microorganismos que puedan usarlo como Pachysolen, de forma que usaremos toda la
fuente de carbono que tenemos para producir etanol haciendo de esta forma el proceso mucho más
eficiente. (FOTO DE ARRIBA)
También se podría hacer un cultivo mixto, donde se hace una primera inoculación con Sacharomyces que
degradará la hexosa y obtendrá etanol, y posteriormente, inoculamos con aquellos microorganismos que
sean capaces de degradar las pentosas como en el caso de Pachysolen y producir etanol (estos
microorganismos van a tener que ser poco sensibles al etanol, sino tendremos que sacar el etanol
producido por Saccharomyces), es decir, en este caso vamos a mezclar todas las fracciones juntas si
separar en dos corrientes. (FOTO DE ARRIBA)
Al ser un proceso extracelular, vamos a llevar a cabo una destilación en la que hay que controlar muy bien
la temperatura. Es el paso que más consume energía. Un abaratamiento de este proceso contribuye
mucho al abaratamiento de los costes totales.
BUTANOL
Es mucho más estable y tiene más poder calorífico que el etanol. Podría usarse como combustible para
los coches, como solvente o como biocida.
Lo produce Clostridium acetobutylicum (anaerobio estricto) que va a realizar una fermentación a nivel
de sustrato, produciendo acetona, butanol y etanol (Fermentación ABE). Al contrario que en los casos
anteriores que había solo un aceptor de electrones, en este caso vamos a distinguir varios aceptores de
14
electrones, lo que va a hacer que se produzcan los tres productos citados anteriormente. La materia prima
van a ser biomasa y residuos orgánicos.
Lo malo de Clostridium acetobutylicum, es que es muy sensible al butanol producido en la fermentación,

lo que hace entre otras cosas que el Biobutanol no sea usado como combustible en la actualidad (bajísimo
rendimiento)
Ventajas sobre el bioetanol para el uso como biocombustible:
1. No se requieren nuevas tuberías para transportarlo.

2. Es menos corrosivo (tiene menor tendencia a mezclarse con agua).
3. Tiene cuatro átomos de carbono en su estructura, lo cual le sitúa más cerca al nivel energético
de la gasolina.
4. Actualmente se puede utilizar el butanol puro (B100) en los motores de combustión interna sin
previa modificación de éstos o puede mezclarse con gasolina.
5. Debido la alta densidad del butanol y su baja presión de vapor, que es la mitad de la gasolina, es
menos volátil y con más tendencia a la combustión que a la explosión.
Inconvenientes sobre el bioetanol para el uso como biocombustible:
1. Hace falta investigar más para mejorar su producción, entre otros, la supervivencia de las cepas
implicadas
Clostridium va a realizar la fermentación butírica, en

la que van a fermentar azúcares hasta piruvato y
posteriormente este piruvato se transforma en los
productos finales en dos etapas:
• Acidogénica: a partir del piruvato se

genera ácido butírico y acético. Ocurre en
la fase exponencial de crecimiento y como
resultado se va a acidificar el medio,
induciéndose de esta forma la enzimas del
siguiente proceso.
• Solventogénica: diferentes intermediarios
como acetil- coA, acetocetil – coA y butiril
– coA que van a dar lugar a los productos
de la fermentación, en este caso ocurre en
la fase estacionaria.
La ruta se va a ramificar:
• Acetato + butirato → acetona

• Reducción acetil – coA → etanol
• Butiril – coA → butiraldehido → butanol
Si quisiéramos cultivarlos solo habría que asegurar un fermentador anaerobio burbujeando todas las
soluciones anteriores para eliminar el oxígeno, y asegurar una fuente de carbono que rinda mucha
glucosa, como melaza o almidón preparados.
15
Sin embargo, no se usa porque tiene muy baja tolerancia a su producto de fermentación; cuando alcanza
una concentración superior al 1.3%, la bacteria muere.
GLICEROL
Se produce de la misma manera y con los mismos microorganismos que el etanol, pero vamos a tener que
cambiar a otro aceptor final de electrones distinto al del etanol.
En la formación de etanol a partir de glucosa se forma un intermediario, el acetaldehído, que oxida a

NADH2 para formar etanol. Si se añade NaHSO3 (monosulfito sódico), se formado un complejo
acetaldehído – sulfito, que no oxida al NADH2 para formar etanol. NADH2 ante esto lo que va a hacer es
reducir a dihidroxiacetona fosfato (producto de la glicolisis) a glicerol fosfato, que desfosforila
posteriormente a glicerol, proceso realizado por la propia célula.
El parámetro de control al igual que en el etanol es la densidad.
En la actualidad solo se obtiene por métodos químicos. Lo forman las levaduras y es un ejemplo de cómo
modificando las condiciones de fermentación se modifica el producto final
16
Tema 11:
Transformaciones
por Microorganismos
17
INTRODUCCIÓN
La transformación microbiana es la capacidad que tienen los microorganismos de modificar químicamente

una amplia variedad de componentes orgánicos, con o sin ganancia de energía (cometabolismo). Los
microorganismos van a ser capaces de realizar transformaciones súper específicas, mucho más baratas
que mediante procesos químicos. Presenta las siguientes ventajas:
• Especificidad de sustrato
• Especificidad de sitio de acción
• Estereoespecificidad, van a ser capaces de distinguir entre distintos isómeros de la molécula
• Condiciones de reacción poco agresivas para el substrato
Estas reacciones posibles para dicha transformación son las oxidaciones, reducciones, reacciones
hidrolíticas y condensaciones.
Este proceso en cuestión presenta un protocolo definido, basado en un cultivo en fermentador (batch) al
cual se añade el compuesto a biotransformar en un momento determinado. Para ello usaremos cultivos,
células en reposo (se evita la inhibición del crecimiento y la contaminación), células inmovilizadas
(permiten hacer el tratamiento en continuo) y extractos de enzimas sin células/enzimas inmovilizadas
(esto con el fin de prevenir la posterior bioconservación y/o acortar el tiempo evitando el tiempo de
transporte a través de la membrana). A continuación, describiremos algunas peculiaridades:
• Substratos hidrófilos, por lo que se inocula con una solución concentrada de substrato.
Podremos hacer una disolución homogénea de ellos en agua, y están totalmente accesibles para
los microorganismos ya que ambos están en la fase acuosa.
• Substratos con poca solubilidad, por lo que a la solución se le suele añadir un emulsificante
(Tween) o solventes (etanol, acetona…) para incrementar la solubilidad, de forma que así
aumentaremos el área superficial que forma una interfase con la acuosa, y luego inocular.
• Substratos lipofílicos, por lo que creamos un sistema de dos fases (acuosa con el cultivo y sobre
ella una inmiscible para el substrato), ya que no vamos a poder emulsionarlo y mezclarlo con la
capa acuosa. Nos va a interesar la interfase, que es la superficie de contacto, por lo que no nos
van a interesar capas gruesas, sino que más bien finas y extendidas. Cabe recalcar que este es el
método más común dado para la transformación de esteroides.
TRANSFORMACIÓN DE ESTEROIDES
Los esteroides presentan propiedades hormonales (como los corticoides, los andrógenos, estrógenos,
progesterona, etc.), lo que les lleva a presentar diversas utilidades como son:
• Terapéuticas
• Anticonceptivas (derivados de progesterona y estrógenos)
• Antiinflamatorias (cortisonas y prednisonas).
La investigación actual se centra en optimizar los procesos de obtención, lo que llevaría a un ahorro de su
producción.
Con las biotransformaciones dadas sobre los esteroides no se pretende una síntesis total; sino
transformaciones dadas sobre los grupos funcionales de ciertos sitios específicos. El carbono 11, su
sustitución va a dar lugar a diferentes transformaciones ya que cambiando el grupo funcional de ese
carbono va a dar lugar a esteroides con distintas propiedades.
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Este tipo de transformaciones la van a realizar microorganismos en trofofase, pero no lo van a usar como
fuente de carbono (cometabolito). Corynebacterium va a ser capaz de dar lugar a esteroides con distintas
propiedades.
Medio de cultivo para ese microorganismo crezca en trofofase y le echamos esas moléculas que queremos
transformar. El problema es que los esteroides son lipofílicos y que el medio es polar. La transformación
se va a dar en la interfase, de forma que vamos a trabajar en fermentadores extendidos donde echamos
una capa fina de medio de cultivo con los microorganismos y encima una capa fina con el esteroide de
forma, aumentando la zona de contacte.
Para el proceso de downstream la polaridad va a ser la característica diferencial.
TRANSFORMACIÓN DE PROGESTERONA A CORTISONA POR RHIZPUS NIGRICANS
Por ejemplo, para entender lo que supone esta técnica, la obtención de cortisona a partir de progesterona
ha supuesto una baja del coste de producción de 200 dólares/gramo a menos de 1 dólar/gramo.
A raíz del ejemplo de la cortisona, destacamos la

importancia de estos procesos mediante microorganismos
con respecto de los procesos químicos y lo que suponen en
cuanto a eficacia y rentabilidad comparada una con la otra.
La transformación de progesterona a cortisona más común
a nivel industrial es la dada por Rhizopus Nigricans
(quimioorganotrofo aerobio formador de micelio). El
esteroide no supone para él una fuente de carbono, pero
si es una parte de su metabolismo, por lo que es usado para
dicha transformación.
En este caso, esta transformación va a ir ligada al crecimiento celular, por lo que va a ser un metabolito
primario de tipo I.
TRASNFORMACIÓN DE CORTISOL A PREDNISOLONA POR ARTHROBACTER SIMPLEX
Otra transformación a destacar dentro del grupo de transformaciones de esteroides es la dada de cortisol
a prednisolona por parte de Arthrobacter Simplex. Es importante destacar el hecho de que son varios los
hongos y bacterias (por ejemplo, una que nos debe sonar es Corynebacterium) capaces de transformar
esteroides, obteniendo así sustancias que como vemos son de gran importancia sanitaria y económica.
En cuanto al tratamiento en el nicho industrial, usaríamos para la biotransformación un tanque extendido.

En dicho tanque tendremos una bicapa de microorganismos y otra con esteroides, esto con el fin de
maximizar el contacto entre ellos. Además, para aumentar el área de contacto y el área superficial se
pueden añadir biosurfactantes que rompan las moléculas de esteroides, aumentando por ende el
contacto. Finalmente, el producto se recoge, al ser apolar, añadimos disolvente.
Para el proceso de producción, como podemos apreciar en la imagen, se va a requerir la necesidad de dos
o más microorganismo para conseguir las modificaciones necesarias para obtener el producto de interés
necesario.
19
CONCLUSIÓN DE LOS DOS PROCESOS

De este tipo de transformaciones (también el caso de la primera transformación), el microorganismo
puede obtener energía porque haces oxidaciones completas, o no la obtiene porque hace oxidaciones
parciales. Esto es lo que se conoce como reacciones de co-metabolismo, que van a ocurrir cuando la
molécula no es el sustrato del microorganismo, pero es muy parecida, y se equivoca, debido a que las
primeras enzimas no van a ser muy específicas.
Los microorganismos pueden degradar una gran cantidad de moléculas, aunque no sean sus moléculas
específicas debido a estos errores. Durante este proceso de transformación puede que algunas sustancias
tóxicas pasen a ser no tóxicas
Posteriormente, cuando ya se comiencen a segregar enzimas más específicas, no se va a producir esa

reacción y como resultado la va a excretar.
Sin embargo, es posible que no se excrete cuando se haya producido la transformación, entonces
necesitaremos acoplarlo a un cultivo de otro microorganismo que sea capaz de terminar la transformación
hasta la molécula que queremos. Habría que acoplar tantos cultivos como fueran necesarios para llegar a
la que queremos.
Entonces no se utilizan cultivos puros, sino cultivos mixtos acoplados donde unos microorganismos
utilizan los residuos de otros. Las transformaciones pueden ser resultado de metabolismo o de co-
metabolismo.
PROBLEMAS ASOCIADOS A ESTA INDUSTRIA
Los principales problemas son la falta de substratos o elevado precio de los mismos
Para este problema, es usual usar esteroides baratos (esteroides que tiene de 27 a 29 carbonos de
longitud como el colesterol). A estos lo que se haría para tratarlos es eliminarles las cadenas laterales
hasta el C17, asegurándose de no romper los anillos, de forma que así obtendremos el esqueleto básico
de los esteroides. Es importante además tener las siguientes precauciones:
• Usar inhibidores como agentes quelantes, que impidan reacciones en C1, C9 y C12. Estos lo que
hacen es unirse a aquellos carbonos que puedan colapsar evitando que de esta forma que lo
hagan.
• Usar mutantes que tengan inactivadas las enzimas que reaccionan con esos carbonos y que
puedan dar lugar al colapso.
20
EJEMPLO DEL COLESTEROL

El colesterol tiene una estructura similar a los esteroides, pero hace falta cortarle una cadena, de forma
que hay microorganismos que van a poder utilizar esta transformación de colesterol a la estructura
básica del esteroide, de igual manera que antes, en trofofase.
Tenemos que tener precaución, y es que hay que usar inhibidores para evitar el colapso de la molécula
de colesterol que se produce tras la rotura de su enlace, de forma que se estabiliza.
Hay algunos microorganismos que rompen ese enlace del colesterol, pero luego lo siguen degradando,
algo que no queremos. Por ello, en ocasiones vamos a usar mutantes que van a tener estas enzimas
inactivas de forma, que vamos a conseguir romper ese enlace del colesterol y no se va a seguir con la
degradación.
TRANSFORMACIÓN DE SUSTANCIAS NO ESTEROIDEAS
PRODUCCIÓN L – SORBOSA
CON UN SOLO CULTIVO

En cuanto a la transformación de sustancias no esteroideas,
destacamos la producción de L-sorbosa. Para dicha producción,
llevaremos a cabo un proceso metabólico en el que se
encuentra implicada la bacteria Acetobacter (quimiorganotrofo
cuya fuente de carbono es el etanol) que la deberemos
mantener en condiciones de crecimiento o trofofase.
Entrando en materia, en lo que respecta a la producción

anterior, destacaremos el proceso Reichstein-Grussner, el cual
está dividido en varias etapas. Básicamente se fundamenta en
el paso de D-sorbitol (que se ha podido obtener mediante
reducción catalítica a partir de D-glucosa) a L-sorbosa (que
puede seguir un procesamiento hasta Ácido L-ascórbico). La
encargada, como ya hemos dicho, del paso de D-Sorbitol a L-
Sorbosa es la enzima Sorbitol deshidrogenasa, presente en el
microorganismo Acetobacter suboxydans.
Lo que haremos será hacer crecer primero al microorganismo usando como fuente de carbono etanol,
hasta que tengamos una gran densidad óptica, y posteriormente añadimos glucosa que va a ser
transformada en sorbitol el cual será transformado en Sorbosa por la enzima de Acetobacter.
A continuación, describiremos condiciones y protocolo, con el fin de hacernos a una idea de lo que
sucedería en una planta industrial:
• Se trata de un proceso sumergido, continuo, con células móviles o inmovilizadas.

• Presenta mecanismos de agitación y de aireación.
• Se da a una temperatura de 30ºC y en condiciones ácidas
• La concentración presente de substrato es del 20%.
• El medio de cultivo es básicamente un extracto de levadura o sirope de maíz, con CaCO3.
• El tiempo empleado es de 24 horas, obteniendo un rendimiento de 1Kg L-ácido ascórbico/ 2 Kg
glucosa.
21
CON DOS CULTIVOS

A continuación, presentaremos un proceso dado en dos etapas determinado, con el fin de hacer ver al
lector la importancia de la inversión en I+D para buscar nuevos métodos con los unificar distintos procesos
dados en varias etapas:
El paso de D-glucosa a Ácido 2-Keto-L-gulónico. Para ello se necesitan dos etapas dadas por dos
microorganismos diferentes.
• Erwinia (anaerobio facultativo) se encarga del paso de la glucosa al intermediario (2,5-DKG), con
una eficiencia del 94%. Obtiene energía a partir de la oxidación de la glucosa.
o Le vamos a poner al principio una gran cantidad de fuente de carbono que le sea fácil
de metabolizar, y a medida que crezca la biomasa, vamos cambiando la fuente de
carbono por D – glucosa.
• Corynebacterium sp se encarga del paso de dicho intermediario a el producto final, también con
una eficiencia del 94%.
o El intermediario es reducido hasta ácido glucónico
De esta manera, decimos que existen nuevas líneas de investigación que se centran en hacer de este
proceso un proceso dado en una sola etapa. Para ello, están clonando en Erwinia los genes de
Corynebacterium responsables de la reacción; sin embargo, ello presenta ciertos problemas, como los
dados por la inhibición por altas concentraciones de glucosa y baja productividad.
PRODUCCIÓN DE DIHIDROXIACETONA A PARTIR DE GLICEROL
Se trata de un proceso metabólico en el que se oxida el glicerol

para obtener energía. Decimos que es un metabolito primario;
por lo que Acetobacter debe crecer (trofofase). Acetobacter
va a obtener energía de la oxidación de gliceol, luego siempre
habrá que ponerlo como fuente de carbono aunque al
principio pongamos otra de más fácil metabolización y
vayamos cambiando.
Por lo tanto, el glicerol actúa como fuente de C, en un proceso que es aerobio. Como producto metabólico
recogeremos la dihidroxiacetona. Esta producción es muy interesante ya que sus usos van destinados
hacia la producción de lociones solares y cosméticos.
Aunque, como podemos entender, las bacterias del ácido acético son muy usadas; pueden no ser las
únicas (cepas de Gluconobacter Melanogenus se ha visto que, en medio enriquecido con O2, pueden
llegar a triplicar su producción).
22
Además de la producción de dihidroxiacetona, hablaremos de la producción de otras sustancias no

esteroideas con importantes utilidades: prostaglandinas y antibióticos.
PRODUCCIÓN DE PROSTAGLANDINAS
Son ácidos grasos insaturados de 20 carbonos, que funcionan como hormonas. Se usan como
anticonceptivos, para aliviar dolores del parto o para tratamientos de enfermedades congénitas de
corazón. Es importante recalcar que pueden obtenerse por transformaciones microbianas (con hongos)
de ácidos grasos insaturados.
TRANSFORMACIÓN DE ANTIBIÓTICOS
El objetivo de este campo no es producir como tal, sino llevar a cabo transformaciones de sustancias
conocidas para ampliar así su espectro, mejorar su absorción oral, y reducir su toxicidad y resistencia.
TRANSFORMACIÓN DE PESTICIDAS
Es importante mencionar que todos los pesticidas no son biodegradables, depende del número de
halógenos y de donde estén situados. Ellos pueden transformarse en reacciones para la obtención de
energía, o en reacciones de cometabolismo (básicamente quiere decir que es una sustancia el pesticida
capaz de producir procesos metabólicos, lo que pasa es que su generación no implica una producción de
energía como tal, sino que es parte de la ruta y ya).
Al hablar de la capacidad de estos pesticidas para que se den reacciones metabólicas o cometabólicas (no
implica ganancia de energía), debemos decir que las que sí implican una ganancia son las reacciones redox.
Las reacciones metabólicas son otras, como la hidroxilación o la condensación. Además, las reacciones
microbianas de transformación decimos que son muy específicas, algo que las hace más ventajosas
respecto a las reacciones químicas (la especificidad conlleva un gasto mayor, a su vez).
Entrando en materia, decimos que las arqueas metanógenas y bacterias sulfato reductoras, trabajando
en anaerobiosis, van a crecer con dicho sustrato y, como fruto de su metabolismo, generarán reacciones
de cometabolismo, con el que eliminarán cloros o ciertos halógenos.
Entonces, en un tratamiento dado, por ejemplo, sobre tierra, las condiciones de anaerobiosis
mencionadas podrían darse encharcando dicha tierra con exceso de agua. Sin embargo, ¿cómo sabemos
cuánto tiempo debe estar en anaerobiosis?
Para entenderlo, lo ejemplificamos con degradadores del petróleo. Para ello, aislamos de nuestro hábitat
metabolitos que degradan el petróleo (lo que nos interesa en nuestro caso ejemplo). Entonces, lo
echamos en placa y sembramos. Si no crece, es porque aún tiene muchos cloros que les resulta tóxico e
impide su crecimiento. Vamos muestreando ese hábitat hasta que el microorganismo crezca, lo que
significa que ya se han eliminado los cloros que eran tóxicos, debido a que se ha dado esa reacción
cometabólica y transformación tras haber mantenido las condiciones óptimas necesarias para ello.
El objetivo de estas transformaciones es la de la mineralización.
Entonces, una vez visto esto, iremos tratando la transformación y degradación de diferentes compuestos
o elementos
23
COMPUESTOS HALOCARBONADOS (COMO TCE, PCE (SIEMPRE SERÁ EL MEJOR PARTIDO),

HALOFENOLES)
Los compuestos halocarbonado son moléculas de hidratos de carbono en el que alguno de los hidrógenos
se ha sustituido por un halógeno. Es importante en la transformación de pesticidas la eliminación de
alguno de estos halógenos (no todos); los suficientes para que no sea tóxico. Esto se logra mediante una
deshalogenación reductiva, lo que es un proceso cometabolico (no lo hacen para obtener energía, sino
que lo hacen como producto de su crecimiento).
Para ello, las condiciones serán anóxicas; mientras que las bacterias se deben tener en trofofase (hace
falta que las bacterias estén metabolizando). Este proceder es el dado para aquellas sustancias que
presenten un alto número de halógenos, y viene dado por arqueas metanógenas y BSR.
Por otro lado, en caso de que hablemos de sustancias con un bajo número de halógenos, lo que se llevará
a cabo es un proceso de oxidación hasta ácido graso, y una posterior beta-oxidación hasta CO2 y agua.
El proceso aquí descrito es mejor si se da bajo condiciones de anaerobiosis que si se da en condiciones de

aerobiosis (en este caso se daría una mineralización por parte de Phanerochaete y Arthrobacter).** NO SE
SI ES AL REVES**
PERCLOROETILENO
Si solo tuviéramos el etileno, podría oxidarse con los hidrocarbonoclásticos en aerobiosis y
biomineralizarse a CO2 y agua. Para que esto pase, hay que quitarle cloros. No habrá que quitar todos,
sino solo tantos como dejen de ser tóxicos para los microorganismos hidrocarbonoclásticos y otros.
Esta molécula no puede ser atacada porque tanto cloro resulta tóxico, no por otra cosa. Se les quita por
transformaciones microbianas en anaerobiosis. Este proceso se llama deshalogenación reductiva, y lo
hace una población microbiana formada por arqueas metanógenas y bacterias sulfatoreductoras en
condiciones de anaerobiosis.
En estas condiciones van eliminando los cloros y sustituyéndolos por hidrógenos. Cuanto más tiempo los
tengamos en anaerobiosis, más cloros se van a eliminar y podemos llegar a una sustitución parcial o total
EJEMPLO 1
Se contamina el jardín con un derrame de pesticida (PCE)
Primero encharcar para crear condiciones de anaerobiosis (encharcando con aguas residuales, de forma
que los microorganismos que van a degradar el pesticida, mostrados a continuación, van a encontrarse
en condiciones óptimas), donde las arqueas metanógenas y las bacterias sulfato reductoras van a
comenzar a deshalogenar, van a degradar el pesticida, pero sin obtener energía.
Como sabemos cuánto tiempo tenemos que estar. Tenemos que muestrear a lo largo del tiempo, es decir,
tomamos un microorganismo de ese hábitat y le metemos una muestra de la zona del jardín contaminada
con PCE como única fuente de carbono y dependiendo de si muere o no el microorganismo querrá decir
que requiere más tiempo o que no.
Para parar el proceso aramos y creamos condiciones de aerobiosis donde los microorganismos van a
poder degradar estos PCE debido a que las arqueas metanógenas y bacterias sulfato reductoras le han
quitado los cloros (Cl2 se evapora) que le hacían que esa sustancia fuese tóxica, por lo que ahora en
condiciones de aerobiosis y sin toxicidad van a poder actuar los microorganismos hidrocarbonoclásticos
reduciendo el pesticida a CO2 y H2O.
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DDT no es fácilmente biodegradable, debido a que tiene demasiada acumulación de cloros. Por ello, hay
muy pocos microorganismos que pueden llevar a cabo esa deshalogenación.
COMPUESTOS NITROAROMÁ TICOS
Su biodegradación viene dada por hidroxilaciones del anillo aromático y posterior ruptura del mismo. Es
una degradación lenta como tal, pero más favorable en anaerobiosis. A veces lo que sucede es que no se
llega a la mineralización, sino que se forman polímeros.
Entonces, aunque estos compuestos no sean el sustrato de nuestros microorganismos, estos son capaces
de degradarlo (por transformación), pudiendo llevar a cabo una transformación de degradación total o
parcial, como ya habíamos mencionado (siempre que alguna enzima no se de cuenta que se está actuando
sobre un sustrato que no es el propio). De esta manera se puede obtener la biodegradación. A
continuación, se representa un ejemplo
Como vemos en la imagen, las cadenas con los grupos nitro van a poder ser intercambiados por grupos
amino, y es algo que nos interesa debido a su toxicidad. Sin embargo, no hay ningún proceso que las
pueda eliminar como tal, solo se pueden sustituir.
Este programa de biorremediación, si lo hacemos en aerobiosis, solo podremos sustituir un grupo nitro;
mientras que en condiciones de anaerobiosis podemos llegar a sustituir los 3 nitros (tal y como se
representa en la imagen). No hay ningún proceso que, con el resultado, nos lleve a radicales hidrógenos
que puedan ser aprovechados por otros organismos. Entonces, el TNT no es biodegradable** (no
podemos reducirlo a CO2 y agua), como mucho, lo que hacemos es reducir su toxicidad. Al final,
tendremos una molécula que polimeriza y que se quedará en el ambiente para siempre (recalcitrante).
Esto es un problema muy persistente en los campos de tiro.
PETRÓLEO: HIDROCARBUROS DE CADENA MEDIA LARGA (MINERALIZACIÓN EN

CONDICIONES AEROBIAS)
Es un ejemplo de reacción metabólica, pueden usar alcanos e hidrocarburos alicíclicos y aromáticos como
fuente de carbono para obtener energía. Estos se llaman bacterias hidrocarbonoclásticas que hemos
mencionado ya en el ejemplo anterior. Entre ellas están Artrobacter, Pseudomonas, Bacillus, Aspergillus…
Son géneros que estarán en los hábitats de por sí, cuando se produce un vertido de petróleo no
necesitamos inoculantes, sino que hay que favorecer el crecimiento de los que ya hay ahí para que puedan
degradar el petróleo.
25
Como sabemos, el petróleo se trata de una mezcla de hidrocarburos. Algunos de estos serán fuente de
carbono de microorganismos quimioorganotrofos. Los hidrocarburos en cuestión serán los de cadena
media. Los de cadena corta suelen ser volátiles, por los que se evaporan; mientras que los largos suelen
ser tóxicos, por lo que no pueden ser biodegradables y se deben retirar manualmente (no son
biodegradables porque poseen un PM muy elevado para los microorganismos, al igual que pasa con el
plástico).
Los hidrocarburos de cadena media son fuente de quimiorganotrofos heterótrofos que viven en el medio.
Lo usarán como fuente de C en un proceso de respiración aerobia. Ese hidrato de C será degradado, tras
una fosforilación oxidativa, a CO2 y H2O.
A este proceso se le conoce como biomineralización: paso de compuesto orgánico a sus componentes
inorgánicos más simples.
Este proceso de oxidación es metabólico, es decir, se va a obtener energía. Se da gracias a la

monooxigenasa, que cataliza la oxidación del hidrato de C a aldehído, que es esa primera reacción (la
primera oxidación, que podría darse en condiciones químicas, pero es lenta). Da igual que el hidrocarburo
sea alifático, aromático, etc; puesto que nuestra enzima lo que hará es
CÍCLICOS
• Si es un ciclo, lo romperá (lo abre y se transforma a
alifático, donde a partir de ahí sigue la oxidación)
• Si es alifático, la oxidación será sobre el C terminal (en el
caso del ciclo, la oxidación será doble, dada en los dos
extremos). En esta última, como ya veremos, los
intermediarios serán diferentes.
• Si son aromáticos se produce una biodegradación aerobia.
Se oxidan a cis,cis-dihidrodioles, que son inestables y se
convierten espontáneamente en catecoles. Estos son abiertos por
rotura oxidativa, dando ácido cis,cis-mucónico que después es
oxidado hasta ácido adípico (ácido dicarboxílico). Este ácido es
oxidado (-oxidación).
Los microorganismos podrán degradar independientemente a cada

uno de ellos, dando igual los intermediarios. La reacción a la que
acaban entrando es beta-oxidación, a la que entran todos, dando
igual si es ciclo o no.
AROMÁTICOS
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EJEMPLOS: QUEREMOS REMEDIAR LA GASOLINA QUE SE HA VERTIDO EN NUESTRO JARDÍN.

Vamos al jardín y hacemos un proceso de screening para ver si hay microorganismos capaces de
degradarlo. Posteriormente, haremos un cultivo de los mismos (debemos llevarlos a trofofase a velocidad
máxima). La temperatura que les pondremos será la ambiental, el pH lo mantendremos en torno a la
neutralidad (dependiendo del microorganismo y sus condiciones).
• Fuente de C: petróleo añadir tierra para que el hidrato de carbono sea del 10% (dilución fuente
de carbono)
• Fuente de Nitrógeno: medir el índice NPK del suelo y si está bien, no añado nada, si está mal,
puedo añadir una sal, peptona
• Fuente de fósforo por encima de 10mM
• T ambiental
• Agua y arar para mantener condiciones aerobias
• pH neutro
Con mantener esta serie de condiciones, potenciamos a los microorganismos degradadores de petróleo,
teniéndolos en condiciones óptimas de crecimiento. Mientras estén en trofofase, ellos serán los
encargados de la degradación.
Además, debemos recordar que antes de la preparación del cultivo, tenemos un mix de hidrocarburos de
los cuales nos interesan los de cadena media. Los de cadena corta se volatilizan; mientras que los de
cadena larga se separan como alquitrán de manera manual.
MISMO EJEMPLO, PERO DADO EL DERRAME EN EL MAR

Si el derrame es en el mar, se hace exactamente lo mismo. Lo primero que se hace es esperar a que se
forme la mancha (la extensión de la mancha en el mar se diluye, de manera que su concentración será
menor del 10%). Entonces, ¿de qué nos preocupamos? Pues de que el residuo es apolar, y el agua es polar.
Por lo tanto, la biodegradación será en la interfase entre agua y mancha. Por ello, debemos hacerla lo más
grande posible, que se rompa en trozos lo más pequeño posible, cosa que se logra con biosurfactantes.
De esta manera, aumentamos la interfase y aceleramos el proceso de biodegradación. Esto es lo único de
lo que debemos preocuparnos, el resto del proceso tendrá el mismo fundamento.
27
Tema 12: Producción

de Aminoácidos
28
INTRODUCCIÓN
A comienzos del siglo XX se descubrió en Japón que el glutámico posee cualidades mejoradoras del sabor
de los alimentos; hasta que se vió que un microorganismo concreto (Corynebacterium glutamicum) era
capaz de producirlo y excretarlo en grandes cantidades. Su producción por métodos bioquímicos se
extendió, al igual que su uso: mejora del sabor y conservación de alimentos; aditivos de alimentos
humanos y piensos animales; medicina; industria química; o industria de cosméticos.
Ahora sería interesante destacar que hay procesos que compiten en la producción de aminoácidos. Estos
son la extracción a partir de proteínas hidrolizadas, la síntesis química y la producción por
microorganismos. Dentro de esta última, hay tres enfoques posibles: fermentación directa de
aminoácidos, producción mediante técnicas de ADN recombinante o producción con enzimas
inmovilizadas.
Algunas de las principales aplicaciones de los aminoácidos son:
• Mejora de sabor y conservación de alimentos

• Aditivos de alimentos humanos y piensos animales
• Medicina
• Industria química
• Industria de cosméticos
AMINOÁCIDOS COMO METABOLITOS
Se tratan de metabolitos primarios, donde mantenemos al microorganismo en trofofase. Sin embargo, al

aminoácido como tal no lo va a excretar de primeras debido a la necesidad que tienen de los mismos. Por
lo tanto, decimos que lo primero que debemos hacer es tener a nuestro microorganismo en su óptimo
(velocidad de crecimiento máxima); pero no será ahí cuando recojamos nuestro metabolito (el
microorganismo lo usará primero para él mismo). De esta manera, decimos que se trata de un metabolito
primario tipo 2, pero eso sí, no muy claro. A modo de conclusión, podemos asegurar que se trata de un
metabolito de tipo 2 debido a que el pico de velocidad máxima no coincidirá con el pico de producción,
pero con ciertos matices que lo hacen raro.
PRODUCCIÓN CON L -GLUTÁMICO
Este aminoácido en concreto es el más importante desde el punto de vista cuantitativo. Su producción es
muy alta, presentando un precio de 1,2 ADA/Kg. Sus usos son variados: cocina oriental, sopas, salsas,
snacks, etc.
Es importante mencionar las características de las cepas productoras de L-glutámico: son cepas de
bacterias Gram-positivas, normalmente no móviles y no esporulantes del grupo Brevibacterium-
Corynebacterium, incluyendo Arthrobacter y Microbacterium. Todas las cepas comerciales tienen un
buen rendimiento de producción (más de 30g/l glutámico).
Para el glutámico vamos a poder trabajar con la cepa silvestre, pero

modificando las condiciones para que esto funcione, para que super produzca
el glutámico. Estas cepas en concreto presentan una especie de “fórmula
mágica” para poder excretar glutámico sin necesidad de que las mismas pasen
por un programa de mejora de cepas. Esta fórmula mágica se fundamenta en
las siguientes tres características:
• Aumentar la permeabilidad de la membrana
29
• Mantener bajas concentraciones de O2

• Mantener alta la concentración de ión amonio
Con esto conseguimos burlar al microorganismo
PRODUCCIÓN
EFECTO DE LA PERMEABILIDAD SOBRE LA PRODUCCIÓN DE GLUTÁMICO

Entonces, decimos que además de lo normal, al cultivo debemos añadir sustancias para permeabilizar la
membrana. Debemos añadir penicilina (hay que tener cuidado con su efecto en gram +), por ello debe
controlarse la cantidad de penicilina añadida, que debe ser la mínima (para solo abrir poros, pero sin llegar
a romper el peptidoglucano y romper así la pared celular).
Ahora, una vez abiertos los poros en la pared celular, debemos hacer lo mismo en la membrana. Si
aumentamos la permeabilidad de la membrana citoplasmática, aumentaremos por ende la producción y
excreción de glutámico. La permeabilidad de la misma se puede aumentar por tres mecanismos (actuando
sobre diferentes auxótrofos, adición de ácidos grasos saturados o adición de penicilina). Procederemos a
describirlos:
• Biotina: Sabemos que nuestras bacterias en cuestión son auxótrofas naturales para la biotina
(es el único caso que veremos de auxótrofos naturales) por lo que, si hiciéramos a nuestro
medio de cultivo mínimo en biotina, su membrana se volvería anómala, no tan robusta. Cabe
destacar que no puede faltar la biotina, simplemente, al ser mínimo, debemos añadir una
pequeña cantidad para que no sintetice bien los ácidos grasos de su membrana.
o Podemos explicar el mecanismo de la deficiencia de biotina, aunque la profesora se lo
pasó por los huevos: si la concentración de biotina es mayor de 5 microgramos/l, la
biotina funciona como grupo prostético de la acetil-CoA carboxilasa (la primera enzima
de la ruta biosintética de ácidos grasos), lo que conlleva la síntesis de ácido oleico,
generando así un gran contenido de fosfolípidos de membrana. Entonces, el glutámico
se retiene y acumula hasta que, por retroinhibición, se detiene la síntesis del mismo. En
caso de que la concentración sea inferior a la estipulada, se evita dicha inhibición.
o Por el contrario, si la concentración de biotina es menor a 5 microgramos /l, va a
disminuir la síntesis de ácidos grasos → disminución de fosfolípidos → aumento de
permeabilidad → excreción de glutámico → se evita la retroinhibición
• Ácido oléico: Si nuestra bacteria es auxótrofa para el oleico, deberíamos hacer lo mismo, pero
con respecto al ácido oleico.
• Glicerol: Si nuestra bacteria es auxótrofa para el glicerol, deberíamos hacer lo mismo, pero con
respecto al glicerol.
Estos son los tres casos de auxótrofos posibles, siendo el de la biotina el típico debido a que, como ya
hemos mencionado, nuestras bacterias lo son de manera natural.
• Ácidos grasos: Por adición de ácidos grasos saturados, de una longitud de 16 a 18 carbonos, o
sus derivados. Este método lo usaremos en el caso de que no sean auxótrofos, ya que también
intervienen en la propia síntesis de ácidos grasos de la membrana, al reprimir a la enzima acetil-
CoA carboxilasa.
• Penicilina: Por adición de penicilina, siguiendo el mismo proceder que en la pared celular.
Al tratar este tema, estamos viendo que solo nos centramos en el L-Glutámico, pero ¿por qué? ¿Por qué
no otros aminoácidos? Las razones se exponen a continuación:
30
1. La cantidad de glutámico en la célula es muy superior a la de otros aminoácidos (200

mM frente a unos pocos mM o menos).
2. Las células podrían tener unos transportadores de flujo específicos de glutámico con el
objeto de mantener un equilibrio de aminoácidos en el interior, en el caso de que
aumentara la concentración de aminoácidos intracelulares.
IMPLICACIÓN DE UN CICLO DE KREBS INCOMPLETO EN LA SUPERPRODUCCIÓN DE

GLUTÁMICO
La presencia de biotina es determinante
en este aspecto, y es que, si se encuentra
presente en una concentración suficiente,
no habrá excreción de glutamato; sin
embargo, en el caso de que nuestro medio
sea deficiente en cuanto a biotina se
refiere, sí habrá excreción de glutamato.
Los desencadenantes de la deficiencia en

cuestión son la excreción del glutamato ya
vista, y una baja concentración de
oxígeno. Esto impedirá la oxidación
completa a CO2 y agua, haciendo así que
se acumule alfa-cetoglutarato. Los
requisitos para que esto suceda es una
baja concentración de oxígeno y unos
niveles suficientes de amonio (NH4+).
Hasta aquí todo lo podéis memorizar bien, pero ¿sabéis qué puto significado biológico tiene todo esto de
la producción de glutamato? Pues no, ni yo tampoco, así que lo copio tal cual la diapositiva:
• Si la bacteria crece en un medio pobre en biotina (suelo, agua), la excreción sirve para reducir la
presión sobre la membrana citoplasmática (más permeable).
• Al limitar la producción de lactato, sirve para mantener neutro el pH.
• Sirve para la regeneración de NAD(P)+:
α-ketoglutarate + NH3 + ATP + NADPH + H+ → l-glutamate + ADP+Pi + NADP+
Esta reacción está catalizada por una glutamato deshidrogenasa (GDH) dependiente de NADPH. El
metabolismo de los productores de glutámico se trata de una oxidación incompleta. Aunque la oxidación
incompleta rinde menos ATP que la completa, es más ventajosa que la fermentación anaerobia. Pues el
glutamato nos permite regenerar el NAD(P)+, para poder llevar a cabo la reacción y obtener así energía.
REGULACIÓN DE LAS ENZIMAS DE LA BIOSÍNTESIS DEL GLUTÁMICO

Las enzimas reguladas presentan diversas vías de regulación, claro está que unas lo estarán más que otras.
En el momento en el que haya una alta concentración de amoniaco (además de las otras condiciones
anteriores), saltamos a la vía menos regulada: de esta manera super producimos glutámico (no se da el
ciclo de krebs por la carencia de O2 y porque hemos preparado a la membrana con biotina para que se
pueda excretar). Se presentan a continuación las dos vías, la más regulada (vía GS-GOGAT) y la menos
regulada (vía GDH):
31
CONDICIONES DEL PROCESO INDUSTRIAL
El objetivo es buscar las condiciones óptimas para nuestras bacterias con las que, en este caso,
lograríamos una conversión del 60% del carbono que le añadamos hacia L-glutámico. Los parámetros en
cuestión que afectan al proceso son:
• Fuente de carbono:
o Monosacáridos: glucosa y sacarosa (también fructosa, maltosa, ribosa y xilosa)
o Melazas de caña de azúcar o remolacha azucarera sin sustancias tóxicas; adicionadas de
penicilina o ácidos grasos porque las melazas contienen biotina por lo que habrá que
controlarla
o Hidrolizados de almidón
o Acetato
• Fuente de Fósforo
• Fuente de nitrógeno:
o Sales de amonio o amoniaco, que lo que permiten es controlar el pH.
o Urea, donde la mayoría de productores son ureasa-positivos.
o Factores de crecimiento:
▪ Biotina
▪ Cisteína
• Sal
• Factores de crecimiento:
o Biotina: dependiendo de la fuente de carbono; 10% de glucosa → 5 ug/L de biotina,
acetato → 0,2 – 1,0 ug/L
o Cisteína. Tiamina (medios con n alcanos). Hay que ponerlo sí o sí, pero tiamina solo si la
fuente de carbono son alcanos.
• pH neutro
• Temperatura ambiental
• Penicilina: en pocas cantidades, pero suficiente
• Suministro de oxígeno: kd es de 3,5 *10-6mol O2/atm*min*ml
PRODUCCIÓN DE OTROS AMINOÁCIDOS
Las células no excretan fácilmente los aminoácidos, ya que son sillares constitutivos de biomasa, para
cuya síntesis la célula gasta ATP. Para los procesos industriales ha habido que recurrir a mejorar las cepas,
en la mayor parte de los casos por métodos genéticos que tienden a alterar los mecanismos reguladores
originales.
32
SOBREPRODUCCIÓN DE INTERMEDIARIOS: MUTANTES AUXOTROFOS
La estrategia que vamos a seguir es obtener mutantes defectivos para la enzima que usa a dicho
intermediario como sustrato. Esto supone que el mutante es auxotrófico para el aminoácido de esa ruta.
Así, se trata de seleccionar auxotrofos para ciertos aminoácidos, tras un tratamiento previo mutagénico.
Sistema de selección: selección por penicilina
PRODUCCIÓN DE L – ORLITINA
Destacar que en este caso estos aminoácidos son intracelulares y que, además, hay que preocuparse de
las enzimas que degradan estos aminoácidos porque la bacteria los necesita, son intermediarios, por lo
que, como hemos dicho anteriormente, habrá que hacer u mutante que inactive las enzimas que lo
degradan.
Vamos a necesitar el siguiente mutante:
• Mutante auxotrofo con respecto a L-arginina alterada en la enzima ornitina transcarbamilasa y

suplementar con L-arginina en poca cantidad, pero suficiente.
• Tras hacer estos programas de mejoras, vamos a acumular muchas mutaciones negativas (más
sensibles a infección por fagos), por lo que tendremos que retrocruzar por fusión de protoplastos
con la cepa silvestre para eliminar esas mutaciones negativas y posteriormente, realizar un
rastreo. TODO ESTO HAY QUE PONERLO EN EL EXAMEN
SUPERPRODUCCIÓN DE AMINOÁCIDOS FINALES DE RUTAS: MUTANTES REGULATORIO S
EL objetivo es lograr mutantes alterados en alguno de los mecanismos de regulación negativa
Entre las ventajas que presenta este proceso destacar que la cepa va a poder crecer en medios complejos
(indefinidos) que son más baratos.
Para la superproducción de estos aminoácidos tendremos que seguir la siguiente ruta:
• Selección de mutantes resistentes a algún análogo estructural del aminoácido, que tenga efectos
tóxicos sobre cepas silvestres, pudiendo deberse este a:
o Su unión al sitio alostérico de la primera enzima de la ruta
33
o Su unión al represor
o En ambos casos desconecta la síntesis de ese aminoácido
• Los mutantes buscados pueden ser:
o Afectados en la primera enzima de la ruta biosintética (insensible a la retroinhibición)
o Afectados en el represor (el mutante no puede reprimir los genes biosintéticos, ni
siquiera en presencia del aminoácido)
• Selección de los mutantes auxotrofos
SUPERPRODUCCIÓN DE PROLINA POR SERRATIA MARCESCENS

• Mutante resistente al antimetabolito tóxico
o Tiazolidín – 4 – carboxílico
o 3,4 – dehidroprolina
• Inactivación de las enzimas que degradan la prolina (prolina oxisas)
• Retrocruzar con la cepa silvestre
SUPERPRODUCCIÓN DE HISTIDINA
• Mutante resistente al anti metabolito tóxico de la histidina, y mutarlo otra vez para que se
altere la enzima que degrade la histidina. También se podrían hacer dos mutantes por separado
y posteriormente realizar una fusión de protoplastos.
o Destacar que hay dos antimetabolítos tóxicos, uno que afecta al sitio alostérico de la
primera enzima de la ruta (2MH) y otro que afecta a la regulación de la primera
enzima de la ruta (TRA)
• Retrocruzar con cepa silvestre
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Lo de la empresa es que hicieron dos mutantes anti metabolitos tóxicos y los fusionaron (fusión de
protoplastos). Se muestra a continuación.
MEJORAS EN RUTAS RAMIFICADAS
La regulación se logra porque uno o unos pocos de los productos finales de la ruta ejerce retroinhibición
sobre la primera enzima común. Algunos ejemplos de rutas ramificadas son la familia del aspártico (lys,
met, thr, ile), la familia del piruvato (val, leu) y la familia de aminoácidos aromáticos (trp, phe, tyr)
PRODUCCIÓN DE LISINA
Corynebacterium glutamicum (hay que saber que este microorganismos produce lisina por una ruta
poco regulada)
Mutante resistente al anti metabolito tóxico de la lisina y al igual que antes, mutar la enzima que
degrada la lisina.
PRODUCCIÓN DE MUTANTES AUXOTROFOS

El objetivo es cortar las ramas que llevan a los otros aminoácidos.
Por ejemplo, en Brevibacterium flavum, un mutante Thr-, Ile-, Met-, produce 34 g/L de lisina. Ello se
debe a:
35
• Los metabolitos se dedican ahora a producir sólo lisina

• La aspartato quinasa solo sufre una pequeña retroinhibición por la lisina sola
• Inconveniente: caro y difícil
PRODUCCIÓN POR MUTANTES REGULATORIOS
MEJORAS POR INGENIERÍA GENÉTICA (DE ESTA PARTE NO DIJO NA EN CLASE)
El uso de tecnología de ADN recombinante permite incrementar la dosis génica de enzimas que
normalmente actúan como cuellos de botella mediante el uso de vectores plasmídicos.
Los problemas que presenta esto son:
• Pérdida de los plásmidos (las cepas deben crecer durante muchas generaciones en los tanques
de fermentación)
• Difícil de conseguir una expresión balanceada de los genes implicados
• Problemas con productos tóxicos resultantes de la superexpresión heteróloga
PROCESOS DE PRODUCCIÓN
Condiciones de trofofase en todos los casos anteriores, además de que, si somos capaces de jugar con la
permeabilidad de la membrana junto con un medio hipotónico fuera, vamos a conseguir que el metabolito
sea extracelular.
36
Tras hacer estos programas de mejoras, vamos a acumular muchas mutaciones negativas (infección por
fagos), por lo que tendremos que retrocruzar por fusión de protoplastos con la cepa silvestre para
eliminar esas mutaciones negativas y posteriormente, realizar un rastreo.
Todos los microorganismos de este tema son quimiorganotrofos heterótrofos, bacterias
• Problemas con las cepas usadas: infecciones por fagos. Soluciones:

o Mutantes resistentes a fagos
o Sustancias inhibidoras de la reproducción fágica
o Esterilizaciión para mantener cultivos puros
o Retrocruzar con cepa silvestre
• Fermentación batch, durante 2 a 4 días, en tanques de hasta 450 m3.
• Aireación
• Temperatura entre 28 y 38ºC.
• El pH se mantiene constante, a valores entre 6.8 y 8.0. Suele controlarse con amoniaco gaseoso.
• Control con sistemas automatizados.
• Biosensores para medir [producto] en el tanque
• Recuperación del producto:
o Centrifugación
o acidificación para precipitar los aminoácidos
o extracción mediante cromatografía de intercambio iónico, diálisis o con solventes orgánicos
37

de Nucleótidos y
Nucleósidos
38
INTRODUCCIÓN
Los nucleótidos son metabolitos primarios son tipo II intracelulares, vamos a tener que trabajar con
mutantes para que sean extracelulares. Los microorganismos van a necesitar estos nucleótidos o
nucleósidos, de forma que nosotros solo vamos a obtener lo que les sobra (velocidad de producción va a
estar desplazada con respecto a la velocidad de crecimiento).
Los microorganismos van a producir nucleótidos, pero los van a expulsar como nucleósidos como forma
general, hay algunas excepciones.
Entre los principales usos de los nucleótidos y

nucleósidos destacamos:
• Potenciadores de sabores
o Ácido guanilico (5’ – GMP)
o Ácido ionosinico (5’ – IMP)
o Ácido xantilico (5’ – XMP)
• Usos terapéuticos (quimioterapia y
herpes)
BIOSÍNTESIS DE NUCLEÓTIDOS DE PURINA Y REGULACIÓN
Hay que tener ojo con la fuente de carbono, hay que usar una fuente impura, pero con mucho cuidado de
que no tengan nada que pueda ser tóxico. En este caso estaría justificado el uso de fuentes puras.
En la ruta de la biosíntesis de purina falta FAICARP después del

AICARP. Se produce IMP, a partir de ahí pasa a:
• Succino-AMP y luego a AMP. El AMP retrorregula a

muchos niveles, muy importante a la PRPP
amidotransferasa, porque corta la ruta. Esta habrá
que tenerla en cuenta siempre.
• XMP para dar lugar a GMP
Las enzimas con flecha verde hacen que de GMP y AMP se

pase de nuevo a IMP (GMP reductasa y AMP desaminasa).
Habrá que desactivarlas si queremos superproducir GMP o
AMP. Para que la ruta se corte en la enzima 2, las dos
retroregulaciones deben existir. Entonces si queremos que
siga solo tenemos que eliminar una de ellas.
La ruta del GMP está más favorecida que la del AMP. Cuando
queramos producir nucleótidos, en la mayoría de los casos
vamos a tener que:
• Producir el nucleótido en la célula.

• Transformarlo a nucleósido induciendo la desfosforilación dentro de la célula, ya que es más fácil
que los microorganismos exporten nucleósidos a nucleótidos.
• Acumularlo y exportarlo como tal.
• Químicamente recuperar el nucleósido del sobrenadante como metabolito extracelular.
• Lo purificamos y fosforilamos para convertirlo en nucleótido.
39
PRODUCCIÓN
PRODUCCIÓN DE 5’ – IMP Y 5’ – GMP POR HIDRÓLISIS ENZIMÁTICA O QUÍMICA DE RNA
1. Crecer la levadura productora de altas concentraciones de RNA (Candida utilis, Sacharoomyces

cerevisiae) en un medio con una baja concentración de C/N, con zinc y con fosfato. Vamos a
realizar un cultivo aireado (airlift)
a. Cuando queremos producir biomasa de levaduras no queremos que se dé el efecto
Crabtree (suprime el metabolismo de fosforilación oxidativa), queremos inducir
fosforilación oxidativa en presencia de oxígeno (ya que son anaerobios facultativos).
Queremos que ocurra el efecto Pasteur (en aerobiosis crecen con fosforilación oxidativa
y lo hacen más rápido, suprimiendo el efecto Crabtree). Por ello las condiciones aerobias
y la baja condición de C/N
2. Extracción del RNA → lisis celular
3. Producción de enzimas para la hidrólisis de RNA bien de origen microbiano o bien de origen
químico
4. Hidrólisis enzimática o química
5. Aislamiento y purificación de 5’ – IMP y 5’ – GMP
PRODUCCIÓN DE 5 – IMP POR FERMENTACIÓN DIRECTA
Hay que superproducir el IMP, lo desfosforilamos dentro de la célula, lo acumulamos y excretamos como
nucleósido, lo recuperamos del sobrenadante y lo fosforilamos a nucleótido. Sin embargo, hay algunos
nucleótidos que las células sí pueden expulsar, y es este.
El IMP puede producirse y expulsarse como nucleótido en Brevibacterium ammoniagenes.
Que puedan expulsarlo como nucleósido hay más microorganismos; como Bacillus, Brevibacterium,
Corynebacterium, Streptomyces y Saccharomyces. Todos quimiorganotrofos heterótrofos ambientales.
Saccharomyces es el único eucariótico de aquí.
Crecerlos en torno a la neutralidad y el último en torno a pH 5. Todos pueden usar la misma fuente de
carbono, se suele usar almidón hidrolizado o glucosa. De nitrógeno puede ser amoniaco. Son m.o.
aerobios o aerotolerantes, necesitaremos poner aireación en el cultivo
MEDIANTE LA PRODUCCIÓN DE INOSI NA Y POSTERIOR FOSFORILACIÓN QUÍMICA

Es una exclusión, se forma como nucleótido y puede ser excretado
tanto como nucleótido como nucleósido, en este caso lo excretaremos
como nucleósido y en el siguiente como nucleótido.
Tendremos que conseguir mutantes con las siguientes condiciones:
Mutante para superproducir IMP (expulsándolo como nucleósido):
• Mutante auxótrofo en AMP con respecto a la enzima que va

de IMP a Succino AMP, y añadir AMP poco pero suficiente (en
ocasiones se suele añadir extracto de levadura que tiene AMP,
que es más barato).
• La ruta de GMP se autorregula sola
40
• IMP es un nucleótido, pero nosotros lo vamos a excretar como nucleósido. De forma que hay
que hacer una segunda cepa para tener una actividad nucleotídica aumentada
• Actividad nucleosídica reducida
• Permeabilidad a nucleósidos aumentada
• Retrocruzar con una cepa silvestre (lo normal es realizarlo mediante la fusión de protoplastos)
En total nuestro mutante va a tener que tener 4 mutaciones y al final retrocruzar.
En Bacillus para excretar IMP al medio hay que jugar con la penicilina añadiendo siempre concentraciones
menores que la concentración mínima inhibitoria, Saccharomyces no podremos usar penicilina porque es
un hongo y la penicilina es un antibiótico. También lo van a producir Brevibacterium, Corynebacterium y
Streptomyces.
Para la producción usar como fuente de carbono almidón hidrolizado o glucosa, como fuente de nitrógeno
NH3, pH 6 y condiciones aerobias.
MEDIANTE LA FERMENTACIÓN DIRECTA A 5’ - IMP

Mutante para superproducir IMP (expulsándolo como nucleótido).
• Mutante auxótrofo en AMP con respecto a la enzima que

va de IMP a Succino AMP, y añadir AMP poco pero
suficiente (en ocasiones se suele añadir extracto de
levadura que tiene AMP, que es más barato).
• Actividad nucleotídica reducida
• Permeabilidad de la membrana a nucleótidos
Esto se hace en la cepa de Brevibacterium ammoniagenes, se

escogen los mutantes que conservan más estable el nucleótido y los
que lo excretan mejor
MÉTODO UTILIZADO POR ALGUNAS EMPRESAS

Tercer método realizado por algunas empresas. Tendremos que
conseguir mutantes con las siguientes condiciones:
• Mutante auxótrofo en AMP en la enzima que va de AICARP

a IMP, añadiendo AMP poco pero suficiente.
• Actividad de las enzimas que usan sustrato reducida
• Mutación para la permeabilidad de la membrana
• Esto lo hacen algunas empresas debido a que encuentran
microorganismos con una mayor facilidad de expulsión de
AICARP. Tras recogerlo lo oxidan químicamente a IMP, lo que
les sale más barato.
41
MEDIO DE CULTIVO
• Fuente de Carbono: melazas a menos que usemos biotina (solo para Corynebacterium y la otra)
para aumentar la permeabilidad de la membrana o un hidrolizado de almidón, hidrolizado de
celulosa
• Fuente de nitrógeno: extracto de levadura (messirve como fuente de N2 y como fuente de AMP,
y GMP de forma que la ruta se corta por la zona de GMP)
• Fósforo y Azufre lo medimos
• Sal
• Agua
• Condiciones aerobias
PRODUCCIÓN DE 5’ – GMP POR FERMENTACIÓN DIRECTA
Se va a expulsar como nucleósido y no se van a obtener cantidades importantes.
SUPERPRODUCCIÓN DE AICAR Y DESPUEÉS CONVERSIÓN QUÍMICA A 5’ – GMP

Lo del AICARP no se usa en este caso, se puede usar teóricamente, pero
no va a ser rentable, si pregunta en el examen el AICARP es para
superproducir IMP, pero bueno lo explico por si acaso. Vamos a necesitar
el siguiente mutante:
• Auxótrofo en AMP alterado en la enzima que actúa sobre AICARP

• Mantener AICARP estable, es decir, que las enzimas que lo
degraden estén desactivadas
• Membrana permeable a AICARP
• Se usan cepas de Bacillus Megaterium, Bacillus subtilis y
Brevibacterium
Una vez fuera, filtramos, nos quedamos con el sobrenadante, purificamos

y lo convertimos químicamente al GMP.
Precauciones: proceso afectado por la esporulación, así que se utilizan

inhibidores de la esporulación como el ácido butírico.
MEDIANTE LA PRODUCCIÓN DE GUANOSINA POR FERMENTACIÓN DIRECTA Y POSTERIOR

FOSFORILACIÓN
• Mutante auxótrofo de AMP alterado en la enzima que va de

IMP a Succino AMP, añadiendo extracto de levaduras
• Mutante resistente al anti metabolito tóxico de GMP
• Alterado en la enzima que lo usa para gastar GMP (enzima con
la flecha verde) GMP reductasa
• Actividad nucleotídica aumentada
• Actividad nucleosídica disminuida
• Aumento de permeabilidad a nucleósidos
Excretamos nucleósido, filtramos, quitamos la biomasa y nos quedamos

con el sobrenadante, purificamos y fosforilamos hasta GMP
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PRODUCCIÓN DE NUCLEÓTIDOS DE ADENOSINA Y ADENINA
PRODUCCIÓN DE ADENOSINA
Tendremos que conseguir mutantes con las siguientes condiciones
(microorganismo usado Bacillus subtilis):
• Mutante resistente al anti metabolito tóxico de AMP

• La ruta de GMP se retrorregula sola
• Alterado en la enzima AMP desaminasa
• Actividad nucleotídica aumentada
• Actividad nucleosídica reducida
• Aumento de permeabilidad de nucleósidos
PRODUCCIÓN DE ATP
Fosforilación de adenina y adenosina en presencia de fosfato y glucosa o metanol. El microorganismo
productor es Candida noidinii
43

de Antibióticos
44
INTRODUCCIÓN
Un antibiótico es un metabolito secundario extracelular producido por ciertos organismos

(fundamentalmente bacterias y hongos) que inhiben el crecimiento o matan a otros microorganismos a
bajas concentraciones.
Si queréis una contextualización histórica, miradlo en el anexo número tus putos muertos, gilipollas.
En cuanto a los principales productores de antibióticos, tenemos a las bacterias y a los hongos.
• Las bacterias producen más de 6000 antibióticos. Es muy habitual que una misma especie
produzca varios antibióticos diferenetes.
o Destacando el género Actinomicetos (Streptomyces y parientes), que producen más de
5000 antibióticos.
o El otro género productor a destacar es Bacillus (producción de antibióticos peptídicos).
Es muy habitual además que una misma especie produzca varios antibióticos diferentes.
• En cuanto a los hongos, destacamos:
o Ascomicetos y Deuteromicetos (Penicillium, Cephalosporium, Aspergillus). Estos
pueden servir para inhibir el crecimiento de microorganismos competidores.
Como podemos intuir, las aplicaciones de los antibióticos son muchas y muy variadas: en clínica (contra
patógenos de humanos y animales); en agricultura (contra patógenos vegetales); como agentes
antitumorales (algunos antibióticos con anillos policíclicos se intercalan en la doble hélice del ADN de
células en proliferación activa, por lo que se pueden usar como citostáticos frente a tumores malignos);
como conservantes de alimentos; o en ganadería.
Los antibióticos pueden actuar a 4 niveles:
• Inhibir la síntesis de la pared celular

• Desorganizar la membrana celular
• Interferir a nivel de citoplasma con la síntesis de proteínas
• Interferir a nivel de los ácidos nucléicos
En cuanto a los tipos de antibióticos, los clasificaremos según dos parámetros diferentes:
• Según estructura química:

o Antibióticos a base de carbohidratos
o Aminoacídicos y peptídicos
o Lactonas macrocíclicas
o Derivados alicíclicos
o Quinonas y relacionados
o Aromáticos
o Alifáticos
• Según su modo de acción:
o Antibacterianos
o Antifúngicos
o Antitumorales
45
OBJETIVOS DE LA INVESTIGACIÓN SOBRE ANTIBIÓTICOS
Uno de los objetivos es obtener mejoras de la fermentación industrial y del rendimiento, con reducción
de costos. Para ello, lo que se busca es un desarrollo aplicado de un nuevo antibiótico (su coste es muy
alto, por lo que muchos no llegan a la fase clínica).
Otro de los campos a los que se busca llegar cada vez más (ya lo hace) es a la medicina humana. Para su
aplicabilidad en dicho campo, debe cumplir una serie de condiciones: lograr mejoras de actividad y
disminución de efectos colaterales indeseados; tener un amplio espectro de acción antimicrobiana;
presentar una mayor selectividad contra ciertos patógenos; además de constituir una serie de
propiedades farmacológicas mejoradas.
Finalmente, el objetivo final viene dado por una visión de futuro en la que se necesitan antibióticos
efectivos frente a micosis sistémicas, frente a protozoos, virus, parásitos y tumores; también frente a
patógenos de plantas; por el futuro surgimiento de cepas resistentes.
BASES EN LA MEJORA DE LA PRODUCCIÓN DE ANTIBIÓTICOS
BASES FISIOLÓGICAS
Como bien sabemos, son metabolitos secundarios que se producen en la idiofase. Suelen ser moléculas
complejas, con rutas biosintéticas con regulaciones que no se conocen. Por tanto, la fermentación es
dificultosa y no es posible la fermentación continua. Además, parece que su producción está acoplada a
la formación de endosporas.
En cuanto a su producción, decimos que está regulada por la represión catabólica. Entonces, para evitarla,
lo que se hace es añadir la fuente de C, N y P (<10mM) a pequeños incrementos, para así aislar a aquellos
mutantes insensibles a la represión catabólica. En algunos casos parece existir un mecanismo de
retrorregulación, por lo que podría evitarse si el antibiótico se excreta.
Como la producción de antibióticos parte de metabolitos primarios, es posible diseñar mejoras mediante
la manipulación de los mecanismos de control de estos metabolitos primarios precursores (es una forma
de mejorar la producción de metabolitos secundarios, como ya vimos, actuando sobre la del primario del
que depende).
Además, para la fermentación en sí se necesitan las siguientes condiciones:
• 1ª Fase: comienza con esporas, que germinan y crecen. Las células estarán sumergidas, habrá
aireación y un buen suministro de nutrientes (trofofase).
• 2ª Fase: Al entrar en la fase estacionaria (idiofase) hay que añadir pequeños incrementos de
fuentes de C, N y P.
MEJORA GENÉTICA CLÁSICA
Se puede llevar a cabo programas de mejora genética basado en diferentes técnicas:
• Mutagénesis al azar y screening: se trata de llevar a cabo una mutagénesis (con altas dosis de
mutágeno), seguido del aislamiento de los mutantes. Entonces, haremos bioensayos con el
filtrado. Es un método laborioso y poco efectivo.
• Recombinación in vivo: Sabemos que hay diferentes técnicas para ello:
o Sistemas sexuales y parasexuales: Todos los genes que regulan la producción de
antibióticos están agrupados en un operón, entonces es fácil mejorar las cepas
mediante tecnología de ADN recombinante mutando en este operón. Si hacemos un
46
programa de mutagénesis mutando este operón, alguna mejora o empeoramiento

conseguiremos. Seleccionamos qué mutantes han acumulado mutaciones justo en este
operón, y entre ellos habrá algunos que nos interesen.
▪ Se hacen muchos ciclos de mutaciónes y al final se retrocruza el mutante
superproductor (débil en crecimiento y sensible) con la cepa silvestre vigorosa.
Ejemplo: Penicillium (aprovechando su parasexualidad) y Streptomyces (por
conjugación, ya que los genes de biosíntesis de antibióticos se agrupan en loci
concretos, operones).
o Intercambio de alelos in vivo: esta técnica se basa en sembrar en un medio mínimo
nuestra cepa huésped (con mutación marcadora auxotrófica) y fagos sometidos a un
fuerte tratamiento mutagenizante que presenten genes marcadores restauradores de
prototrofía. Esto lo que supondrá es una selección de un hospedador prototrófico
portador de una versión modificada (y eventualmente superior) de la ruta del
antibiótico.
▪ Usamos partículas fágicas (virus) que contengan los genes responsables de la
lisogenia y les introducimos el operón responsable de la producción de
antibiótico que presenta un gen de restauración de la prototrofia y
posteriormente mutamos
▪ Por otro lado, tenemos a la célula hispedadora, que presenta una mutación
auxótrofa. Vamos a poner en contacto fagos y célula hospedadora, en la que
se va a producir recombinación y se va a integrar el genoma del fago en la célula
hospedadora.
▪ Finalmente, sembraremos en medio mínimo, de forma que las que siguen
siendo auxótrofas no crecerán, mientras que las que hayan integrado el
genoma del fago (que presentaba genes restaurados de prototrofia) si
crecerán. Por último, asilamos a cada uno de los recombinantes y mediante
prueba de actividad de placa veremos si la mutación que presentan nos
interesa o no.
o Selección racional: el objetivo de esta técnica es acortar el propio screening. Para
encontrar productores de, por ejemplo, penicilinas y tetraciclinas, debemos atender a
lo que son o cómo actúan dichas moléculas. Sabemos que las penicilinas y tetraciclinas
son quelantes de metales pesados. Seleccionando los mutantes más resistentes a tales
metales permite encontrar hiperproductores.
Dentro de este rastreo racional, podemos hacer un estudio de la producción de cefamicina por parte de
Streptomyces, que sigue la siguiente ruta:
Para dicho rastreo, debemos llevar a cabo un aislamiento de mutantes resistentes a esta inhibición:
cultivar en medio mínimo con análogo de lisina (S-(2-aminoetil)-L-cisteína). Tales mutantes
superproducen lisina, y así, cefamicina.
Otro ejemplo de rastreo racional sería el dado para algunos antibióticos que son tóxicos para el organismo
productor. El rastreo se basaría en buscar cepas con mayores niveles de resistencia a su propio antibiótico,
permitiendo así incrementos de productividad.
47
• Fusión de protoplastos: en muchos microorganismos carentes de sexualidad o conjugación, se

puede lograr la mezcla y eventual recombinación de genomas mediante la fusión de
protoplastos. Esta técnica ha tenido gran impacto en la mejora y generación de nuevos
antibióticos.
INGENIERÍA GENÉTICA
Antes de su descripción, debemos recalcar, como bien sabemos, que se usa poco. Esto es debido a que
requiere mucha información sobre el microorganismo, que generalmente no la tenemos.
Sin embargo, de aquellos de los que sí se tiene información y secuenciado el puto genoma, pues esta
técnica se ve facilitada ya que genes que codifican la producción de antibióticos suelen agruparse en un
determinado locus. Además, se pueden buscar homologías con genes ya clonados. Para ello, se pueden
diseñar sondas de ADN o búsquedas por ordenador en genomas secuenciados. A su vez, como ya hemos
visto en otras asignaturas, si se dispone de una enzima purificada de la ruta biosintética, se pueden usar
Ac frente a esa enzima para buscar los genes. A continuación, se presentan las aplicaciones que tiene la
ingeniería genética en la producción de antibióticos:
• Creación de antibióticos híbridos por transferencia de genes de un antibiótico a otra cepa

productora de otro antibiótico relacionado.
• Ingeniería metabólica, para mejorar el rendimiento y la productividad de las cepas:
o Manipulando los genes estructurales de la ruta biosintética
o Manipulando los genes reguladores
ESQUEMA GENERAL DEL PROCESO INDUSTRIAL
El esquema de producción a nivel de planta industrial lo dividiremos en las siguientes etapas:
• Preparación del inóculo: Se parte de cultivos conservados, que pueden pasarse hacia agar
inclinado, del que se derivan cultivos secundarios (para evitar la fase lag). Será a partir de estos
cultivos secundarios donde se generen gran cantidad de esporas.
• Fase de crecimiento y producción de nutrientes: el medio tiene exceso de nutrientes, por lo que
el cultivo crece rápidamente durante uno o dos días, produciéndose abundante biomasa.
• Fase de producción del antibiótico, que va según el sistema de trabajo:
o En sistemas discontinuos: el nutriente clave pasa a ser un nutriente limitante, por lo
que se da comienzo a la idiofase y, por ende, producción de nuestro metabolito
(antibiótico). Dicho nutriente limitante será la glucosa para Penicillium, y el fosfato para
Streptomyces.
o En sistemas discontinuos alimentados: se mantiene la idiofase más tiempo añadiendo
el nutriente clave de modo muy controlado y en momentos determinados.
• Etapa de cosecha (recuperación y purificación del antibiótico): son extracelulares. Se separa la
biomasa del sobrenadante por filtración o centrifugación. Entonces, se lleva a cabo una
extracción (por solventes, intercambio iónico, ultrafiltración, etc.), para así precipitar y cristalizar.
De esta manera habríamos logrado recuperar nuestro antibiótico y purificarlo.
ANTIBIÓTICOS BETA-LACTÁMICOS
Los betalactámicos son los antibióticos más importantes, siendo las penicilinas y cefalosporinas los
agentes terapéuticos antiinfecciosos más empleados.
Se llaman así porque tienen el núcleo beta lactámico básico, y puede tener una estructura diferente según
las variedades. Cada uno es producido por microorganismos distintos, ligada a especie
48
Este tipo de antibióticos va a afectar a Gram +. Estos

lo que hacen es inhibir la síntesis del
peptidoglucano, afectando a los microorganismos
que están creciendo. El betalactámico afecta e
impide que se sintetice ese peptidoglicano (ya lo
vimos en el primer parcial). Su fundamento
bioquímico es que se unen a las proteínas ligadoras
de penicilinas (PBPs), provocando la desorganización de la pared y la lisis de la bacteria en crecimiento en
medio hipotónico. Su toxicidad para animales superiores es muy baja, por lo que se pueden usar altas
dosis.
La producción de beta-lactámicos se basa fundamentalmente en la producción de la penicilina (un tipo de

los mismos), que presenta un altísimo valor de mercado. Sin embargo, las cefalosporinas es el subgrupo
de antibióticos que más dinero mueve en el mundo: su valor anual de mercado está en torno a los 11.000
millones $.
A los beta-lactámicos los podemos clasificar según su núcleo básico:
PENICILINAS
El núcleo de las penicilinas (penam) deriva del ácido 6-aminopenicilánico (6-APA), que consiste en un
anillo beta-lactámico condensado con un anillo tiazolidínico. Decimos que las diversas penicilinas
dependen de la cadena lateral unida al grupo amino del carbono 6. Los productores de penicilina son
Penicillium y Aspergillus.
49
TIPOS DE PENICILINAS
• Naturales: no se añaden precursores de cadenas laterales al medio (penicilina G).
• Biosintéticas: se añaden precursores de cadenas laterales (penicilina V y penicilina F).
• Semisintéticas: se parte del 6-APA (logrado a su vez por tratamiento de la penicilina G), para
luego acilarlo químicamente con diferentes acil-cloruros. Como ejemplos de penicilinas
semisintéticas tenemos:
o Penicilinas insensibles a penicilinasas: meticilina (resistente a ácidos), oxacilina y
cloxacilina (resistentes a ácidos).
o Penicilinas con actividad frente a Gram-negativas: ampicilina y amoxicilina.
o Penicilinas con grupos laterales cargados negativamente: carbenicilina. El hecho de
que sus grupos laterales estén cargados negativamente, hace que estas penicilinas
presenten una mayor estabilidad frente a beta-lactamasas periplásmicas. Se emplean
frente a microorganismos causantes de infecciones hospitalarias, como Pseudomonas,
Enterobacter, Serratia y algunas especies de Proteus.
BIOSÍNTESIS Y REGULACIÓN DE PENICILINAS

La regulación dada sobre las penicilinas se basa en una represión catabólica por glucosa y sacarosa.
También se puede ver afectada ante determinadas concentraciones de fosfato y amonio. ¿Cuál es la
estrategia para evitar dicha represión? Suministrar azúcar de modo controlado y fósforo siempre menor
a 10mM.
Para la biosíntesis de la penicilina, cisteína y valina son dos aminoácidos que deben estar en el medio, ya
que con su adición permite que se forme un anillo beta-lactámico condensado en otro, formando así una
estructura conocida como isopenicilina N y formándose como residuo ácido aminoadípico. De la
isopenicilina N, recalcamos la importancia del radical situado en el carbono 6.
Una vez formada dicha molécula, el siguiente paso es romper el radical del carbono 6 y añadirle algo
nosotros. Si es algo que el microorganismo produce por su propia cuenta, la penicilina es natural; si es
algo que hemos incorporado nosotros, la penicilina será sintética.
La penicilina natural es la bencilpenicilina o penicilina G,

en este caso el residuo que se introduce es el
fenilacético. El nombre nos dice el residuo que ha
incorporado, bencil, que es producido por nuestro
microorganismo.
De esta forma penicilina natural será cuando lo que se

introduzca en el carbono 6 se produzca por el
microorganismo y biosintética cuando lo que se pone
en el carbono 6 es algo que adicionamos nosotros al
medio para que el microorganismo realice la
transformación.
En las semisintéticas los residuos que añadimos para

que sustituyan al ácido aminoadípico son tóxicos para el
microorganismo, si los introducimos tal cual
mataríamos al catalizador biológico. Extraemos la
bencilpenicilina o la natural, y una vez se ha excretado
la recuperamos y químicamente cortamos el residuo y
añadimos lo que queramos.
50
DESARROLLO DE CEPAS PRODUCTORAS DE PENICILINA

Para el desarrollo de cepas productoras, se aplicó el método de selección aleatoria, aunque se diseñaron
técnicas que mejoraron el rastreo: medida de halos de inhibición en placas agar, resistencia a metales
pesados…
Más tarde (años 70) se comenzó a usar la selección racional, recombinación in vivo y fusión de
protoplastos. Aunque la ingeniería genética aún no ha tenido resultados prácticos industriales, se han
localizado y aislado genes para la síntesis de la penicilina, se dispone de una genoteca de P. chrysogenum
(cepa de mayor rendimiento) y de un sistema de transformación del hongo, que permite hacer
manipulación genética in vitro.
La mejora de cepas no solo va dirigida a la mejora en el producto, sino también a la mejora del proceso:
selección de esporulación mejorada, de morfología en bolitas, de resistencia a las fuerzas de cizallamiento,
de resistencia a las cadenas laterales tóxicas…
MEJORA DE PRODUCCIÓN DE PENICILINAS

Para la producción de penicilina de una manera efectiva, debemos atender a los siguientes puntos de
condiciones y forma de trabajo:
El microorganismo usado será aquella cepa de mejor rendimiento: Penicillium chrysogenum. Recordar
que Penicilium es un hongo y como tal, va a producir micelio, por lo que, para la producción de las mismas,
se llevará a cabo una fermentación sumergida discontinua, controlando constantemente las condiciones
el medio para evitar que el micelio crezca excesivamente. Se realiza en fermentadores de 40.000 a
200.000 litros. En ellos, se realizará un control del suministro de oxígeno para mantener la aerobiosis (0.4-
0.8 mM/l·min). Además, se precisará de unos impulsores de turbina, que trabajarán a 120-150 rpm.
Si no lo podemos hacer en fermentación sumergida también se puede realizar en sólido, pero en este caso
se va a dificultar la recuperación del antibiótico.
Respecto al medio de cultivo, será definido a continuación:
• Fuente de Carbono: lactosa (glucosa o sacarosa en incrementos pequeños controlados).

Presenta un rendimiento efectivo del 10%-20% de la fuente de C utilizada. El rendimiento teórico
es mayor, del 50% de la fuente de C.
o Recordar la represión por catabolitos de glucosa y sacarosa. Estos nutrientes si se van a
poder encontrar cuando estemos en trofofase, pero en idiofase tenemos que elminarlos
para que no ejerzan retroinhibición
• Fuente de Nitrógeno: licor de macerado de maíz, soja, extracto de levadura. El amonio también
ejerce represión por catabolitos
• Fuente de Fósforo: menor a 10 mM
• Tampones para mantener el pH.
• La temperatura óptima está entre 25 y 27ºC.
• El pH óptimo se encuentra entre el rango de 6.5 -7.7. Como vemos, el pH es neutro, pero ¿eso
cómo va a ser? Nos preguntamos esto debido a que nuestro microorganismo es un hongo
(acidófilo, ¿no?). Sí, sin embargo, lo que pasa es que nos la suda, debido a que no buscamos
óptimos, estamos trabajando en idiofase. Sin embargo, lo que sí nos interesa es la estabilidad de
la penicilina producida, y eso se logra a un pH neutro. Por ello, queremos ese pH, por la
estabilidad de nuestro producto, la del productor nos la suda porque estaríamos trabajando en
idiofase.
51
o Destacar que antes de inducir la idiofase, vamos a estar en trofofase, para aumentar la
densidad microbiana, y en este caso, si usamos pH ácido. Cuando tengamos ya la
suficiente densidad microbiana ponemos pH neutro e inducimos idiofase como hemos
dicho anteriormente.
• Cadena lateral (fenilacético o fenoxiacético), que se suministra de modo continuo y
cuidadosamente controlado, para evitar los efectos tóxicos. Cabe recordar que si a nuestro
medio en cuestión le añadimos cadenas laterales, la penicilina que se producirá será biosintética.
PRODUCCIÓN EN PLANTA
En el fermentador pintado de amarillo, decimos que se produce la trofofase, para luego forzar la idiofase.
Al ser extracelular nuestro metabolito, filtramos el micelio, quedándonos con lo que se cuela, que es el
sobrenadante. Finalmente se purifica por cristalización.
Una parte difícil del proceso es lograr la aireación, que es dependiente de la agitación.
CEFALOSPORINAS Y CEFAMICINAS
El núcleo de las cefalosporinas se denomina cefén, estando

fusionado el anillo beta-lactámico a un anillo dihidrotiazina.
Estas son derivadas del ácido 7-aminocefalosporánico (7-ACA),
en el que este grupo amino situado en la posición 7 se sustituye
por residuos acilo.
Los organismos productores de estas moléculas son los hongos de los géneros Cephalosporium,
Acremonium, Emericellopsis y Paecilomyces. Son moléculas de un amplio espectro, que presentan una
mayor estabilidad frente a la enzima penicilinasa de los estafilococos.
Aparte de la cefalosporina C, todas las cefalosporinas son semisintéticas: se parte de cefalosporina C, a la

cual se le rompe químicamente el enlace amido en la posición 7: entonces, lo que se hace es cambiar los
sustituyentes en 7 (y a veces en 3).
En cuanto a las cefamicinas, se deben a procariotas de los géneros Streptomyces y Nocardia, y se

diferencian esencialmente de las cefalosporinas en la presencia de un grupo metoxi (-O-CH3) unido al
carbono en posición 7.
52
Decimos entonces, con el fin de diferenciar cefalosporinas de cefamicinas, que, aunque ambas son beta-
lactámicos, presentan divergencias en cuanto a sus radicales, como ya hemos mencionado. Además, es
importante recalcar que la cefalosporina es producida por un hongo; mientras que las cefamicinas las
producen actinomicetos. En cuanto a las condiciones de cultivo para obtener biomasa, en cada uno de los
casos será diferente, debido a sus condiciones metabólicas. En ambos casos, el problema del micelio es
igual que al caso anterior, ya que va a dificultar las condiciones de aireación y agitación.
Como ya habíamos hecho mención, las cefalosporinas constituyen el grupo concreto más importante de
antibióticos, con una cuota de mercado de casi el 30%. Se producen comercialmente unas 15
cefalosporinas o cefamicinas diferentes (espectro amplio).
BIOSÍNTESIS Y REGULACIÓN
A diferencia de las penicilinas, la cadena lateral no se puede cambiar
biológicamente cambiando el medio de cultivo, por lo que las
cefalosporinas son semisintéticas o naturales.
En cuanto a la biosíntesis, si atendemos a la reacción descrita en la

imagen, vemos que los primeros pasos de la biosíntesis comparten
similitud con el de la penicilina en sí. Sin embargo, esto es hasta la
marca roja: hasta este punto nuestro microorganismo productor
comparte ruta con Penicillium. Lo que suceda ahora en nuestra ruta
en cuestión sí será diferente.
¿***Preguntar realmente si la original es por adición de elemento

natural a C2; y que luego se añade uno diferencial al 7 o al 3***? -
Entiendo que lo que se adiciona al carbono en posición 7 constituye
el residuo 3, y que hay tres residuos (el 1 nos la suda, el 2 se añade
de manera natural, y el 3 es lo que diferencia cefalosporina y
cefamicina.
La isopenicilina evoluciona hasta la formación de un anillo. Luego,

empiezan a entrar radicales a dicho anillo, los cuales irán a
posicionarse al carbono (o residuo) 2. Lo que el propio
cephalosporium fabrica entra al residuo dos, y esas son las
cefalosporinas o cefamicinas naturales.
Ahora veremos que la diferencia entre cefalosporina y cefamicina) es lo que está unido al carbono 7, como
ya habíamos mencionado. Lo que va unido puede ser hidrógeno u otra cosa, y constituye el residuo 3.
Entonces, los derivados metabólicos entran al residuo 2 (del residuo 1 no nos preocupamos); y del residuo
3, decimos que si es cefalosporina, puede ser cualquier cosa; en el otro caso, siempre habrá un grupo
metoxi-.
Por tanto, a diferencia de las penicilinas, que podían ser naturales, sintéticas o semisintéticas; las
cefalosporinas y cefamicinas no serán biosintéticas. Esto es debido, principalmente, a que los
microorganismos productores de las mismas (cephalosporium y actinomicetos) son muy sensibles a
cualquier cadena lateral. Por lo tanto, pueden ser naturales o semisintética. Respecto a este último tipo,
decimos que pueden ser semisintéticas si accedemos y modificamos el residuo 1 (ese que nos sudaba la
polla). Entonces, rompemos el residuo 1 y añadiremos lo que nos salga de los huevos, eso sí, a partir de
una de esas moléculas de tipo natural.
53
Respecto a la regulación, se da una represión catabólica por glucosa, glicerol, maltosa; además de por
fosfato y nitrógeno, por lo que debemos controlar bien sus cantidades para evitar dicha regulación.
Respecto a los hongos, pequeñas cantidades de lisina estimulan la producción de cefalosporina, mientras
que a mayores concentraciones se ejerce retroinhibición sobre la síntesis de alfa-AAA.
En cuanto a la regulación de la lisina, debemos añadir que es muy compleja. Tenemos que tener cuidado
si queremos producir cefalosporina, puesto que no podríamos trabajar con mutantes que super
produzcan lisina, debido a que la retrorregulación en Cephalosporium es muy difícil de inhibir. Lo que sí
haremos es añadir un poco por nuestra cuenta, pero no podríamos obtener dichos mutantes.
Además, la adición de metionina, cisteína y valina es capaz de estimular la síntesis de cefalosporina.
Por tanto, en nuestro medio usamos carbohidratos puros. Sin embargo, si quisiera utilizar melazas, por
ejemplo, debería asegurarme de que éstas me van a rendir buenas concentraciones de sacarosa y glucosa,
y me debo asegurar también de que puedo controlar bien el ritmo de corte.
ANTIBIÓTICOS AMINOGLUCÓSIDOS
Los antibióticos aminoglucósidos son oligosacáridos que consisten en un aminociclohexanol unido por
enlace glucosídico a otros aminoazúcares.
Se conocen más de 100 antibióticos aminoglucósidos, siendo sus productores los actinomicetos del
género Streptomyces. Este tipo de antibiótico es usado contra bacterias Gram negativas. A modo de
ejemplo, decimos que Streptomicina y dihidroestreptomicina se usan para tratar la tuberculosis.
Este tipo de antibióticos son usados como antibióticos de reserva, por las apariciones de resistencias.
Además, son un campo de estudio muy importante ya que se están buscando y desarrollando nuevos
productos de mejor eficacia y menores efectos secundarios mediante técnicas de mejora de cepas
(algunos de sus efectos secundarios son daño renal y sordera).
Son muchos los nuevos antibióticos semisintéticos que están surgiendo con el fin de mejorar la formación
de resistencias: fortimicinas, derivados de kanamicina y netilmicina.
Respecto a la actuación de estos antibióticos, se sabe que actúan inhibiendo la síntesis de proteínas. Se
insertan en la subunidad 70S del ribosoma y se producen péptidos anómalos, que se insertan en la
membrana y rompen la bacteria.
BIOSÍNTESIS Y REGULACIÓN
No se sabe muy bien cuál es el proceso de producción, entonces no se sabe cómo intervenir en él. Sí se
sabe que está ligado a la esporulación, y hay una señalización de la que depende. Esta está mediada por
el factor A; cuando Streptomyces lo detecta en el medio lo interpreta como señal y se induce la expresión
de los genes que codifican la producción de estos antibióticos, así como la esporulación. El
microorganismo va a requerir el factor A poco pero suficiente.
Tienen represión catabólica de N, fundamentalmente por amonio, entonces hay que tener ojo con
introducir cosas que rindan amonio en idiofase. También inhiben los carbohidratos y fosfato. Depediendo
de la cepa será un residuo u otro el que produzca retroinhibición.
MEJORA DE CEPAS Y PRODUCCIÓN

Mientras las cepas salvajes producen 10-200 μg/mL; las mejoradas producen más de 1400. Los métodos
para dicha mejora son mutación y screening (técnica de antibiograma) o fusión de protoplastos.
54
PRODUCCIÓN
Respecto a la producción, señalaremos los siguientes puntos de interés y condiciones para la misma:
• Microorganismo: bacterias del género Streptomyces.

• Fermentación sumergida discontinua (en ocasiones funciona discontinuo alimentado), en
fermentadores de hasta 150.000 litros; con un control del suministro de oxígeno para mantener
la aerobiosis. Debe presentar un tiempo de fermentación de 4-7 días, para que pueda darse tanto
trofofase como idiofase.
El medio de cultivo usado será el siguiente:
• Fuente de Carbono: glucosa con almidón o dextrina que se usarán en la trofase, y
posteriormente, se irán sustituyendo por fuente de lenta metabolización como almidón, de
manera que favorezcamos a la idiofase
• Fuente de Nitrógeno: soja (porque se metaboliza lentamente).
• NaCl (1-3 g/L)
• Co 2+, Zn2+
• Temperatura óptima: 28-30 ºC.
• El pH ~ 7, los antibióticos son estables a este pH.
• Condiciones aerobias
• Recuperación del producto en el sobrenadante, dada por acidificación con ácido sulfúrico (pH =
2) y purificación.
55

de Biopolímeros
56
POLISACÁRIDOS
La importancia de los polisacáridos es tan variada como sus usos: modificación de propiedades reológicas
de fluidos; estabilizantes de suspensiones; flocular partículas; encapsular materiales; producir emulsiones
(agentes emulsificantes). Aún así, la producción industrial de polisacáridos microbianos es sólo un 4% del
mercado, siendo el más importante el xantán.
Estos polisacáridos serán secretados, que básicamente es lo que conocemos como EPS. Este EPS es tan
variable como la cepa, puesto que depende del metabolismo del microorganismo y del ambiente en el
que se encuentra. Además, como ya hemos visto en temas pasados, es capaz de retener todos los
nutrientes que pasan alrededor del microorganismo que lo excreta. El problema de los polisacáridos no
es producirlos, sino recuperarlos, que es donde más se gasta, debido a que va a formarse adherido a la
pared celular del microorganismo o formando mallas laxas alrededor.
GOMA DEL XANTÁNO
La evolución de este metabolito fue relativamente rápida: se descubrió su producción por parte de
Xanthomonas campestris, hasta llegar a su producción comercial, llegando a ser aprobada por la FDA
para su uso en alimentos. Es un metabolito primario
ESTRUCTURA
Su estructura se fundamenta en unidades de D-glucosa unidas por
enlaces beta - (1 → 4), en el que una de cada dos glucosas alternantes
lleva en posición 3 un trisacárido, que desde la posición proximal a la
terminal es alfa-D-manosa-beta-D-glucurónico-alfa-D-manosa. La
manosa proximal está acetilada en 6, mientras que la manosa terminal
lleva un pirúvico unido mediante enlace cetal a sus posiciones 4 y 6.
En solución, el xantán forma una doble hélice rígida dextrógira, con

una simetría de orden 5 y un paso de rosca de 4.7 nm. Las dos cadenas
se disponen de modo antiparalelo, y las ramas laterales de trisacáridos están estrechamente alineadas
con el esqueleto del polímero. A su vez, diversas dobles hélices interaccionan lado con lado, formando
mallas, que a su vez generan fibrillas microcristalinas. Esto es importante porque el xantano funciona
como un pseudoplástico: cuando está en reposo, se mantiene rígido.
Entonces, la estabilidad de las fibrillas va a depender de la estabilidad de la malla, que a su vez va a

depender de la interacción interna y externa de la hélice. Esto a su vez va a depender de la estabilidad de
la cadena lateral del trisacárido, del grado de acetilación y piruvilación. De forma que cambiando la
longitud de la cadena y el grado de acetilación o piruvilación vamos a conseguir xantanos con propiedades
diferentes.
Además, decimos que la propia viscosidad del xantán depende de dos factores: tamaño molecular y
cantidad de piruvatos cetales.
PROPIEDADES Y APLICACIONES
Sus aplicaciones son básicamente 60% no alimentarias y 40% alimentarias. Sus usos:
• Espesante, emulsificante y estabilizante en alimentos preparados: las soluciones diluidas de

xantán poseen alta viscosidad, que se mantiene uniforme si la concentración de sal es 0.1% o
superior.
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• Comportamiento pseudoplástico, si lo añadimos a una solución va a mantener a este en un

estado semisólido, y al agitar, esta solución pierde esa rigidez y se vuelve más fluída.
• Componente de lodos de perforación en pozos petrolíferos.
PRODUCCIÓN
La biosíntesis del xantán se produce de manera similar a la del peptidoglucano. Las enzimas claves vienen
codificadas por 12 genes agrupados en el operón gum. Como hemos dicho anteriormente es un
metabolito primario extracelular, pero va a ir asociado a la célula
Dependiendo de lo que queramos, podemos usar unas fuentes más puras para nuestra producción que
otras: para usos clínicos, podemos usar carbohidratos puros; mientras que para otras utilidades se puede
usar fuentes menos puras.
Para la recuperación, aunque sea metabolito extracelular, está ligado a la célula. Filtramos, nos quedamos
con las células y pasteurizamos el cultivo (no nos podemos quedar con las células). Una vez hemos
pasteurizado, lo que se hace es recuperar el xantano con isopropanol (este es el paso más caro): por cada
volumen de xantano le echamos el triple de isopropanol (esto es caro, obviamente).
Ahora, describiremos pasos y condiciones de producción, como hemos hecho para otros metabolitos:
• Fermentación discontinua (batch) o discontinua alimentada (fed batch) en fermentadores de

50.000 a 200.000 litros.
• Microorganismo: cultivo puro de X. campestris.
• Presenta un problema: si la concentración de xantano aumenta, la viscosidad también aumenta.
• En cuanto al cultivo:
o Fuente de C: glucosa, sacarosa o almidón, además de melazas. Las cepas de E. coli
manipuladas portadoras de los genes gum pueden crecer en lactosuero, usando la
lactosa.
o Fuente de N: extracto de levadura. Proporción óptima C:N es de 10:1.
o pH = 7. Hay que mantenerlo añadiendo sosa periódicamente.
o T = 28ºC, es un compromiso entre el óptimo para el crecimiento (24-27ºC) y el óptimo
de producción de xantán (30-33ºC).
o Condiciones aerobias: se requiere un flujo de aire alto, y debido a cuanto más xantano
haya más viscoso sea el medio, es te proceso se dificulta, y por ello será el que limite el
proceso.
o Medio Líquido:
Para el xantán destinado a alimentación, el fermentador se desconecta cuando se agota la fuente de
carbono. Entonces, se pasteuriza el cultivo, se precipita el xantán añadiendo isopropanol, se seca el
precipitado y se muele y empaqueta. Como ya habíamos mencionado, el 50% de los costes de producción
derivan del procesamiento downstream, por lo que para abaratar hay que recuperar el solvente orgánico
(isopropanol).
MODIFICACIÓN DE LA ESTRUCTURA DEL XANTÁN

Los grupos acetilo estabilizan la conformación ordenada del xantán. Los grupos carboxietilo, por el
contrario, poseen un efecto desestabilizador sobre la conformación ordenada.
Diferentes cepas de X. campestris sintetizan xantanos que difieren en el porcentaje de grupos acetilo y
piruvato (carboxietilo). Además del uso de estas cepas, para buscar dicha estabilidad se puede llevar a
cabo modificaciones en el medio de cultivo y en las condiciones ambientales; además del uso de
58
mutagénesis mediante transposones. La idea clave es tener claro que el grupo acetilo estabiliza; mientras
que el carboxietilo hace lo contrario.
POLIÉSTERES: POLIHIDROXIALCANOATOS
El problema de los plásticos es que no suelen ser biodegradables, y esto es así debido a que son
hidrocarburos de cadena muy larga; y si recordamos cuando hablábamos sobre el petróleo, cuando la
cadena alcanza cierta longitud es tóxica para los microorganismos que pudieran degradarla.
Los polihidroxialcanoatos (PHA) son un tipo de plástico degradable, en concreto biodegradable, producido
por bacterias (100% biodegradables). El otro tipo es fotodegradable.
ESTRUCTURA
Son poliésteres de reserva producidos por bacterias sometidas a condiciones de estrés, las cuales los
sintetizan en varias formas químicas, entre los cuales el polihidroxibutirato (PHB) es el poliéster de cadena
más corta. Las unidades pueden consistir desde 3C o 4C, hasta 14C – 16C, según la cepa y el medio de
cultivo.
Dependiendo de la longitud de la cadena lateral de sus unidades monoméricas, en concreto de la cadena

lateral del C3, (propiedad que puede ser ajustada modificando la composición del medio de cultivo o
manipulando genéticamente a la bacteria productora), se pueden obtener PHA de diferentes puntos de
fusión, cristalización, flexibilidad, resistencia a la tracción, biocompatibilidad y velocidad de
biodegradación.
El alto coste de producción puede ser disminuido mediante el mejoramiento de los procesos de
fermentación y separación; mediante el desarrollo de cepas más eficientes y usando una fuente de
carbono barata (representa el 40% del coste).
Además, los poliésteres son termoplásticos, es decir, polímeros que se funden por encima de cierta
temperatura, pero que se endurecen al enfriarse.
Estos bioplásticos son biodegradables, porque existen muchas despolimerasas que generan
microorganismos para usar estos polímeros como fuente de carbono. Es un hidrato de carbono, y hay
muchos microorganismos capaces de usarlos como fuente de carbono.
Los bioplásticos se denominan en general PHA. Cuando la cadena es de 3C, lo más corto posible, se
denomina PHB (polihidroxibutirato), que es el PHA más corto posible. Cuando varía el número de
carbonos va cambiando el nombre.
POLIHIDROXIALCANOATOS EN LA NATURALEZA
Los PHAs se acumulan como gránulos de reserva cuando la bacteria crece en un medio con abundante
fuente de C, pero limitado en N o en P. Cabe destacar que el primer PHA fue descubierto en 1926 por M.
Lemoigne en Bacillus megaterium. Desde entonces se han descubierto más de 40 PHA en más de 90
géneros de bacterias, tanto Gram-positivas como Gram-negativas. Las bacterias que producen PHA se
pueden clasificar en dos amplios grupos:
• Grupo de Ralstonia eutropha (hongo quimiolitotrofo del hidrógeno, mixótrofo): PHAs de

cadena corta (monómeros C3-C5). Esto es debido a que, en el momento en el que le falta
carbono, despolimeriza el polímero que ha formado. Es por esto que si usamos Ralstonia, no
podemos permitir que le falte carbono, porque si no cambiaría la ruta hacia su despolimerización.
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Al ser quimiolitotrofo del H2 destacar que podemos suministrarle H2 como gas o bien asociarlo
a un proceso que lo produzca, como lo que ocurre en vertederos
• Grupo de Pseudomonas oleovorans (quimiorganotrofo ambiental): PHAs de cadena media
(monómeros C6-C14).
Al ser un componente que se acumula como gránulo de reserva, el microorganismo debe notar que hay
exceso del nutriente esencial, en este caso el carbono, y que hay otro que empieza a ser limitante. Con
esto vemos que es un metabolito primario de tipo 2 intracelular, ya que no está asociado al crecimiento
óptimo de nuestro microorganismo.
Destacar que no en todos los microorganismos la fuente de carbono que se acumule va a tener
propiedades de bioplástico, los microorganismos que van a formar bioplásticos son los que hemos
mencionado anteriormente.
BIOSÍNTESIS Y DEGRADACIÓN DE LOS POLIHIDROXIALCANOATOS

La producción del bioplástico depende de tres genes:
PhaA, PhaB y PhaC. El primero codifica una enzima que
es una cetotioliasa, el segundo una acetoacil-coA
reductasa y el tercero una PHB sintetasa. El operón se
puede usar para introducirlo en E.coli y expresar los genes
de manera heteróloga para obtener las proteínas
recombinantes, y producir los bioplásticos directamente
en E.coli.
Primero vamos a producirlo en Ralstonia: cuando detecta

la falta de nutriente y hay mucho C en forma de glucosa,
condensa dos unidades de Acetil-coA en una de
acetoacetil-coA y de aquí continúa hasta que forma una
unidad de hidroxibutirato. Si continúa condensando, se
van añadiendo PHB a la cadena.
Si en algún momento la fuente de carbono falla, Ralstonia tiene una despolimerasa que es capaz de
romper el polímero que había formado y poder acceder al C, por eso en la producción no podemos
descuidar el carbono. Es por esto que interesa expresarlo en E.coli y hacer la producción ahí, ya que E.coli
no tiene esta despolimerasa.
Cambiando la fuente de carbono podemos variar el número de carbonos de la subunidad en cultivos de

Ralstonia.
• Exceso de glucosa se va a formar el PHB, que tiene 3C.

• Si hay exceso de otra fuente de C como el propiónico o valérico entonces formará PHV (de 4 y
5C).
Realmente el PHB no es tan bueno como una mezcla de PHB y PHV, combinando subunidades de ambos
mejoramos propiedades. Esto se hace suministrando junto con glucosa el propiónico y valérico, así cuando
la bacteria incorpore glucosa, formará PHB, y lo mismo con los otros; y se ordenan de manera aleatoria.
Además, jugando con la cepa podemos obtener cadenas laterales que mejorarán aún más el bioplástico
El medio de cultivo empleado será el siguiente:
• Fuente de energía: hidrógeno producido por las bacterias fermentativas
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• Fuente de carbono: fuente de carbono orgánico, glucosa es la mejor en este caso, pero es muy
caro, por lo que puedes usar también melazas. Podría usar un carbohidrato puro o almidón. No
le restringimos el carbono para que produzca bioplásticos
• Fuente de Nitrógeno: viene con las melazas, al igual que P y S
• Fuente de P: por encima de 10 mM
• pH neutro
• T ambiental
• Intracelular: recoger biomasa, lisar las células. Los PHA son insolubles en gua, necesitamos
solventes orgánicos o detergentes para recuperarlos
BIOSÍNTESIS DE COPOLÍMEROS Y DE POLÍMEROS DIFERENTES AL PHB

• Formación por adición de fuentes adicionales de C (propiónico o el valérico): copolímeros
aleatorios de 3-hidroxibutírico (3HB) y 3-hidroxivalérico (3HV).
o Controlando las cantidades de estas fuentes adicionales, se pueden obtener
copolímeros con proporciones predecibles de unidades aleatoriamente repartidas de
3HV.
o La incorporación de varios tipos de unidades C3-C5 en los PHA es posible debido a la
relativa inespecificidad de sustratos de las enzimas biosintéticas.
• Formación por Pseudomonas: emplean intermediarios de la biosíntesis de ácidos grasos y de la
beta-oxidación para fabricar PHAs cuando crecen en medios con ácidos alcanoicos (ácido
octanoico, 5 – fenil – valérico)
o Aunque la mayor parte de las bacterias solo puede sintetizar PHA de cadena corta o PHA
de cadena larga, unas pocas tienen la capacidad de producir copolímeros donde existen
tanto monómeros cortos como largos.
PROPIEDADES INDUSTRIALES DE LOS PHAS

Las propiedades industriales no las va a pedir, por lo que le entendí. Sería interesante AÑADIR TABLA para
echarle un vistazo. De dicha tabla mencionó algo de PH (AÑADELO GABRI NO LO PILLE).
PROPIEDADES DE LOS PHB Y COPOLÍMEROS

Son fácilmente biodegradables en una gran variedad de condiciones ambientales, por despolimerasas
excretadas por más de 200 de especies microbianas, que pueden recurrir a estos PHAs como fuente de C
y de energía. Dicha degradación presenta mayor tasa en anaerobios que en aerobios. Además, entre sus
propiedades está la biocompatibilidad.
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PROCESOS DE PRODUCCIÓN
Queremos producir PHB (en este caso el copolímero poli (3HB-3HV)), por lo que, para ello, incubamos
nuestra bacteria en un medio base de glucosa y exceso de sales, salvo de fosfatos, hasta que se obtenga
una determinada densidad celular.
Entonces, se añade glucosa y propiónico (con cuidado para evitar efectos tóxicos) hasta que el copolímero
alcanza el nivel deseado (será un contenido del 70-80% en peso seco).
A continuación, entraríamos en el proceso de downstream con el fin de recuperar estos PHB. Lo que
hacemos es sumergido, filtramos y nos quedamos con las células. Entonces, las rompemos como
queramos (normalmente se hace por calor).
Una vez rotas, debemos quedarnos con esos polímeros, que son hidrófobos. De esta manera, los
recuperamos con solventes apolares, como por ejemplo con detergentes. Normalmente, antes del
detergente, los microorganismos encierran los polímeros en vesículas, por lo que usaremos enzimas o
detergentes para romper las vesículas que los cubren. De esta manera, habríamos solubilizado los
componentes celulares y purificado el polímero apolar; obteniéndose a una pureza del 95% (se recoge
una especie de polvo blanco).
INGENIERÍA GENÉTICA EN LA PRODUCCIÓN DE PHA

La técnica de ingeniería genética seguida es la clonación en Escherichia coli; obteniéndose una
acumulación de un 90% de su peso seco (algo mayor a la ya mencionada (70-80%)). La gran esperanza
para abaratar costes en un futuro es la producción por parte de plantas transgénicas.
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Bebidas Alcohólicas
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PRODUCCIÓN DE VINO
El vino es una bebida alcohólica elaborada por fermentación del jugo de uvas frescas. La graduación de
los vinos varía entre un 7 y un 16% de alcohol por volumen; la mayoría de los vinos embotellados tienen
entre 10 y 14 grados. Los vinos dulces tienen entre un 15 y 22% de alcohol por volumen. A mayor grado
alcohólico, mejor conservación. (no sé ni pa qué pollas explico, solo por si alguno aún no ha salido de
beber Rives xdd).
Sus características dependen del tipo de suelo, condiciones climatológicas, variedad de uva o prácticas
vinícolas aplicadas. Los vinos de denominación de origen tienen características muy particulares que se
dan en ese único lugar, porque todas esas condiciones hacen que el medio de cultivo tenga una
determinada composición química y la comunidad microbiana que vive en la superficie de la uva sea una
en concreto.
Variedades de uvas hay muchas, pero aquí las dividiremos en uva blanca y uva negra. Esta última contiene
mayor cantidad de taninos y pigmentos (antocianinas), que no están presentes en la uva blanca. Además,
decimos que el grado de madurez determina el sabor afrutado o no del vino.
PARTES DE LA UVA INVOLUCRADAS EN EL PROCESO
• Pulpa (85 %): tejido frágil, que al romperse proporciona el mosto. En ella se encuentra el azúcar
(glucosa y fructosa), 75 % de agua, ácidos tartáricos, ácidos málicos y ácido cítrico. Además,
contiene minerales y sustancias nitrogenadas, potasio, hierro, proteínas, péptidos y aminoácidos
libres. Con esto vemos que la pulpa va a ser nuestro medio de cultivo
• Tallos (2-4%): contiene taninos y otras sustancias indeseables. Hay que quitarlos durante el
proceso de despalillado después de la recepción de la uva, debido a que aportan un sabor agrio.
• Piel (12 %): contiene levaduras, sustancias aromáticas y dan propiedades importantes al sabor,
además de ser responsable del color del vino
• Semilla (3 %): gran cantidad de agua y materiales leñosos. Posee lípidos que van a dar mal sabor
al vino por lo que hay que retirarlas.
Otros compuestos involucrados:
• SO2: evita la oxidación de mostos y vinos, fermentaciones salvajes, inhibe las bacterias lácticas y
conserva la frescura y el aroma (reacciona con el acetaldehído y lo bloquea bajo la forma
sulfítica). Va a ser muy importante porque al principio va a inhibir a las bacterias lácticas, que va
a hacer que lo primero que se produzca sea una fermentación alcohólica.
o Esta fermentación alcohólica va a ser realizada por Sacharomyces cerevisae
(quimiorganotrofo heterótrofo que presenta el efecto Pasteur y el efecto Crabtree), que
aunque es sensible a sulfitos, es menos sensible que otras cepas de Sacharomyces o de
levaduras.
o Va a permitir la transición de unos microorganismos y otros
• Ácido cítrico y ácido tartárico: corrigen acidez en vinos (cítrico) y mostos (tartárico).
• Ácido sórbico y ácido ascórbico: son antioxidantes. El ácido ascóbico inhibe la fermentación por
levaduras del vino rosado.
• Tiamina y fosfato amónico: factores de crecimiento.
• CO2: asegura condiciones anóxicas en los tanques de fermentación.
Con esto podemos comprobar que en el zumo de la uva tenemos todo lo necesario para que nuestros
microorganismos crezcan.
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Para hacer vino no tienes que lavar la piel de la uva ya que no te interesa eliminar los microorganismos
que se encuentran ahí, pero si tienes que lavar las uvas antes de comérselas, justo antes de comérselas
ya que los microorganismos permiten conservar mejor las uvas de forma que si las lavamos mucho antes
de comernoslas van a conservarse peor.
RESUMEN GENERAL DEL PROCESO

Se lleva a cabo la recogida, con cuidado de no dañar la uva. Las uvas recién recogidas son prensadas para
que liberen su zumo (mosto), que es rico en azúcares fermentables. Las levaduras presentes en la piel, o
la adición de levaduras seleccionadas al mosto, provocan su fermentación. Entonces, los azúcares
contenidos en el mosto se transforman en alcohol, principalmente, junto con otros compuestos orgánicos
(1 º alcohol / 17 g azúcar).
En cuanto al resultado, los principales productos de la fermentación son alcohol etílico y dióxido de
carbono (liberado en forma de gas). Finalmente, decimos que la fermentación se interrumpe
normalmente cuando todos los azúcares fermentables han sido transformados en alcohol y dióxido de
carbono, o cuando la concentración del primero supera la tolerancia de las levaduras: el mosto es ahora
vino. A continuación, se explicará el proceso con mayor detenimiento
SELECCIÓN
Se realiza una selección manual. Hay que tener cuidado con la higiene para evitar la infección por hongos.
La presencia de hongos nos va a determinar que en la superficie donde se encuentran no vamos a
distinguir la presencia de nuestros biocatalizadores.
RECEPCIÓN
Se mide la cantidad de azúcar que tiene la pulpa de la uva. Se paga por la cantidad de uva recibida en
función de su grado de azúcar.
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DESPALILLADO – ESTRUJADO – PRENSADO

Todos los vinos van a comenzar en el lagar, que además de ser el responsable del estrujado o prensado,
también va a serlo de la separación de la uva y de los palos (despalillado). Esto se hace con dos rodillos
que giran en una dirección opuesta, que presentan unos palos que sobresalen, y al girar, cae la uva
separada del racimo, que se ha quedado enganchado en dichos palos salientes.
Destacar que la principal diferencia de los vinos va a ser el proceso de maceración, que, como veremos,
este proceso no se va a dar en vino blanco, y si se va a dar en tinto y rosado. El proceso de maceración es
el proceso por el que los componentes de los componentes de la piel de la uva, entre ellos el colorante,
pasan a la pulpa.
Dependiendo del tipo de vino que hagamos, nos encontramos con:
• Vino Blanco: en este caso la piel no nos va a interesar, ya que presentan colorantes que no nos
van a interesar para la producción de este tipo de vino.
o Hay que extraer todo el vino el zumo de uva que podamos, proceso que se realiza
mediante el prensado. Los rodillos que presentan este proceso se pueden ajustar para
realizar solo el prensado (vino blanco, rodillos más cerca) o un estrujado (vino tinto y
rosado). En este caso, tras el prensado se forma lo que se conoce como Mosto Yema,
posteriormente se filtra la piel y se pasa al fermentador.
o Este Mosto Yema va a tener tanto el zumo obtenido de la pulpa como la comunidad de
microorganismos presentes en la piel microbiana, el resto de componentes (piel, palillos
que hayan podido atravesar) son eliminados mediante la filtración.
• Vino Tinto: en este caso vamos a estrujar, no se prensa. En este caso no filtramos, de forma que
al fermentador va a pasar la pulpa junto con la piel. Se van a mantener en contacto durante 8
días, entre 20 y 25ºC. Se produce una maceración y fermentación alcohólica. Toda la materia
colorante, además de múltiples compuestos saborizantes y taninos que se encuentran en la piel
de las uvas se van a liberar durante esta etapa de maceración, etapa que no se va a dar en vino
blanco.
o Al finalizar la primera fermentación, gracias al burbujeo de CO2, los hollejos (bagazo,
material sólido que queda tras el estrujado) quedan en la parte superior y se retiran
durante el sangrado, que es la separación del líquido sobrenadante del orujo
obteniéndose el llamado vino de yema, el orujo es prensado y se obtiene el vino de
prensa que es de menor calidad.
• Vino Rosado: en este caso se estruja, igual que antes. En este caso no filtramos, de forma que al
fermentador va a pasar la pulpa junto con la piel. La primera fermentación se hace con los
hollejos y semillas durante un tiempo corto y en frío (24 horas a 10ºC), por lo que no da tiempo
para que se extraigan todos los pigmentos, de ahí a su color rosado.
o Terminada la maceración se saca el mosto gota y el sólido se prensa para obtener mosto
de prensa, de menor calidad. Los mostos se sulfitan y se envían a los tanques de
fermentación. Esta se detiene por el enfriamiento.
FERMENTACIÓN TUMULTUOSA
La uva tiene gran cantidad de azúcares en forma de glucosa y fructosa, que está cerca del 10%, lo que a
provocar el efecto CrabTree (que ya hemos descrito en temas anteriores). La fermentación alcohólica va
a producir también CO2, generando al final condiciones de anaerobiosis dando lugar al efecto Pasteur.
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Además de azúcar, presenta gran cantidad de sulfitos que solo va a permitir crecer al principio a
Saccharomyces y no van a permitir crecer al resto, es decir, el zumo de la uva va a ser un medio selectivo
para Saccharomyces cerevisiae.
En primer lugar, se va a producir una fermentación tumultuosa debido a la gran cantidad de CO2 que se
va a generar, que va a provocar la formación de burbujas, tantas que parece que el líquido hierve. Por
ello, hay que evitar rellenar el fermentador entero, porque sino te revienta, y además este CO2 te va a
crear las condiciones de anaerobiosis.
Además, este CO2 va a hacer que todo lo que es sólido (restos de pieles y huesos) se vaya a la superficie
creando una capa denominada sombrero, que lo eliminamos y nos quedamos solo con el zumo de uva.
Posteriormente, vamos a distinguir entre si queremos vino seco o vino dulce:
• Vino seco: se produce el agotamiento de la fuente de carbono (azúcares). Aunque en España

está prohibido, existe una técnica (chaptalización), que prolonga la fermentación al añadir
azúcares.
• Vino dulce o semiseco: es cuando se te muere el catalizador, sin que se haya agotado la fuente
de carbono (azúcares). Para ello, se puede detener la fermentación por medio químicos (adición
de anhídrido sulfuroso) o físicos (enfriamiento o sobrecalentamiento). También se podría realizar
mediando la adición de más sulfitos de los que requiere la levadura.
o En este caso sobre todo, pero también en el anterior, va a ser imprescindible controlar
la densidad (determinación de azúcar residual), temperatura (rango de funcionamiento
de levaduras entre los 12 – 37 ºC) y la ausencia de oxígeno (cierre hermético de
fermentadores)
Además, hablando del proceso fermentativo, debemos atender a las responsables de nuestra
producción: las levaduras. Usaremos levaduras naturales, aunque también con levaduras aisladas de
viñedos (usamos cultivos mixtos de levaduras). Fundamentalmente se emplean cepas de Saccharomyces
cerevisiae, que es la cepa más resistente a sulfitos y, por ello, estarán presentes en nuestro cultivo: medio
selectivo.
Otras levaduras presentes pueden ser perjudiciales: Kloeckera, Pichia, Trigonopsis, Zygosaccharomyces.
Entre las cepas de S. cerevisiae, las hay de alta temperatura de fermentación (28ºC), que no floculan; y
las de baja temperatura de fermentación, que floculan. Estas últimas son las que más se utilizan.
Las levaduras utilizadas han de soportar altas concentraciones de azúcar y altas concentraciones de
alcohol; además de la presencia de los sulfitos ya mencionada.
FERMENTACIÓN MALOLÁCTICA (SECUNDARIA)

Los siguientes microorganismos en despertar van a ser las bacterias del ácido láctico (BAL) que van a llevar
una fermentación láctica, que va a ser muy importante porque va a corregir la acidez del vino.
Estas bacterias van a transformar el ácido málico en láctico, disminuyendo así la acidez. Decir que el málico
es el que aporta ese sabor a manzana verde agria de sus muertos, típico del vino blanco, pero no del tinto
(que obvio que para el vino tinto no, vete a por sidra si eso puta). De esta manera se obtiene un sabor
más agradable y suave. A veces, incluso se inoculan las BAL de manera artificial (como en el Chardonnay).
Esta fermentación secundaria se puede dar en diferentes momentos del proceso: en el mosto (cuando el
crecimiento bacteriano se anticipa al de las levaduras); en las etapas finales de fermentación alcohólica;
o tras el embotellamiento.
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La fermentación de estas bacterias ocurre cuando “despiertan”, no cuando se haya llegado a un momento
determinado: es debido a la presencia de unas condiciones óptimas (destacamos que los sulfitos no les
afectan) para las mismas.
ENVEJECIMIENTO EN BARRICA
Cuando han actuado las bacterias del ácido láctico como ya hemos descrito, quedaría el último paso: la
estabilización del vino. Este paso busca obtener vinos más estructurados y elegantes con matices de
madera.
Esto se lleva a cabo en barricas (que le da todo el sabor de madera, además que en dichas barricas se
desarrolla otra comunidad bacteriana, las otras Saccharomyces que estaban inhibidas por sulfitos, pero
que al ya no haber, si se desarrollarán). Se llenan ⅔ de la barrica con mosto (para evitar que se derrame
en la fermentación más tumultuosa y para que no reviente). Se suele usar mosto fermentado previamente
en un depósito para evitar derrames.
En las barricas se desarrollará una capa llamada velo en flor: el EPS que tienen dichas “nuevas”
Saccharomyces hacen que floculen (floten), pareciendo migajas de pan. Es decir, en las barricas se forman
flóculos de todas esas Saccharomyces que hasta entonces no habían podido vivir y desarrollarse debido a
la presencia de sulfitos, además de necesitar presencia de glucosa y etanol. Estos flóculos aíslan al vino
del oxígeno y hace que la fermentación ocurra en anaerobiosis (así se evita el desarrollo de las bacterias
del ácido acético). Todo esto todavía es mosto en el que ya no quedan sulfitos pero quedan fuente de
carbono (glucosa + etanol), la fuente de nitrógeno es procedente de las proteínas que contiene el zumo
de la uva.
Las barricas se apilan, siendo las de más abajo de mayor edad (solera) que las que están arriba. Destacar
que con el velo en flor de las barricas de abajo, inoculamos las barricas de arriba. Este velo en flor consume
glicerol, y lo transforma a etanol (el glicerol no nos interesa). Además, produce un aclarado del color.
De esta manera, ya tendríamos vino. Dependiendo de cuánto queramos dejar madurar, estos procesos se
darán en mayor o menor medida, siendo más o menos estable nuestro vino.
Efectos del vello en flor:
• Consumo de glicerina
• Se forma acetaldehído (aroma frutos secos)
• Se aclara el color
• Desarrollo de BAL: disminución acético y etanol
• Hay que evitar que crezca mucho, ya que perderíamos grado alcohólico y se sustituiría por un
sabor avinagrado
CLARIFICACIÓN
El objetivo de la clarificación es que decante la levadura. Para ello, emplearemos clara de huevo
(albúmina). Decantamos y nuestro vino quedará en el sobrenadante.
ENFRIAMIENTO
El objetivo de esta etapa es lograr la precipitación de sustancias insolubles que podrían dar turbidez. Al
tener estas bajas temperaturas, habrá ácidos que sobresaturen, y se formarán sales. Las retiramos
mediante filtrado y ya estaría nuestro vino para embotellar.
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FILTRADO Y EMBOTELLADO
Pues ya te lo bebes puta
CONCLUSIÓN
A lo largo de la explicación de la producción del vino,
hemos hablado del mosto. Básicamente es el resultado
del prensado de las uvas, que produce la formación de un
líquido acídico de pH 3 - 3,9. En cuanto a su concentración,
sabemos que presenta diversos azúcares: glucosa,
fructosa, pentosas y pectinas (la concentración de los
azúcares, como ya hemos visto, depende de la
maduración). Aún así, la concentración en azúcares es
grande, en torno al 10%.
Es importante saber que, durante la fermentación, se va

produciendo CO2. La producción de este CO2 provoca un
emplazamiento del oxígeno, originándose así condiciones
de anaerobiosis. Entonces, cuando esto sucede, los
azúcares pasan a sudarnos la polla, debido a que se está
dando el efecto Pasteur (hemos salido del efecto
Crabtree).
TIPOS DE VINOS
VINOS ESPUMOSOS
Se presentarán algunas técnicas para obtener el vino espumoso:
• Carbonatación (mucho CO2) y embotellamiento a presión.

• Embotellamiento del vino antes de acabar la fermentación.
• Fermentación secundaria, mediante chaptalización (prohibido en España) e inoculación con
levaduras.
o Para retirar las levaduras para después clarificar el vino, las botellas se invierten de
manera que las levaduras a medidad que mueren se decanten y se acumulen en el cuello
de la botella. Mientras, el CO2 se acumula en el cuello de la botella.
o Cuando ya la fermentación esta lista y hay suficiente CO2 acumulado se congela el
cuello, con esto estamos congelando no solo el precipitado sino también la parte
inferior del líquido. Una vez congelado se rompe y se le suelda un nuevo cuello a la
botella, se cierra y se procede al embotellado final y a la venta.
o Esta segunda fermentación ha acumulado una gran cantidad de CO2, que se mezcla con
el líquido y está clarificado por el retirado del poso mediante la congelación y retirada
del cuello. Lo normal es que se haga un par de veces, se gastan varias botellas en el
proceso
VINO DE JEREZ (DULCE)

Se elaboran añadiendo licor de alta graduación (normalmente brandy) al mosto o al vino parcialmente
fermentado. El licor impide o interrumpe la fermentación, estabilizando así el vino. Si se añade licor al
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mosto no fermentado el vino resultante es muy dulce; mientras que si se endulzan vinos parcialmente
fermentados, se obtiene un vino seco.
El vino de Jerez busca matar a la levadura. Si recordáis, vimos varias técnicas para ello: exceso de azúcares,
añadiendo más sulfitos de los que necesita, enfriando la temperatura por debajo de la mínima de la
levadura; sin embargo, el vino de Jerez es único en el sentido de que no usa ninguna de estas técnicas. El
vino de Jerez lo que hace es adicionar alcohol de alta graduación, de tal manera que nuestra levadura no
lo tolera y se muere. Por esto, el vino de Jerez está fortificado (tiene más graduación de la que podrías
obtener de manera natural).
VINO FINO Y VINO OLOROSO

Son vinos blancos de primera prensada: del lagar a las barricas, no pasan por la fermentación. En estos es
importante llenar la barrica dos tercios, como ya hicimos mención con anterioridad. Además, contienen
pocos sulfitos, por ello van a barricas: S. cerevisiae se va a desarrollar, pero está poco favorecida, por lo
que no va a crecer mucho.
En el vino fino, S. cerevisiae se desarrolla menos; siendo el velo en flor quien de verdad se desarrolla. De
hecho, a quien se debe básicamente la formación de este vino es a dicho velo, aunque cerevisiae también
interviene; por lo que la fermentación es anaerobia.
En el oloroso, la diferencia es que no se deja que se desarrolle el velo en flor, y esto se logra fortificando
(con 18ºC). Con esto, matas al velo en flor, pero no a cerevisiae, por ello debe ser a esa graduación
determinada (fermentación aerobia).
Estos dos vinos tienen matices diferentes, pero ambos no están estabilizados.
PRODUCCIÓN DE BEBIDAS DE DESTILERÍA (LO DIJO POR ENCIMA TODO)

• Brandy o coñac: destilado de vino de calidad. Se recogen las fracciones correspondientes.
Maduración durante años en barricas de roble.
• Ginebra: destilado de alcohol procedente de fermentación de melazas de remolacha en agua. El
destilado se hace en presencia de frutas o semillas que le dan esencia.
• Ron: destilado del producto de fermentación de melazas de caña. Grado alcohólico: 40-45º.
• Whisky: destilado del producto de fermentación de cebada malteada. Grado alcohólico: 50º.
Microorganismos que intervienen:
• Bacterias del ácido acético → ácido Acético

• Levaduras (Schizosaccharomyces) → fermentación alcohólica
• Clostridium → ácido Butírico
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Por tanto, lleva ácidos, aldehídos y alcoholes superiores. La proporción y propiedades organolépticas
dependen del tipo de levadura usada y de la maduración, ya sea en barriles de roble durante años y/o si
lo pasan por virutas de roble quemadas.
PRODUCCIÓN DE CERVEZA
La normativa dice que las materias primas son la cebada malteada, agua pura, lúpulo y levadura.
TIPOS DE CERVEZA
• Ales: levaduras altas

o Pale: maltas pálidas y mucho lúpulo
o Brown: oscuras y con poco lúpulo (dulces)
o Stout: muy oscuras y margas
• Lagers: levaduras bajas
o Pale (tipo Pilsen): maltas pálidas y mucho lúpulo. No dulces
o Dark (Dunkel): maltas oscuras, algo dulces
• Weissbier, Weizenbier: cebada + centeno malteado. El mosto se hierve sin añadir lúpulo.
Levaduras bajas
PRODUCCIÓN
De la levadura no hay que preocuparse, es de colección, hay que escalar su cultivo hasta llegar a las
condiciones de producción
El material de partida es la cebada, un compuesto muy rico en almidón, que es fuente de C. El proceso se
orienta para que ese almidón de la cebada se hidrolice y de lugar a monómeros y dímeros sencillos. Esto
lo haremos con las propias amilasas que tienen el grano de cebada.
• Fuente de carbono: glucosa, maltosa, fructosa, sacarosa resultante de la degradación de la

cebada
• Fuente de nitrógeno: péptidos de la cebada
• Fuente de P y S: cebada no es una fuente pura, por lo que esta fuente lo va a obtener de las
vitaminas, sales de la propia cebada
• Condiciones anaerobias
Además, dicha cebada presenta sustancias nitrogenadas que favorecen la formación de espuma.
A lo que sí que hay que atender es al hecho de hidrolizar el almidón para poder usarlo como fuente de
carbono. Debemos fijarnos de que no haya hongos o crecimiento bacteriano, lo que significa que estos
usarían el almidón, y no nos interesa: la cebada debe estar libre de impurezas.
Además, dicha cebada no puede estar germinada (no se pudo haber empezado el proceso de hidrólisis
del almidón). Por tanto, debemos permitir que se expresen las amilasas (cuando el grano llega al punto
de germinación), pero no podemos dejar que germine. De esta manera inducimos germinación, pero no
permitimos que se dé.
• El malteado cuyo objetivo es llevar a la cebada al unto germinación sin que germine. Para ello:
o Remojo (aumentar la humedad hasta el 45%):
▪ Objetivo: inducir la germinación
▪ Condiciones de aerobiosis, alternancia de remojo – descanso aire cada 12 – 24
horas. Adicionar cal (desinfección)
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o Germinación Parcial: de 3 a 5 días a 16 – 19ºC

▪ Objetivo: prepara el almidón para su degradación y genera enzimas hidrolíticas
▪ Condiciones: humedad y aerobiosis. Remover. Para justo antes de que salga la
raíz
o Secado y tostado:
▪ Objetivo: eliminar la germinación
▪ La temperatura y el tiempo de secado determinan el color de la cerveza. Un
tostado a baja temperatura da lugar a cervezas pálidas (como tu cara cuando
veas el examen), y si el tratamiento es más intenso durante más tiempo da
lugar a cervezas oscuras.
• Producción del mosto (que va a ser nuestro medio de cultivo): objetivo es formar y extrer una
solución de azúcares fermentables, compuestos nitrogenados y vitaminas.
o Molienda
o Maceración de la malta: malta molida (30%) + agua (1/3)
▪ Se calienta en diversas etapas más o menos largas de temperatura entre 55 y
90ºC, cada etapa siendo óptima para el funcionamiento de diferentes enzimas.
Las amilasas de la cebada se activan en el rango de temperatura citado
anteriormente, de forma que estas amilasas se activan y atacan al almidón.
▪ Objetivo: favorecer el ataque el almidón por las enzimas de la malta hasta
convertirlo en azúcares fermentables
▪ Resultado: líquido claro y azucarado (mosto). El proceso completo dura unas
horas. No poner en contacto con el aire
o Filtración: residuo → afrecho
▪ Impide que pase la malta, pero si el resto que contendrá los productos de
hidrólisis de la malta
o Cocción: el mosto dulce (medio de cultivo) extraído se pasa a calderas de cobre + lúpulo.
Cocción (140ºC, hasta 1h)
▪ Efectos: esterilización, concentración, terminación de la actividad enzimática
(desactivación de las amilasas), precipitación de proteínas indeseables,
eliminación de compuestos volátiles, desarrollo de sabor, aromas
▪ Además, durante esta fase se adiciona el lúpulo, que contiene resinas amargas
y aceites esenciales. Define el sabor y aroma de la cerveza, inhibe ciertas
bacterias, estabiliza la espuma
• Fermentación → condiciones de anaerobiosis y esterilidad
o Enfriamiento: con una camisa por la que pasa agua fría hasta llevarlo a la temperatura
de incubación (15 – 20ºC)
o Inoculación con levaduras: se va a producir como consecuencia una fermentación
alcohólica, en la que se va a generar etanol (metabolito primario de tipo I) y CO2 a
partir de los productos de la hidrólisis de la cebada. Estas levaduras empezarán primero
consumiendo el sustrato que más les guste, glucosa suele ser con el que empiecen por
que es el más fácil de metabolizar.
▪ Es una reacción exotérmica por lo que tendremos que enfriar

▪ Se va a ir acumulando el etanol y el CO2 se va a ir desprendiendo. Tenemos
que tener una apertura para inocular con la levadura, y otra para la recogida
de gases. Luego el CO2 recogido se usa para carbonatar la cerveza, además de
para generar la espuma.
72
▪ El que usemos un tipo u otro de lavaduras va a depender del tipo de cerveza

que queremos hacer:
• Saccharomyces cerevisae: para la cerveza Ale, esta levadura produce
flóculos + flotación
• Saccharomyces carlsbergensis: cerveza lager. Floculación +
sedimentación, por lo que va a haber que agitar para tener un sistema
lo más homogéneo posible
• Hay que saber la temperatura y tiempo óptimo de fermentación
• Tratamientos post - fermentativos
o Maduración
▪ Por almacenamiento (-1 a 4ºC, 7 días)
▪ Lagering: 8ºC, semanas o meses (fermentación lenta)
▪ Krausening: adición de mosto fresco (medio de cultivo) para lograr una
segunda fermentación
o Clarificación (cola de pescado, gelatina): proceso de decantación por el que las
levaduras se van al fondo
o Purga con CO2: carbonatación, para formación de la espuma
o Filtración
o Envasado
La calidad de la cerveza va a depender de:
• Que no sea Cruzcampo

• Tipo de inóculo, proporción y estado fisiológico
• Nivel de oxígeno (proceso anaerobio), fuente de C y N
• Temperatura
73

de Alimentos
74
PRODUCCIÓN DE VINAGRE
INTRODUCCIÓN
La producción de vinagre a partir de alcohol se conoce desde la antigüedad. En la década de los 50 se

desarrolló la producción de vinagre en fermentadores, en procesos sumergidos.
Las bacterias del ácido acético, que son una comunidad bacteriana (que no somos capaz de aislar) en el
que hay simbiosis entre varias poblaciones donde destacamos Gluconobacter y Acetobacter, que son
capaces de oxidar etanol mediante un proceso de respiración aerobia (el aceptor final de electrones es
externo a la ruta, en este caso el O2) hasta ácido acético
• Gluconobacter (G. oxydans), que pasa de etanol a ácido acético

• Acetobacter (A. aceti, A. pasteurianus, A. peroxidans). Es Gram -, tolerante a ácidos, que pasa de
etanol a ácido acético, y de ahí a CO2 + H2O.
• Son quimiorganotrofas, heterótrofas, ambientales
• El ácido acético es un metabolito primario de tipo I
Se suelen usar cultivos mixtos y las cepas suelen perder su carácter superproductor al cultivarlas en
agar, por eso hay que transportarlas en pequeños fermentadores.
El etanol lo oxidan estas bacterias hasta diferentes productos dependiendo del microorganismo. Como
no se van a poder separar los distintos microorganismos, unos van a producir el vinagre y otros, van a
producir CO2, creando burbujas.
BIOSÍNTESIS
Es una oxidación incompleta, más que una verdadera fermentación. Necesita oxígeno, que actúa como
aceptor final de electrones. Para crecer en condiciones óptimas, las células necesitan etanol (0.2 – 5%) y
ác. acético (13-14%).
75
PRODUCCIÓN
Los nutrientes que podemos utilizar los dividimos en dos grupos, para los cuales
actuaremos de dos formas diferentes:
• Nutrientes de bajo contenido en alcohol: no necesitan adición de

otros nutrientes; es decir, no habría que añadir fuentes que
suplementen N, P y S (siempre que la graduación del alcohol sea baja).
Ejemplos: vino, sidra, cebada, malta.
• Nutrientes de alto contenido en alcohol: necesitan adición de otros
nutrientes que suplementen N, P y S. Ejemplos: alcohol, bebidas de
destilería.
El inóculo que usaremos puede ser un cultivo puro, o el dado de un vinagre

usado antes (de batches antiguos). Además, veremos dos tipos de producción:
• Producción en superficie: viene dado en un reactor por goteo, que

está lleno de virutas de madera con biopelículas de bacterias del ácido
acético. Su temperatura superior es de 29ºC; mientras que la inferior es de 35ºC. El material
percola a través de las virutas. Entonces, se recoge en el fondo, se enfría (con aire y con camisas
de enfriamiento) y recircula (para crear condiciones ácidas). En este proceso, el 90% del etanol
inicial se convierte en acético: producción del 12%.
o Destacar que cuando estas bacterias crecen en medio sólido van a perder la capacidad
de degradar el ácido acético y en algunas casos el proceso es irreversible, por ello, estas
virutas de madera se van a introducir en el vinagre con las bacterias del ácido acético,
de forma que estas se van a pegar a ellas
• Producción sumergida: en este proceso la aireación es crítica (va en función del grado de alcohol
de los nutrientes que se usen). Los fermentadores utilizados deben ser de acero inoxidable, con
una agitación inferior continua y una aireación continua. Además, se debe de dar un control de
temperatura y debe presentar separadores de espumas. El proceso dado es semicontinuo. Las
medidas de etanol deben ser continuas, obteniendo una producción del 13%.
Se suele usar la producción sumergida frente a la de superficie porque presenta mayor velocidad de
reacción; menos coste de instalación y de personal; y necesita menos espacio.
RECOGIDA DEL PRODUCTO
Para la recogida del producto, se lleva a cabo una filtración, en la cual se da una separación del ácido
acético de las bacterias y finalmente para clarificarlo se usa ferrocianuro potásico K4(Fe(CN)6).
MEDIO DE CULTIVO
Va a ser un proceso exotérmico en el que se va a generar calor (aumento de temperatura). Como las
bacterias no son termófilas, tendremos que poner al sistema un sistema de enfriamiento para evitar que
nuestras bacterias mueran.
• Fuente de carbono: etanol de baja o alta graduación

• Fuente de nitrógeno: dependiendo de si la fuente de carbono que usemos sea pura (etanol de
alta graduación) o no (vino).
• Fuente de P y S: medir índice NPK
• Condiciones aeróbicas
• pH ácido: a pesar de que son bacterias van a ser capaces de crecer a pH ácido
76
• Agua ´
• Inóculo de fermentadores antiguis
PRODUCCIÓN DE DERIVADOS LÁCTEOS: QUESO
BACTERIAS DEL ÁCIDO LÁCTICO (BAL)
Estas bacterias comprenden un diverso grupo de microorganismos Gram positivo, no formadores de

esporas, sin motilidad y catalasa negativos. Son cocos y bacilos de longitud variable. Dichas bacterias
pertenecen al phylum Firmicutes, que comprende alrededor de 20 géneros entre los que se encuentran
Lactococcus, Lactobacillus, Streptococcus, Leuconostoc, Pediococcus, siendo lactobacillus el más
empleado.
Además, las podemos clasificar según:
• Producción de metabolitos
o Homofermentativas: su producto es ácido láctico y ya; presentando una acidificación
rápida y, por ende, una coagulación rápida.
o Heterofermentativas: producen otros componentes a parte del ácido láctico, como
CO2.
• Temperatura de crecimiento
o Mesófilas: óptimo en torno a los 25ºC.
o Termófilas: en la industria quesera son aquellas que tienen el óptimo en 40ºC.
A continuación, trataremos los factores que afectan al crecimiento de las BAL. Sabemos que precisan de
vitaminas; además de que debemos atender al pH (el metabolito es extracelular). Decimos esto último
puesto que, al ser un ácido y ser extracelular, su producción baja el pH: usaremos corrector de pH (las
bacterias son neutrofilas).
Por tanto, decimos que los factores a tener en cuenta son la temperatura óptima (dependiente del tipo
de BAL), la presencia de aminoácidos y vitaminas y los carbohidratos fermentables y alcoholes (sustrato
para la formación de los diferentes productos).
FUNCIONES DE LAS BAL EN LOS QUESOS
Su papel es relevante en todo el proceso de producción del queso (responsable del cuajado y maduración
del queso), influyendo de manera diferente en diferentes aspectos:
• Sabor y aroma: producen transformaciones de las moléculas de la leche (cuajado y otras

reacciones). Son las responsables de producir compuestos que dan ese aroma y ese sabor al
queso. Todo esto es debido a ciertas reacciones que conllevan a dichos cambios: proteólisis
(producen amoniaco, ácidos orgánicos y CO2) y lipólisis (produce ácidos grasos responsable del
aroma).
• Sabor ácido del queso: esto se da con la producción del ácido láctico, que será responsable
también de todo el proceso de coagulación. Dicho ácido láctico se utiliza como sustrato para la
producción de otros compuestos: ácido propiónico, CO2 (responsable de los huecos del queso),
ácido cítrico, acetoína, acetaldehído o diacetilo (sabor a mantequilla).
• Inhiben a patógenos: esto es debido a la producción de compuestos que atacan directamente a
patógenos, que podrían vivir en la leche; además de producir bacteriocinas (péptidos
antimicrobianos de síntesis ribosómica, como antibióticos, pero de espectro mucho más
reducido). Las bacteriocinas no son metabolitos secundarios (como sí lo son los antibióticos) que
suelen atacar a especies relacionadas con la productora. Esos otros compuestos que produce a
77
parte de las bacteriocinas, son el acetaldehído (inhibe la división celular en E. coli), el diacetilo
(inhibe levaduras y algunas bacterias G- y G+) y peróxido de hidrógeno.
• Producción de exopolisacáridos (EPS), vitaminas y CO2: el EPS permite la estructura (la textura
gelatinosa y cremosa) del yogur, por ejemplo; y es que dan consistencia, viscosidad y uniformidad
al producto.
• Alimentos prebióticos: organismos (si hablasemos de microorganismos vivos (que nosotros no
nos los comemos vivos), los llamaríamos microorganismos probióticos) y sustancias que
contribuyen al balance microbiano intestinal: reducción de pH en el intestino, producción de
enzimas digestivas y vitaminas, producción de sustancias antibacterianas, reconstrucción de flora
intestinal, mejora de absorción de Ca.
PRODUCCIÓN DEL QUESO
ESTANDARIZACIÓN Y PREPARACIÓN DE LA LECHE

Empezamos por la leche, siendo su composición muy importante para lo que a posteriori se produzca:
atender a hidratos, proteínas y lípidos, que será fundamental y está estandarizado. Por ello, al recibir la
leche, se debe analizar la leche y ver que está dentro de los estándares. En caso de que no esté dentro de
dichos estándares, se debe corregir esa leche para que entre.
Toda esta estandarización va englobada en una serie de procesos que son el filtrado y clarificación,
además de un desnatado o añadido de nata (para obtener el contenido graso óptimo).
Además, va a necesitar una homogeneización de los glóbulos grasos: hay que atender a la estructura del
liposoma, para su lipolisis y posible homogeneización.
PASTEURIZACIÓN
Una vez tenemos la leche estandarizada, debemos matar a los microorganismos que están en la misma.
De esta manera decimos que debemos seleccionar un tratamiento térmico determinado (a la vez, esto
conlleva una pérdida de proteínas o vitaminas, entre otros; por lo que hay que intentar minimizarlo). Lo
que no se hace es una UHT (un tratamiento térmico que sube tanto la temperatura en tan poco tiempo
que puede causar muchos daños en los componentes de la leche; algo que no es positivo para la
elaboración de queso).
Entonces, el tratamiento que sí utilizaremos es la pasteurización (incluso se puede usar HTST). Decimos
así que basta con una pasteurización, puesto que la mayoría de microorganismos no están esporulados.
La pasteurización es la técnica menos agresiva: 60 - 65 ºC, 30 minutos.
Por lo tanto, los objetivos de la pasteurización son:
• Reducir la carga microbiana y matar a los microorganismos patógenos.

• Inactivación de enzimas que afectan a las características organolépticas.
• Desnaturalizar las proteínas de la leche, de manera que se liberan péptidos que contribuyen al
crecimiento de los microorganismos.
INOCULACIÓN
Los quesos están hechos por fermentación láctea, lo que forma la cuajada (caseína precipitada). Es
grumosa, no tiene textura y se desmorona; pero presenta mucho sabor, debido al ácido láctico. Ahora,
hablaremos de la función principal de los BAL para, a posteriori, mencionar otros microorganismos que
pueden actuar en nuestro proceso.
78
Respecto a las funciones principales de las BAL, decimos que estas son la producción de ácido láctico; la
formación y desuerado de la cuajada; el hecho de evitar microorganismos patógenos; conferir sabor ácido
al queso; y la producción de sustancias que dan sabor y aroma (un poco a modo de repaso).
Respecto a otros microorganismos que pueden participar en la producción de queso:
• Hongos: utilizados en quesos madurados superficialmente (Penicillium camemberti) y en los de

pasta azul (Penicillium roqueforti).
• Bacterias propiónicas: productora de ácido propiónico y CO2, responsable de la formación de
los agujeros en quesos como el Gruyère.
• Brevibacterium linens (fermentos del rojo): Se utiliza en los quesos madurados superficialmente
por bacterias.
COAGULACIÓN
El cuajo contiene una enzima en concreto, la quimosina, que es capaz de romper y fragmentar la caseína
(sus enlaces). De esta manera, se forman fragmentos de caseína que, ante presencia de calcio, formaría
enlaces entre ellas en las tres dimensiones del espacio: red tridimensional más densa que cae. Al caer,
arrastra con ella todo lo que hay en la leche. Por ello, en realidad es una red de micelas de paracaseína
unidas a cristales de calcio.
De esta manera, se estaría llevando a cabo una proteólisis de la caseína, provocando la coagulación
(cuajado) de la leche o formación del gel de caseína. Para este proceso hay una serie de parámetros que
pueden ser influyentes: temperatura, pH, concentración de calcio y concentración de fosfatos. Al hablar
de esta coagulación, veremos que hay 2 tipos:
• Coagulación ácida de la caseína: floculación de las caseínas en forma de un precipitado más o

menos granuloso, que se separa del lactosuero dando lugar a una cuajada frágil y
desmineralizada, en donde el calcio no juega ningún papel, ya que es arrastrado por el suero.
o Este proceso consiste en precipitar la caseína mediante la variación del pH. Las bacterias
del ácido láctico van a bajar el pH, que cuando llegue a 4,8 (punto isoeléctrico de la
caseína), va a provocar la precipitación de la caseína.
• Coagulación enzimática de la caseína: la caseína se desestabiliza formando un gel o coágulo, que
engloba el suero y los glóbulos grasos en su interior. Este proceso se divide en dos etapas:
o Hidrólisis de K-caseína: se forma para-K-caseína y un macropéptido. Esta etapa puede
producirse incluso a bajas temperaturas.
o Combinación de micelas de para-K-caseína, siendo necesario Ca 2+, que establece
puentes entre las micelas. Ocurre a mayor temperatura y se engloba en este coágulo el
resto de los componentes de la leche.
o Este proceso va a ser llevado a cabo por la renina, quimiosina o cuajo que es una enzima
que rompe los enlaces de la caseína, que al romperse forma paracaseína que si hay
calcio va a formar una red tridimensional más densa, de forma que cae y va a arrastrar
con ella rodo lo que lleva la leche. Para que la quimiosina actúe bien se les añade un
inóculo pequeño del ácido láctico para llegar al pH óptimo al que trabaja la quimiosina.
Según coagulación, clasificamos en:
• Los quesos de coagulación ácida (queso fresco) presentan pequeñas cantidades de cuajo (facilita
el desuerado) y se opera a temperaturas bajas (15-20ºC).
• En los quesos de coagulación enzimática (p.ej., Gruyère) se añaden cantidades de cuajo muy
superiores y se coagula a temperatura más elevada (30-35ºC) para acelerar la formación de la
79
cuajada. En estos quesos, los fermentos no deben desarrollarse de inmediato a fin de que no se
acidifique mucho la leche durante la coagulación y desuerado.
• En los quesos de coagulación mixta (p. ej., Camembert) se emplea una cantidad de cuajo
considerable a 28-32ºC.
La firmeza del cuajo y la textura de la cuajada formada dependen de la cantidad de cuajo, de la

temperatura y de la acidez de la leche.
DESUERADO
Ya tenemos la leche cuajada, por lo que hay que quitarle el suero (todo aquello que no ha cuajado y agua).
Para facilitar el desuerado lo que se hace es que la cuajada se corta, se eleva la temperatura, se agita o se
acidifican las BAL (formación de buena cuajada); pero al final es poner el cuajado en una malla y estrujarlo
hasta que salga todo el suero.
A este suero se le conoce como lactosuero, que como ya vimos puede ser utilizado por otras industrias
como fuente de carbono. Este lactosuero contiene agua y todo lo que ha precipitado. Lo que se le está
haciendo al gel de caseína o suero es una deshidratación parcial por contracción de micelas que lo forman.
MOLDEO/PRENSADO
Lo que hacemos es poner el cuajado en un molde y lo prensamos un poco más para sacarle más agua.
Además, aquí puede haber alguna otra inoculación (como para el roquefort). La producción de quesos
frescos acaba en este proceso, no se maduran más. Entonces, decimos que este proceso está compuesto
de un moldeo, donde se da forma al queso y se aglomeran los gránulos de cuajada; y un prensado, en el
que se elimina el exceso de suero y se endurece la masa del queso (este último paso no se da en los quesos
frescos).
SALADO
Con este paso, lo que hacemos es aislar el queso mediante agua, disminuyendo su actividad. Esto se hace
acomplejando con moléculas. La finalidad de este paso es proporcionar sabor al producto, evitar la
proliferación de microorganismos, ayudar al desuerado y contribuir a la formación de la corteza del queso.
Para ello, existen diversos protocolos:
• En seco: se lleva a cabo echando sal cristalizada en la superficie.

• En salmuera: sumergiéndolos en agua salada de 6 horas a 3 días (12-141ºC).
Además, hay otros modos de aislar la corteza: plásticos, ceras o microorganismos.
• Corteza artificial o corteza microbiana: disminuir la actividad del agua acomplejando con
moléculas que previene el desarrollo microbiano. Para ello salamos la corteza, disminuyendo la
actividad del agua de la corteza, evitando el crecimiento de cualquier microorganismo.
Penicillium camemberti
o Estas cortezas se van a introducir junto con microorganismos que queremos que se
desarrollen, creciendo este frente a otros microorganismos que haya en el ambiente, ya
que va a tener ventaja competitiva, ocupa un hábitat que ya no puede ocupar otro.
Además, los productos de microorganismos van a influir en el queso, de forma que se
van a hacer quesos planos para evitar el gradiente.
80
MADURACIÓN (A MAYOR DURACIÓN, MAYOR ESTABILIDAD)

En este paso final (optativo) se lleva a cabo una maduración enzimática del gel deshidratado. Es el afinado
o maduración de la cuajada que ocurre gracias a la proliferación de determinados microorganismos. No
se realiza en los quesos frescos. La maduración dependerá de la aireación, pH, T y humedad:
• Humedad relativa: 75 y 90%. Aunque la humedad es bastante alta, los valores de temperatura
son bastante bajos, todo ello con el fin de no tener en óptimo a los microorganismos.
• Temperatura: 2 y 16ºC.
• Tiempo variable: aproximadamente de 90 días.
Los microorganismos involucrados en esta fase de maduración son bacterias lácticas y propiónicas,
levaduras y hongos (Penicillium camemberti, Penicillium roqueforti).
Los procesos que se dan en esta etapa son la fermentación de la lactosa a ácido láctico y la proteolisis y
lipolisis (componentes con buen sabor y aroma). Respecto a la fermentación, el láctico sufre
transformación microbiana hasta acético y propiónico, CO2 y diacetilo (se da hasta que se agota la
lactosa).
• Los procesos proteolíticos lo llevan las proteasas que van a generar una serie de péptidos que
solo algunos (diésteres del ácido aspártico) producen sabor, que posteriormente por peptidasas
se van a degradar a aminoácidos, isómeros D dulces y los L amargos. Los aa se van a seguir
degradando (transaminación) que van a generar alfa cetoácidos y otros aminoácidos que pueden
dar nuevo sabor. Los aminoácidos también pueden descarboxilar, por las bacterias el ácido
láctico, que según el primer inóculo que realicemos. Desaminación aldehídica generando
aldehídos que va a oxidarse a su ácido o reducirse a su alcohol, que junto con los aa y otros
aldehídos van a dar aroma y sabor al queso.
• Con respecto a la lipólisis van a romper los lípidos en ácidos grasos libres que van a dar sabor
(especialmente entre 12 a 14 carbonos, ácido grasos volátiles de cadena corta y media). Los
microorganismos de la primera y segunda inoculación van a ser responsables de este proceso.
Estos ácidos grasos además van a producir reacciones, pudiendo dar a metil cetonas y
posteriormente a alcoholes secundarios que da sabor a queso azul, también pueden peroxidase
dando lugar a aldehído y ya estamos en el caso anterior en la proteólisis.
• Quien lleve a cabo la proteólisis y la lipólisis y cuando cortemos el proceso es lo que va a
determinar el sabor y aroma del queso. Se trata de mantener a los microorganismos vivos, pero
no en condiciones óptimos ya que tenemos que controlar este proceso, por eso, usamos
temperaturas bajas
Por ello, viendo esto vemos que se deben estandarizar todos estos procesos puesto que son muy
definitorios para el sabor, e incluso tipo de queso del que hablemos:
• Quesos duros: en la maduración para este tipo de queso, lo que se busca es evitar el crecimiento
superficial de microorganismos. Es un proceso lento y uniforme, en el que el propio queso puede
recubrirse de parafina o emulsiones plásticas.
o Durante la maduración van a ir perdiendo agua, haciendo que finalmente se pare el
proceso microbiano. Es muy importante la presencia de corteza
• Quesos blandos: su maduración busca favorecer el crecimiento de microorganismos en su
superficie, tanto hongos (Penicillium camemberti, Camembert) como bacterias (Brevibacterium
linens, Limburger). Los enzimas producidos difunden al interior (gradiente de maduración). Esta
difusión se facilita por la forma plana y el pequeño tamaño del queso. Al principio predominan
las BAL, y luego Penicillium o Brevibacterium.
81
• Queso azul: madurados internamente por hongos. Al inicio, los microorganismos y sus enzimas
producen cambios en el interior del queso. Posteriormente se favorece la penetración de aire al
interior del queso y se inocula Penicillium roqueforti (maduración). En este caso, tanto las BAL
como Penicillium roqueforti van a transformar los ácidos grasos a metilcetona, y de ahí a ácidos
simples.
82

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2º PARCIAL BIOTECNOLOGÍA

JORGE CARRIÓN DÍAZ

MEDIO DEFICIENTE EN MN2+

Este requisito, junto con el anterior (pH ácido), hacen que

ALTA CONCENTRACIÓN DE NH4+

OTRAS REACCIONES ANAPLERÓTICAS

ALTA CONCENTRACIÓN DE AZÚCAR

Aspergillus necesita oxígeno, sino lo tiene se va a parar la producción de nuestro metabolito

En realidad no se llega a esos rendimientos por pérdidas en el metabolito primario.

• Inóculo: suspensión de esporas (producidas en medio sólido a 24ºC durante 10 – 14 días)

• Medio sólido: 28 ºC durante 90 horas

Es un producto de fermentación que se va a obtener a partir de microorganismos fermentadores

PROCESO DE PRODUCCIÓ N INDUSTRIAL

1. Filtración o centrifugación para la eliminación de la biomasa

El ácido glucónico lo producen los

Se usa en la industria de los plásticos y en la del papel.

TEMA 10: Producción

Se ha fabricado para consumo desde hace miles de años.

• Materia prima para la industria química: se ha fabricado mediante microorganismos desde el

• Levaduras fermentadoras: Saccharomyces cerevisiae, S. mibilis, Candida, Kluyveromyces,

PREPARACIÓN DEL MEDIO DE CULTIVO

El etanol se obtiene de una oxidación de la glucosa y en la mayoría de ocasiones no usaremos glucosa,

Esto se puede hacer en una o en dos fermentaciones:

MADERA O DESECHOS DE LA IN DUSTRIA DE LA MADERA

DEGRADADORES DE CELULOSA Y HEMICELULOSA

• Trichoderma: celulasas extracelulares (aerobios)

El etanol es un metabolito primario de tipo I extracelular derivado de la fermentación alcohólica, proceso

El etanol vamos a tener un alto rendimiento porque el microorganismo no va a necesitarlo y es un

Se produce en presencia y en ausencia de oxígeno. Es más eficiente en condiciones de anaerobiosis que

• Condiciones de oxígeno → fosforilación oxidativa

El efecto Crabtree solo se produce en Saccharomyces y NO con Zymomonas

EJEMPLO DE PROCESOS DE PRODUCCIÓN

Lo malo de Clostridium acetobutylicum, es que es muy sensible al butanol producido en la fermentación,

Ventajas sobre el bioetanol para el uso como biocombustible:

1. No se requieren nuevas tuberías para transportarlo.

Inconvenientes sobre el bioetanol para el uso como biocombustible:

Clostridium va a realizar la fermentación butírica, en

• Acidogénica: a partir del piruvato se

• Acetato + butirato → acetona

En la formación de etanol a partir de glucosa se forma un intermediario, el acetaldehído, que oxida a

El parámetro de control al igual que en el etanol es la densidad.

La transformación microbiana es la capacidad que tienen los microorganismos de modificar químicamente

Para el proceso de downstream la polaridad va a ser la característica diferencial.

TRANSFORMACIÓN DE PROGESTERONA A CORTISONA POR RHIZPUS NIGRICANS

A raíz del ejemplo de la cortisona, destacamos la

TRASNFORMACIÓN DE CORTISOL A PREDNISOLONA POR ARTHROBACTER SIMPLEX

En cuanto al tratamiento en el nicho industrial, usaríamos para la biotransformación un tanque extendido.

CONCLUSIÓN DE LOS DOS PROCESOS

Posteriormente, cuando ya se comiencen a segregar enzimas más específicas, no se va a producir esa

PROBLEMAS ASOCIADOS A ESTA INDUSTRIA

EJEMPLO DEL COLESTEROL

TRANSFORMACIÓN DE SUSTANCIAS NO ESTEROIDEAS

CON UN SOLO CULTIVO

Entrando en materia, en lo que respecta a la producción

• Se trata de un proceso sumergido, continuo, con células móviles o inmovilizadas.

CON DOS CULTIVOS

PRODUCCIÓN DE DIHIDROXIACETONA A PARTIR DE GLICEROL

Se trata de un proceso metabólico en el que se oxida el glicerol

Además de la producción de dihidroxiacetona, hablaremos de la producción de otras sustancias no

El objetivo de estas transformaciones es la de la mineralización.

COMPUESTOS HALOCARBONADOS (COMO TCE, PCE (SIEMPRE SERÁ EL MEJOR PARTIDO),

El proceso aquí descrito es mejor si se da bajo condiciones de anaerobiosis que si se da en condiciones de

COMPUESTOS NITROAROMÁ TICOS