PROCEDIMIENTO PARA

DETERMINACIÓN DE FÓSFORO
DISPONIBLE

EXTRACCIÓN: BRAY II & OLSEN

CUANTIFICACIÓN: ÁCIDO ASCÓRBICO
COLORIMETRÍA
(NTC 5350:2020)

PR-TEC-A-FD-003
ELABORÓ REVISÓ APROBÓ
Freydel Esteban Arango R. Freydel Esteban Arango R. José Fernando López V.
Fecha de elaboración Versión Fecha de Fecha de aprobación
2021-09-28 02 2022-04-28
revisión 2022-04-29
 LABORATORIO AGROAMBIENTAL
-LAGA-
DETERMINACIÓN DE FÓSFORO
DISPONIBLE
Código: PR-TEC-A-FD-003 Versión: 02 Fecha de aprobación: 2022-04-29 Página 2 de 12

ÍNDICE

1. OBJETIVO ..................................................................................... 3
2. ALCANCE ....................................................................................... 3
3. DEFINICIONES .............................................................................. 3
4. PRINCIPIO Y DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO .................................... 3
4.1. LIMITACIONES E INTERFERENCIAS ....................................... 4
5. PROCEDIMIENTO .......................................................................... 4
5.1. RESPONSABLE DE EJECUCIÓN Y SUPERVISIÓN ...................... 4
5.2. RECURSOS ............................................................................. 4
5.2.1. Equipos ............................................................................. 4
5.2.2. Materiales e insumos ........................................................ 5
5.2.3. Reactivos .......................................................................... 5
5.3. MUESTRAS ............................................................................. 5
6. PROCEDIMIENTO DE ANÁLISIS...................................................... 7
6.1. Etapa de extracción ............................................................... 7
6.2. Etapa de cuantificación ......................................................... 8
7. CÁLCULOS .................................................................................... 9
8. SEGURIDAD INDUSTRIAL
.…………………………………………………..10
9. DISPOSICIÓN DE RESIDUOS ...................................................... 10
10. CONTROL DEL PROCESO.............................................................. 10
10.1. ANÁLISIS DE CONTROLES ................................................... 10
10.2. FLUJOGRAMA ....................................................................... 10
11. DOCUMENTOS DE REFERENCIA ................................................. 11
 LABORATORIO AGROAMBIENTAL
-LAGA-
DETERMINACIÓN DE FÓSFORO
DISPONIBLE
Código: PR-TEC-A-FD-003 Versión: 02 Fecha de aprobación: 2022-04-29 Página 3 de 12

1. OBJETIVO
Describir el procedimiento para la determinación de Fósforo Disponible en
muestras de suelo por los métodos de extracción: Bray II (pH≤7.3) y
Olsen (pH>7.3), y determinación mediante el uso de ácido ascórbico
(Colorimétrica) de acuerdo a lo establecido en el método de referencia NTC
5350:2020.

2. ALCANCE
El método se aplica para la determinación del Fósforo Disponible en muestras
de suelo dentro de los campos de la agricultura, el medio ambiente y los
recursos naturales.

3. DEFINICIONES
Blanco de proceso: Muestra en la que no hay presencia del analito, y que se
somete a las mismas condiciones y al mismo procedimiento de las muestras
reales y los estándares.
Blanco de reactivos: Los reactivos utilizados durante el proceso analítico
(incluyendo solventes para extracción o solución) se analizan para determinar
si contribuyen a la señal de la medida.
Fósforo disponible: Es aquel que se encuentra en el suelo en una forma que
es fácilmente accesible por las plantas en crecimiento. El termino fosforo
disponible también se utiliza para referirse a la porción de fosforo extraída del
suelo por varios extractantes como agua, soluciones ácidas o alcalinas
diluidas y soluciones salinas.

4. PRINCIPIO Y DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO

El método de Bray II extrae una parte del fósforo disponible en el suelo para
la planta, tiene una composición similar a la solución de extracción de Bray I.
la diferencia es que la concentración del HCl es ligeramente mayor en el Bray
II. Fue originalmente por Bray y Kurtz (1945) para extraer el fósforo
fácilmente soluble en ácido, así mismo, así también como una parte de los
fosfatos absorbidos. El ácido clorhídrico solubiliza los fosfatos de calcio y
aluminio y extrae parcialmente los compuestos de fosfato de hierro. El NH 4F
compleja el aluminio en solución y limita la absorción del fósforo sobre los
 LABORATORIO AGROAMBIENTAL
-LAGA-
DETERMINACIÓN DE FÓSFORO
DISPONIBLE
Código: PR-TEC-A-FD-003 Versión: 02 Fecha de aprobación: 2022-04-29 Página 4 de 12

óxidos del hierro. La mayor concentración del ácido en Bray II permite una
mayor extracción de fosforo en suelos calcáreos comparada con Bray I.

Una vez extraído el fósforo, éste es determinado mediante espectrometría

UV-VIS, empleando el método del azul de molibdeno como reductor el ácido
ascórbico, cuyo fundamento consiste en adicionar molibdato de amonio en
presencia de fosfatos y este compuesto se reduce a un complejo azul soluble
(fosfomolibdato de amonio), tal y como se representa en las reacciones
químicas de la ecuación:

7𝐻3 𝑃𝑂4 + 12[(𝑁𝐻4 )6 𝑀𝑜7 𝑂24 × 4𝐻2 0] + 𝐶6 𝐻8 𝑂6

𝐻2 𝑆𝑂4
→ [(𝑁𝐻4 )3 (𝑃𝑂4 )(𝑀𝑜𝑂3 )12 ] + 𝐶6 𝐻6 𝑂6 + 51𝑁𝐻4 + 51𝑂𝐻 − +33𝐻2 𝑂 + 𝐻2

Por otro lado, se tiene que el método Olsen emplea una solución de
bicarbonato de sodio 0,5 M a pH 8,5 para extraer el fósforo de suelos
principalmente neutros y calcáreos. Bajo estas condiciones de extracción,
aumenta la solubilidad del fosfato de calcio y debido a la presencia de
carbonatos, se realiza un control de la actividad iónica del calcio, precipitando
este elemento como carbonato de calcio, y permitiendo la liberación del
fósforo en el medio. El extractante también libera una porción de fósforo de la
superficie de fosfatos de hierro y aluminio, los cuales abundan en suelos
ácidos y neutros.

4.1. LIMITACIONES E INTERFERENCIAS

Los procedimientos con Bray II y Olsen son sensibles a la relación
suelo/extractante, velocidad y tiempo de agitación, por tanto, la
estandarización y el control sobre estas variables debe ser prioridad con el fin
de obtener resultados precisos y veraces, que ofrezcan calidad en las
determinaciones de Laboratorio.

5. PROCEDIMIENTO
5.1. RESPONSABLE DE EJECUCIÓN Y SUPERVISIÓN

Este procedimiento es aplicado por el personal técnico de laboratorio

autorizado por el responsable del laboratorio. El responsable de gestión
técnica y el responsable de calidad del laboratorio supervisan la debida
ejecución del procedimiento y los controles que se apliquen al proceso.

5.2. RECURSOS
 LABORATORIO AGROAMBIENTAL
-LAGA-
DETERMINACIÓN DE FÓSFORO
DISPONIBLE
Código: PR-TEC-A-FD-003 Versión: 02 Fecha de aprobación: 2022-04-29 Página 5 de 12

5.2.1. Equipos
➢ Espectrofotómetro UV-VIS.
➢ Agitador horizontal recíproco (mecánico).
➢ Balanza analítica con resolución de 0,0001 g (de precisión).
➢ Carro para transporte de material de laboratorio (auxilia).
➢ Horno para secado con control de temperatura.
➢ Cronómetro.

5.2.2. Materiales e insumos

➢ Transfer-pipeta de (0,1 - 1) mL, (1- 5) mL y de (1 – 10) mL.
➢ Papel filtro.
➢ Tamiz de 2 mm de abertura.
➢ Mortero de porcelana.
➢ Espátula metálica.
➢ Celda de cuarzo de 10 mm.
➢ Vidriería en general utilizada en el laboratorio.
➢ Frasco lavador.

5.2.3. Reactivos
➢ Agua destilada/desionizada con conductividad ≤ 5,0 µS/cm a 250C.
➢ Heptamolibdato de amonio tetrahidrato.
➢ Tartrato de antimonio III y potasio trihidrato.
➢ Fosfato monopotásico de dihidrógeno (KH2PO4).
➢ Ácido ascórbico.
➢ Ácido sulfúrico concentrado (95-97%).

Para la Extracción por “Bray II” tener en cuenta:

➢ Ácido clorhídrico (35-37%) grado reactivo.
➢ Fluoruro de amonio NH4F grado reactivo.

Para la Extracción por “Olsen” tener en cuenta:

➢ Bicarbonato de sodio grado reactivo.
➢ Hidróxido de sodio grado reactivo.
➢ Carbón activado.

5.3. MUESTRAS
 LABORATORIO AGROAMBIENTAL
-LAGA-
DETERMINACIÓN DE FÓSFORO
DISPONIBLE
Código: PR-TEC-A-FD-003 Versión: 02 Fecha de aprobación: 2022-04-29 Página 6 de 12

Se deben emplear muestras de suelo secadas en el horno a una temperatura

no mayor a 40 °C por un lapso de tiempo entre 30 y 48 horas, reducir de
tamaño, triturar y finalmente pasadas a través de un tamiz de 1 mm de
abertura.
Nota: se deben emplear muestras tratadas de acuerdo a lo establecido en el procedimiento
“PR-TEC-A-PM-002: PRE-TRATAMIENTO DE MUESTRAS DE SUELOS PARA ANÁLISIS
FISICOQUÍMICOS”.

5.4. PREPARACIÓN DE SOLUCIONES

Importante!!! – la vidriería de trabajo debe estar previamente lavada con HCl de acuerdo al
procedimiento de limpieza y desinfección.

➢ Para la Extracción por “Bray II” tener en cuenta:

Ácido clorhídrico 1,0 M: Tomar un balón aforado de 100 mL, colocar en él

50 mL de agua y adicionar 8,29 mL de HCl al 37%, y finalmente aforar con
agua desionizada.

Solución extractora Bray II [HCL 0,1 M; NH4F 0,03 M]: Disuelva 1,11 g
de NH4F en 500 mL de agua desionizada. Adicionar 100 mL de HCl 1,0 M, y
seguidamente llevar la mezcla a 1 Litro con agua desionizada. Finalmente
almacenar en botella de polietileno.

➢ Para la Extracción por “Olsen” tener en cuenta:

Solución extractora Olsen [Bicarbonato de sodio 0,5 M a pH 8,5]:

Disuelva en agua desionizada 42,0 g de NaHCO3 y lleve a 1 L en un balón
aforado. Ajuste el pH a 8,5 con NaOH 1M y agite para homogenizar la
solución. Verifique el pH antes de usar la solución.

Carbón Activado: Puede tener fósforo, por lo que es necesario lavarlo con
solución de bicarbonato de sodio al 0,5 M en embudo Buchner y luego lavarlo
repetidamente con agua desionizada; seque a 80°C en el horno antes de su
uso.

➢ Cuantificación del Fósforo Disponible empleando como reductor

“Ácido Ascórbico”:
 LABORATORIO AGROAMBIENTAL
-LAGA-
DETERMINACIÓN DE FÓSFORO
DISPONIBLE
Código: PR-TEC-A-FD-003 Versión: 02 Fecha de aprobación: 2022-04-29 Página 7 de 12

Solución A: Disuelva en 50 mL de agua desionizada 15 g de heptamolibdato

de amonio tetrahidrato [(NH4)6Mo7O24.4H2O], adicione 0,3613 g de tartrato
de antimonio (III) y potasio trihidrato [C8H4K2Sb2O12.3H2O], agregue lenta y
cuidadosamente 175 mL de ácido sulfúrico concentrado [H2SO4], y finalmente
lleve a volumen final de 250 mL con agua desionizada en un balón aforado.
Esta solución se debe almacenar en un frasco ámbar.

Solución B (solución de ácido ascórbico al 13,2% p/v): Pese 6,6 g de

ácido ascórbico, disuélvalos en 25 mL de agua desionizada y lleve a volumen
de 50 mL con agua. Esta solución se debe preparar el mismo día de la
determinación.

Solución de trabajo: Disuelva 25 mL de la Solución A en 800 mL de agua

desionizada, adicione 10 mL de Solución B y diluya a 1 Litro con agua.
Espere 1 hora antes de usar la solución. Prepare esta solución diariamente.

Solución patrón de fósforo de 50 mg/L: Disuelva 0.2197 g de fosfato

monopotásico de dihidrógeno (KH2PO4) seco a 105 0C, en agua desionizada y
llevar a volumen de 1 Litro en un balón aforado. Conservar refrigerada.

Preparación de las soluciones para elaboración de la curva de

calibración de fósforo de: 0,0; 1,0; 2,0; 4,0; 5,0; 6,0; 8,0; 10,0 y 12,0
mg/L: Con ayuda de una pipeta aforada o una transferpipeta adicionar
respectivamente – 0,0; 1,0; 2,0; 4,0; 5,0; 6,0; 8,0; 10,0 y 12,0 mL de la
solución patrón de fosforo de 50 ppm, ponerlos en balones aforados de 50 mL
y completar a volumen con agua destilada.

Nota: las concentraciones de la solución patrón y de las soluciones de calibración se dan

como orientación, porque se pueden emplear diferentes concentraciones de acuerdo con el
rango lineal del elemento.

6. PROCEDIMIENTO DE ANÁLISIS
6.1. Etapa de extracción

Para la Extracción por “Bray II” tener en cuenta:

1) Pese 2.85 g de suelo seco y tamizado por 2 mm y ponerlos en un

erlenmeyer de 50 mL, adicionar 20 mL de solución extractora Bray II y
agitar en agitador horizontal a 180 RPM durante 40 segundos.
 LABORATORIO AGROAMBIENTAL
-LAGA-
DETERMINACIÓN DE FÓSFORO
DISPONIBLE
Código: PR-TEC-A-FD-003 Versión: 02 Fecha de aprobación: 2022-04-29 Página 8 de 12

2) Seguidamente filtre por gravedad en un erlenmeyer con ayuda de

embudo y papel filtro; dejar filtrar hasta que la muestra drene
completamente. Si la solución filtrada no es clara, volver a filtrar hasta
obtener un extracto traslúcido.

Para la Extracción por “Olsen” tener en cuenta:

1) Pese 1.0 g de suelo seco y tamizado por 2 mm y ponerlos en un

erlenmeyer de 50 mL, adicionar 20 mL de solución extractora Olsen y
agitar en agitador horizontal (mecánico) a 180 RPM durante 30
minutos.
2) Seguidamente filtre por gravedad en un erlenmeyer con ayuda de
embudo y papel filtro; dejar filtrar hasta que la muestra drene
completamente. Si la solución filtrada presenta alguna coloración,
adicione aproximadamente 0.3 g de carbón activado libre de fosfatos y
filtre de nuevo, hasta obtener un extracto traslúcido.

6.2. Etapa de cuantificación

Encienda el espectrofotómetro UV-VIS, permita que el equipo se inicie y
ajuste la longitud de onda a 890 nm. Finalmente lleve a cero con agua
desionizada de trabajo.

Desarrollo de color con ácido ascórbico:

Transfiera 1 mL de extracto o estándar con ayuda de una transferpipeta de
(100 a 1000) µL a un beaker de 50 mL (o al recipiente que se disponga para
ello), adicione 9 mL de solución de trabajo y homogenice la mezcla para dar
paso al desarrollo del color.

La reacción de coloración requiere mínimo 20 minutos antes de realizar las

lecturas. Para asegurar lo anterior, se realiza lectura de estándares y
muestras 30 minutos después de adicionada la solución de trabajo.

Si la lectura de la solución se sale del límite lineal superior de la curva de

calibración, realizar una dilución adecuada a partir del extracto original
utilizando como diluyente solución extractora de Bray II u Olsen (según
aplique), anotar el factor de dilución (fd) y seguir con lo indicado
anteriormente.
 LABORATORIO AGROAMBIENTAL
-LAGA-
DETERMINACIÓN DE FÓSFORO
DISPONIBLE
Código: PR-TEC-A-FD-003 Versión: 02 Fecha de aprobación: 2022-04-29 Página 9 de 12

Las lecturas correspondientes a cada una de las muestras de trabajo deberán

ser registradas en su respectivo formato de datos primarios “FR-TEC-A-EF-
010: CAPTURA DE DATOS ESPECTROFOTOMETRÍA”

7. CÁLCULOS
• Cuantificación de fosforo disponible:

Construya una curva de calibración con la serie de diluciones de calibración de

fósforo y graficar mediante regresión lineal los valores de concentración en
mg/L (ppm) de fósforo en función de los valores de la respectiva absorbancia.

𝑚𝑔 𝑉𝑒 (100 + 𝑝𝑊)
𝑃 ( ) = [(𝐿𝑚 × 𝑓𝑑) − 𝐿𝐵𝑝] × ×
𝐾𝑔 𝑊 100
Dónde:

P: Fósforo en la muestra, en (mg/Kg).

Lm: Lectura de la muestra, en (mg/L) en la curva de calibración.
LBp: Lectura blanco de proceso, en mg/L en la curva de calibración.
Ve: Volumen de extractante, en mL.
W: Peso de la muestra del suelo seco al aire, en gramos.
fd: Factor de dilución, igual a 1 si no se efectúa dilución.
pW: Porcentaje de humedad expresada con base en suelo seco a 105°C
(factor de corrección por humedad).

• Cálculo de la humedad a 105 °C en base seca (pW):

(𝑃𝑚ℎ − 𝑃𝑐 ) − (𝑃𝑚𝑠 − 𝑃𝑐 )
𝑝𝑊(%) = ∗ 100
(𝑃𝑚𝑠 − 𝑃𝑐 )

Dónde:
𝑷𝒎𝒉 : Peso de la cápsula con la muestra antes del secado a 105 °C, en g.
𝑷𝒎𝒔 : Peso de la cápsula con la muestra después del secado a 105 °C, en g.
𝑷𝒄 : Peso seco de la cápsula, en g.
𝒑𝑾: Porcentaje de humedad expresado con base en muestra de suelo seco a
105 °C.

8. SEGURIDAD INDUSTRIAL
 LABORATORIO AGROAMBIENTAL
-LAGA-
DETERMINACIÓN DE FÓSFORO
DISPONIBLE
Código: PR-TEC-A-FD-003 Versión: 02 Fecha de aprobación: 2022-04-29 Página 10 de 12

➢ Bata de laboratorio maga larga.

➢ Guantes de látex o nitrilo.
➢ Gafas de seguridad.
➢ Respirador de vapores orgánicos.

9. DISPOSICIÓN DE RESIDUOS
Los residuos de muestras y reactivos procesados se disponen como mezcla
líquida de sustancias químicas y sólidos contaminados con sustancias
químicas, y se tratan de acuerdo a como se encuentra establecido en el
procedimiento para manejo de residuos de laboratorio “PR-TEC-A-MR-005:
PROCEDIMIENTO PARA MANEJO DE RESIDUOS DEL LABORATORIO”.

10. CONTROL DE CALIDAD DEL PROCESO

10.1. ANÁLISIS DE CONTROLES
Por cada lote de 20 muestras, incluyendo los controles indicados, realice:
➢ Un duplicado de al menos de 1 muestra. Donde se tenga cumplimiento
de RPD ≤ 10 %.
➢ Realice un blanco de proceso.
➢ Realice un estándar bajo de 3 mg P/L y un estándar alto de 12 mg P/L.
Donde se tenga un cumplimiento de % E ≤ 10 %.
NOTA: Los valores obtenidos en los estándares de seguimiento bajo y alto se anotarán en las
respetivas cartas de control X-Bajo y X-Alto (FR-TEC-A-CC-019).

10.2. FLUJOGRAMA
 LABORATORIO AGROAMBIENTAL
-LAGA-
DETERMINACIÓN DE FÓSFORO
DISPONIBLE
Código: PR-TEC-A-FD-003 Versión: 02 Fecha de aprobación: 2022-04-29 Página 11 de 12

11. DOCUMENTOS DE REFERENCIA

Fecha de
N° Referencia Breve descripción
emisión
 LABORATORIO AGROAMBIENTAL
-LAGA-
DETERMINACIÓN DE FÓSFORO
DISPONIBLE
Código: PR-TEC-A-FD-003 Versión: 02 Fecha de aprobación: 2022-04-29 Página 12 de 12

Fecha de
N° Referencia Breve descripción
emisión
Norma técnica colombiana que describe
NTC 5350. Calidad de suelo
1 2020-09-09 el procedimiento para determinación del
determinación del fósforo disponible.
fósforo disponible en suelos.
IGAC capítulo III. Análisis químico de Métodos analíticos del laboratorio de
2 2006
suelos. suelos.
Rodríguez, L., et al. (2013). Glosario
Glosario de términos analíticos que
de términos analíticos. España.
reúne un conjunto de 254 términos que
3 GRASEQA (Grupo Regional Andaluz 2013
constituyen el vocabulario básico de los
de la Sociedad Española de Química
químicos analíticos.
Analítica).

12. CONTROL DE CAMBIOS

Fecha Versión Detalle del cambio efectuado

29-09-2021 01 Creación del procedimiento PR-TEC-A-FD-003 para determinación del

Fósforo Disponible de acuerdo a lo establecido en la NTC 5350:2020.
Inclusión del método de extracción Olsen en cada una de las partes
2022-04-29 02 aplicables: título, objetivo, generalidades, reactivos, proceso de extracción
y flujograma. Además de la eliminación del tiempo de reposo previo a la
filtración del extracto.

Última línea-------última línea------última línea