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Ecotoxicología y seguridad ambiental 162 (2018) 103–111

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Ecotoxicología y Seguridad Ambiental

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inmovilización deesfingomonassp. GY2B en perlas de polivinil alcohol-alginato-

caolín para la degradación eficiente de fenol frente a factores ambientales
desfavorables
boruana, Pingxiao Wua,b,C,d,⁎, Meiqing Chena, Xiaolin Laia, Liya Chena, Langfeng Yua,
Beini Gonga, Chunxi Kanga, Zhi Danga,b,C, Zhenqing Shia,b,d, Zehua Liua,b
aEscuela de Medio Ambiente y Energía, Universidad Tecnológica del Sur de China, Mega Centro de Educación Superior de Guangzhou, Guangzhou 510006, PR China
bThe Key Lab of Pollution Control and Ecosystem Restoration in Industry Clusters, Ministerio de Educación, Guangzhou 510006, PR China
CCentro Provincial de Investigación de Ingeniería y Tecnología de Guangdong para la Prevención de Riesgos Ambientales y Eliminación de Emergencias, Universidad Tecnológica del Sur de
China, Mega Centro de Educación Superior de Guangzhou, Guangzhou 510006, PR China
dCentro de investigación de ingeniería y tecnología de Guangdong para nanomateriales ambientales, Guangzhou 510006, PR China

INFORMACIÓN DEL ARTÍCULO ABSTRACTO

Palabras clave: En este estudio, se llevaron a cabo experimentos por lotes para evaluar la biodegradación de fenol por
Biodegradación esfingomonassp. GY2B, que se inmovilizaron en alcohol polivinílico (PVA)-alginato de sodio-perlas de caolín en
Fenol diferentes condiciones. El grado
daciónóptimo
p El rendimiento se logró con GY2B inmovilizado en perlas que contenían 1,0 % (p/3 % (p/
inmovilización
v) de caolín, 10% (p/v) de la APV, 0. v) de alginato de sodio, 10 % (v/v) de dosificación de biomasa y expuesto a una dosis de
esfingomonassp. GY2B
concentración inicial de fenolel de 10 0 mg/L. Los resultados experimentales indicaron que PVA-alginato de sodio-caolín
Efecto inhibidor
las perlas pueden acelerar la tasa de degradación del fenol al reducir el tiempo de degradación y también mejorar la
Difusión intrapartícula
tasa de degradación. La tasa de biodegradación del fenol por las células inmovilizadas (16,79 ± 0,81 mg/(L·h)) fue
significativamente mayor que la de las células libres (11,49 ± 1,29 mg/(L·h)) en las condiciones óptimas anteriores. El
GY2B inmovilizado en perlas fue más competente que el GY2B libre en la degradación en condiciones con altas
concentraciones de fenol (hasta 300 mg/l) y en ambientes fuertemente ácidos (pH = 1) y alcalinos (pH = 12). Las
concentraciones más altas de fenol inhiben la biomasa y reducen la tasa de biodegradación, mientras que la tasa de
biodegradación más baja a concentraciones iniciales bajas de fenol se atribuye a limitaciones de transferencia de
masa. El modelo inhibitorio de Haldane estuvo bien de acuerdo con los datos experimentales,esfingomonassp.
GY2B, especialmente en concentraciones superiores a 90 mg/L. El análisis del modelo de difusión intrapartícula
sugiere que la adsorción de fenol por perlas inmovilizadas fue controlada tanto por la adsorción superficial rápida
como por el mecanismo de difusión de poros. Vale la pena señalar que la presencia de 1 mg/l de Cr (VI) mejoró la
biodegradación de fenol por parte de las células libres, mientras que Cr(VI) no mostró un impacto evidente en la
eliminación de fenol por parte de las células inmovilizadas. Además, las células inmovilizadas se reutilizaron 16 veces
y eliminaron el 99,5 % de fenol, y cuando se almacenaron a 4 °C durante 90 días, se eliminó más del 99 % de fenol.
Estos resultados mostraron que las células inmovilizadas pueden mejorar significativamente el rendimiento de la
degradación microbiana y proteger a los microorganismos contra un entorno desfavorable.

1. Introducción
Los compuestos fenólicos, que se utilizan ampliamente en muchas industrias, como
las farmacéuticas, las refinerías de petróleo, las plantas de coque, las industrias de
procesamiento de alimentos, la gasificación del carbón y varias otras plantas químicas,
son tóxicos para los seres humanos y los organismos acuáticos.Saha et al., 1999; Mollaei
et al., 2010; Aneez Ahamad y Mohammad Kunhi, 2011; Lu et al., 2012; Zhai et al., 2012).
Por lo tanto, el tratamiento del fenol es fundamental.
para mantener los entornos humanos y de vida silvestre. En los últimos años se
han empleado muchas técnicas de tratamiento para reducir las concentraciones
de fenol, incluida la biodegradación, el intercambio iónico, la adsorción por carbón
activado, la oxidación química por ozono (Hsieh et al., 2008; Liu et al., 2009). El
tratamiento biológico ha demostrado ser el método más prometedor y económico
para la eliminación de fenol de las aguas residuales. Se cree que conduce a la
degradación del fenol y a la reducción de la toxicidad (Nuhoglu y Yalcin, 2005), y
puede manejar una amplia

⁎Autor para correspondencia en: Escuela de Medio Ambiente y Energía, Universidad Tecnológica del Sur de China, Mega Centro de Educación Superior de Guangzhou, Guangzhou 510006, PR China.
Dirección de correo electrónico:pppxwu@scut.edu.cn (P.Wu).

https://doi.org/10.1016/j.ecoenv.2018.06.058
Recibido el 15 de noviembre de 2016; Recibido en forma revisada el 19 de mayo de 2018; Aceptado el 20 de junio de 2018
Disponible en línea el 3 de julio de 2018
0147-6513/ © 2018 Elsevier Inc. Todos los derechos reservados.
B.Ruan et al.
rango de concentraciones (Chung et al., 2003). La biodegradación de fenoles
por diferentes tipos de cultivos microbianos ha atraído la atención de
muchos investigadores durante las últimas dos décadas. Muchos tipos de
bacterias aerobias, incluyendoesfingomonassp.,esfingobiosp.,micobacteria
sp., se cree que son capaces de consumir compuestos aromáticos como
única fuente de carbono y energía (Xie et al., 2017; Zeng et al., 2017; Ruan et
al., 2018).esfingomonassp. es una bacteria gramnegativa con forma de
bastoncillo conocida por su capacidad para degradar compuestos fenólicos
e hidrocarburos aromáticos policíclicos (HAP), especialmente por su alta tasa
de eliminación de fenol (Tao et al., 2009).
Sin embargo, los microorganismos sufren de inhibición del sustrato, es decir,
el crecimiento microbiano y la biodegradación de fenol se ven obstaculizados por
la toxicidad ejercida por altas concentraciones del propio sustrato.Pazarliogramolu
y Telefoncu, 2005; Lu et al., 2012). Para mejorar la tolerancia de las células a la
inhibición severa del sustrato y la utilización del sustrato, la inmovilización de
microorganismos ofrece una gran ventaja sobre las células libres, incluida la
protección de las células de los efectos tóxicos de los compuestos peligrosos y el
aumento de su supervivencia y actividad metabólica en los sistemas de
biorremediación y, por lo tanto, tiene ha estado recibiendo una atención cada vez
mayor (Wang et al., 2008; El-Naas et al., 2009; Covarrubias et al., 2012).
Se han utilizado muchas matrices de gel diferentes para servir como
vehículos de inmovilización de bacterias. El gel de alginato es el polímero
más comúnmente empleado para la inmovilización de bacterias porque es
menos tóxico que los polímeros sintéticos y se puede gelificar fácilmente en
condiciones suaves (Chen et al., 2010; Guzik et al., 2014; Praveen y Loh, 2015;
Chikhi et al., 2016; Varg y Dussán, 2017). Además, el alcohol polivinílico (PVA)
se puede producir económicamente a escala industrial. Muchos informes
han comentado sobre el empleo de PVA para inmovilizar microorganismos (
El-Naas et al., 2009; Hu y Yang, 2015; Huang et al., 2015). Otros estudios
indicaron que para formar perlas esféricas, que es la forma preferida para la
aplicación, se utilizó una solución mixta que contenía PVA y alginato de sodio
y otra solución mixta de ácido bórico y cloruro de calcio (Largo et al., 2004;
Lin et al., 2013; Hu y Yang, 2015; Huang et al., 2015). Para fortalecer las
perlas de gel de alginato, el material de soporte ideal para la inmovilización
debe ser rígido, químicamente inerte y económico, debe unir las células
firmemente y debe tener una alta capacidad de carga y una estructura
suelta para superar las limitaciones de difusión (Tepe y Dursun, 2008). Los
minerales arcillosos como la montmorillonita, el caolín y la vermiculita no
son tóxicos para las células y poseen reactividad química e hidrofilia (Chen y
Lin, 2007; Mukherjee, 2013; Biswas et al., 2015). La adición de arcillas
también puede reforzar las perlas de alginato de sodio-PVA (de Paiva et al.,
2008; Cheng et al., 2012). Por lo tanto, se puede utilizar como material de
base porosa con PVA y alginato de sodio para inmovilizar las células.
En este estudio, el caolín ha sido elegido como material de soporte
debido a su bajo costo, no toxicidad y alta área de superficie específica.
Según nuestro estudio anterior (Gong et al., 2016) que el caolín combinado
con bacterias puede degradar el fenol de manera efectiva que la esmectita y
la vermiculita, por lo que el caolín se aumentó a geles de alginato de sodio y
PVA respectivamente para determinar si la resistencia mecánica y la
adsorción del fenol aumentaron o no. El objetivo principal de nuestro
presente estudio es determinar las condiciones óptimas de atrapamiento de
perlas de alginatocaolín sódico-PVA e investigar la tasa de degradación del
fenol poresfingomonassp. GY2B y células inmovilizadas en condiciones
ambientales desfavorables, por ejemplo, ambiente con altas
concentraciones iniciales de fenol, valores de pH ácidos o alcalinos y
presencia de Cr (VI). Además, también se evaluaron la reutilización y la
estabilidad de almacenamiento de las células inmovilizadas.
2. Materiales y métodos
2.1. Condiciones de cultivo de microorganismos y procedimiento de cosecha.
Las bacterias utilizadas en este estudio se aislaron de suelos contaminados con
petróleo crudo recolectados en un sitio cerca de la zona de petrificación de Guangzhou.
104
Ecotoxicología y seguridad ambiental 162 (2018) 103–111
Empresa, China (Tao et al., 2009). La bacteria se identificó en la morfología celular
y de la colonia, la reacción de Gram, las pruebas fisiológicas y bioquímicas
estándar y el análisis de la secuencia del ARNr 16 S. La cepa se cultivó de forma
rutinaria a 30 °C en un medio de sales minerales (MSM) que constaba de lo
siguiente (por litro): 5 ml de solución tampón de fosfato (KH2correos4, 8,5 g L−1; k2
HPO4·H2O, 21,75 g L−1; N / A2HPO4·12H2O, 33,4 g L−1; NUEVA HAMPSHIRE4Cl, 5,0 g
L−1); 3,0 ml de MgSO4solución (22,5 g L−1); 1,0 mL FeCl3
solución (0,25 g L−1); 1,0 ml de CaCl2solución (36,4 g L−1); 1,0 ml de
solución de oligoelementos (MnSO4·H2O, 39,9 mg L−1; ZnSO4·H2O, 42,8
mg L−1; (NH4)6Mes7O24·4H2O, 34,7 mg L−1). Su pH se ajustó a 7.0–7.2 con
5 mol L−1Soluciones de HCl y NaOH (Tao et al., 2009).
Se desarrolló un cultivo de enriquecimiento utilizando un medio líquido de peptona
de extracto de carne a pH 7 que contenía los siguientes componentes: 10 g L−1
peptona, 5 g L−1extracto de carne, 5 g L−1NaCl. Se hicieron unos 250 mL de
cultivo de la cepa utilizando el medio líquido y 100 mg L−1fenol en un matraz
de fondo plano a 4xgramoen condiciones de oscuridad durante 12 h. El
cultivo se llevó a cabo a 30 °C. Después del cultivo, las células bacterianas del
sobrenadante se recolectaron y centrifugaron a 7155×gramodurante 15 min.
La cantidad precipitada de la centrifugación que contiene las células
recogidas se lavó tres veces con solución salina al 0,85% esterilizada y
finalmente se suspendió en un pequeño volumen de MSM esterilizado.
Suspensión bacteriana (OD600=1,0 a 600 nm por espectroscopia UV-Vis) se
mantuvo en refrigeración a 4 °C para su posterior inmovilización.
2.2. Inmovilización de células y preparación de perlas.
Se disolvieron alcohol polivinílico (PVA, grado nominal de polimerización
= 1750, peso molecular aproximado 75 000–80 000) y alginato de sodio en
agua destilada a 80 °C, y luego se agregó caolín (alrededor de 75 µm de
diámetro), con cuidado de no incluir burbujas de aire. La mezcla formada se
dejó enfriar a temperatura ambiente antes de agregar 10 mL de la
suspensión bacteriana previamente preparada mediante una pipeta de
succión esterilizada. Luego se agitó bien durante 10 a 15 minutos para
garantizar la homogeneidad de toda la solución. La mezcla se vertió gota a
gota en ácido bórico (3% p/v) y CaCl2(4% p/v) solución a través de una jeringa
con una aguja y se mantuvo durante 24 h para obtener perlas de gel de
aproximadamente 3 mm de diámetro (Figura S1). Después de eso, estas
perlas se cultivaron en MSM que contenía 100 mg L−1fenol durante 24 h y
lavado con agua esterilizada tres veces para eliminar los iones de calcio
residuales (Lin et al., 2013). Finalmente se almacenaron en agua destilada a
4 °C para posteriores experimentos.
2.3. Experimentos de biodegradación por lotes de fenol por células libres e
inmovilizadas
Para investigar el efecto de diferentes factores sobre la degradación del fenol
mediante células inmovilizadas, se realizaron experimentos por lotes usando
varias concentraciones de: en primer lugar, caolín: 0 %, 1,0 %, 2,5 %, 5,0 %, 7,5 %
(p/v); en segundo lugar, PVA: 8 %, 9 %, 10 %, 11 %, 12 % (p/v); en tercer lugar,
alginato de sodio: 0 %, 0,1 %, 0,3 %, 0,5 %, 0,7 % (p/v); y en cuarto lugar, varios
volúmenes de cultivo microbiano: 2,5 %, 5 %, 7,5 %, 10 %, 12,5 % (v/v). Se diseñó
una prueba ortogonal con cuatro factores y cinco niveles para investigar las
condiciones óptimas del experimento de inmovilización. Y luego, las condiciones
óptimas obtenidas (1,0% (p/v) de caolín, 10% (p/v) de PVA, 0,3% (p/v) de alginato
de sodio, 10% (v/v) de dosificación de biomasa) fueron probados para verificar su
corrección en el experimento de biodegradación (Figura 2). Además, se probaron
diferentes concentraciones iniciales de fenol que oscilaban entre 50 y 300 mg/L
tanto para las células inmovilizadas como para las células suspendidas libremente.
Los experimentos se llevaron a cabo con la misma concentración de células
(alrededor de 5.6 108CFU/ml) y se aseguró de que el número de células
inmovilizadas (alrededor de 8,3 g de perlas en una solución de 100 ml) fuera
comparable al de las células libres (10 % del volumen del inóculo en una solución
de 100 ml). Los cultivos se incubaron en un agitador rotatorio a 4xgramoen la
oscuridad. Las concentraciones de fenol se controlaron en un cierto intervalo.
B.Ruan et al. Ecotoxicología y seguridad ambiental 162 (2018) 103–111

2.4. Reactivos y métodos analíticos

El fenol de grado analítico se adquirió de Aladdin Industrial Corporation, China. Se

prepararon soluciones madre de fenol de 1 g/L para la concentración deseada en agua
destilada antes de cada ejecución experimental. Las soluciones se mantuvieron siempre
en frascos marrones dentro de un gabinete oscuro para evitar la oxidación ligera del
fenol a 4 °C de refrigeración. Todos los demás productos químicos de grado analítico y
polvo de caolín también se obtuvieron de Aladdin Industrial Corporation, China. Todos
los medios utilizados en este estudio se esterilizaron en autoclave a 121 °C por
adelantado.
Las muestras se centrifugaron a 11.180×gramodurante 5 min y se
recogió el sobrenadante y se midió la cantidad de fenol restante mediante
HPLC (Hitachi L-2000, Japón) equipado con un detector UV/Vis y una columna
Athena C18-WP (4,6 mm × 250 mm, 5 µm) a 25℃,utilizando metanol-agua (v/
v, 40/60) como fase móvil a un caudal de 1,0 mL/min. El volumen de
inyección fue de 10 µl y la longitud de onda UV para la detección de
fenantreno fue de 270 nm. Figura 1.Eliminación de fenol por CK (sin perlas y células inmovilizadas), células
Se utilizaron las siguientes ecuaciones para determinar el porcentaje de libres, perlas de caolín-alginato de sodio-PVA estériles y perlas de caolín-alginato
fenol eliminado por biodegradación y adsorción: de sodio-PVA con células; concentración inicial de fenol = 100 mg/L; T = 30 °C. Los
Fenol adsorbido por perlas inmovilizadas (mg fenol/g perlas): datos son la media ± desviación estándar de tres repeticiones.

C0−Cejército de reserva×V
a= comparación, el 64,8% del fenol fue eliminado por células libres en el mismo
metro (1)
tiempo de reacción (Figura 1). Esto indicó que la tasa de eliminación de fenol de la
Fenol biodegradado por perlas inmovilizadas solución usando GY2B inmovilizado en PVA-alginato de sodio-caolín fue mucho
C t
mayor que la de las células libres. Esto puede explicarse por el hecho de que el
%) =0−C−C a×100
fenol se adsorbió en las perlas (alrededor del 14,5 % del fenol fue adsorbido por
C0 (2)
las perlas inmovilizadas esterilizadas) y las células de las perlas inmovilizadas lo
Porcentaje de fenol residual degradaron aún más (Kulkarni y Chaudhari, 2007). La alta biodegradación de fenol
Ct×100 utilizando células inmovilizadas resultó de la alteración de la permeabilidad
%) = celular, lo que permitió una mejor transferencia de fenol a cada célula (Manohar et
C0 (3)
al., 2001). Además, la estructura del caolín podría ser suficiente para mantener la
DóndeC0es la concentración inicial de fenol (mg/L);Ctes la concentración de actividad biológica de las células atrapadas (Coradin et al., 2003; Covarrubias et al.,
fenol (mg/L) en el tiempot (h) para las perlas inmovilizadas con células;Cejército 2012). Por lo tanto, el caolín es un vehículo adecuado para inmovilizar
de reservaes la concentración de fenol (mg/L) en el tiempot (h) para las perlas
Sphingomonas sp.GY2B para degradar fenol.
inmovilizadas con células esterilizadas;metroes la masa de las perlas
inmovilizadas utilizadas en los experimentos;Ves el volumen de la solución
de reacción en el sistema.
3.2. Experimentos de biodegradación de fenol por células libres e inmovilizadas

2.5. análisis estadístico

3.2.1. Efecto de la concentración de PVA
Como polímero sintético, el PVA es un portador de gel prometedor para la
Todos los experimentos se realizaron por triplicado. Los datos que se muestran en
inmovilización celular porque estabiliza las células y las proteínas y tiene mejores
las figuras correspondientes son los valores medios del experimento y se expresan como
propiedades mecánicas (Szczesna-Antczak y Galas, 2001; El-Naas et al., 2009).
desviación estándar media (DE). Los datos de optimización fueron analizados
Dado que la concentración de PVA en las perlas juega un papel importante en el
estadísticamente mediante ANOVA de una vía por Excel, considerando diferencias
proceso de biodegradación (Lozinsky y Plieva, 1998), se realizaron experimentos
estadísticamente significativas aquellos con unpagvalor < 0,05.
para evaluar su efecto sobre la biodegradación a diferentes concentraciones de
PVA que van del 8% al 12% (Figura 2a). La tasa máxima de degradación se alcanzó
3. Resultados y discusión
con 10% de PVA con una tasa de degradación de 16,6 mg/(L·h). Un aumento
adicional en la concentración de PVA resultó en una disminución de la tasa de
3.1. Células inmovilizadas y preparación de perlas.
degradación de 16,6 a 14,4 mg/ (L h). La explicación de esto podría ser que la
cantidad de bacterias se mantuvo constante y el área de la superficie de las perlas
La cepa utilizada para la inmovilización es capaz de degradar el fenol y los PAH
estaba inactiva para las células (Zhang et al., 2007). Esto dio como resultado la
en condiciones aeróbicas. Las células de la cepa eran gramnegativas y con forma
difusión de menos sustratos bajo una solución de polímero de alta concentración
de bastón y las secuencias del gen 16 S rRNA de la cepa se determinaron y
y, en consecuencia, provocó que se redujera menos fenol. Sin embargo, la
compararon con la base de datos NBCI para las coincidencias más cercanas
degradación del fenol aumentó rápidamente de 14,8 a 16,6 mg/(L h) cuando la
utilizando BLAST. Este procedimiento identificó la cepa más probable como
concentración de PVA aumentó del 9 % al 10 %. La explicación de esto podría ser
Sphingomonas sp.con 99% de similitud. Por lo tanto, la cepa se identificó
que el tamaño medio de los poros de los geles aumentaba a medida que
preliminarmente comoSphingomonas sp.y denominado GY2B.
aumentaba la concentración de PVA, lo que conducía a una mejora de la
Para confirmar aún más la biodegradación del fenol utilizando bacterias
resistencia mecánica y la estabilidad.Szczesna-Antczak y Galas, 2001). Por lo tanto,
inmovilizadas en PVA, alginato de sodio y caolín, la eliminación de fenol
el 10 % de PVA fue la concentración óptima en nuestros experimentos posteriores.
mediante CK (sin perlas ni células inmovilizadas), células libres, perlas de
PVA, alginato de sodio y caolín esterilizadas y PVA, alginato de sodio y caolín
perlas con células (en condiciones óptimas descritas comoSección 3.2) a un
intervalo de 2 h fue investigado. Aparentemente, el fenol se eliminó más 3.2.2. Efecto de la concentración de caolín
rápidamente de la solución acuosa utilizando la cepa GY2B inmovilizada en Se investigó el efecto de la concentración de caolín sobre la biodegradación
PVA-alginato de sodio-caolín que las células libres. En las primeras 6 h, las del fenol. Como se mostró enFigura 2b, cuando la concentración de caolín fue de
células inmovilizadas eliminaron el 99,6 % del fenol de la solución. Por 1,0%, la tasa de degradación del fenol alcanzó el máximo

105
B.Ruan et al.
Figura 2.Factores que afectan la degradación del fenol en solución acuosa después de 6 h: (a) concentración de PVA, (b) concentración de caolín, (c) concentración de alginato de sodio,
(d) volumen de inóculo; concentración inicial de fenol = 100 mg/L; T = 30 °C. Los datos son la media ± desviación estándar de tres repeticiones.
(16,58 mg/(L·h)). Sin embargo, cuando la concentración aumentó
gradualmente, la tasa de degradación disminuyó de 16,58 a 16,17 mg/(L·h).
Cuando la concentración de caolín fue del 7,5 %, la tasa de biodegradación
fue ligeramente superior que sin caolín (0 %). Esto indica que la
concentración de caolín en la perla muestra un pequeño impacto en la
biodegradación del fenol. Una alta concentración de caolín en las perlas
podría haber bloqueado el espacio de crecimiento de las células, lo que
inhibió la actividad de las bacterias degradantes (Lin et al., 2013). Además, la
tasa de degradación disminuyó ligeramente de 16,58 a 15,78 mg/(L·h),
cuando la concentración de caolín disminuyó de 1,0 % a 0 %. Esto se debe a
que la adición de caolín a las perlas inmovilizadas podría mejorar su
resistencia mecánica, permeabilidad y capacidad de adsorción, y hacer que
las células inmovilizadas sean más activas. Teniendo en cuenta la tasa de
degradación, la resistencia mecánica y el costo, el 1,0 % de caolín fue la
mejor concentración en este estudio.
3.2.3. Efectos de la concentración de alginato de sodio
Usando solo PVA reticulado con ácido bórico, se pueden formar perlas
inmovilizadas, pero fue fácil de agregar debido a la reticulación relativamente
lenta del PVA por el ácido bórico (Largo et al., 2004). Para mejorar las propiedades
superficiales de las perlas y reducir su tendencia a acumularse, se agregó una
cierta cantidad de alginato de sodio a la solución de PVA para producir perlas de
gel de alginato (Largo et al., 2004). Se investigó el efecto de la concentración de
alginato de sodio en la biodegradación a diferentes concentraciones que van
desde 0% a 0,7% (Figura 2C). Solo el 90,5% de fenol se degradó en ausencia de
alginato de sodio, sin embargo, la tasa de degradación aumentó rápidamente a
16,60 mg/ (L h) a una concentración de alginato de sodio de 0,3%. Las perlas
inmovilizadas no pueden mantener su estabilidad a lo largo del tiempo y se
rompieron parcialmente a bajas concentraciones de alginato de sodio, lo que
provocó la correspondiente pérdida de células en el medio. Cuando la
concentración era superior al 0,3%,
106
Ecotoxicología y seguridad ambiental 162 (2018) 103–111
la degradación de fenol disminuyó a 15,65 mg/(L h). Los resultados
antes mencionados se atribuyen a que las bacterias no obtienen
suficientes nutrientes. La alta concentración de alginato de sodio
podría dificultar la difusión del sustrato a través de las perlas, por lo
que la tasa de degradación disminuyó (Idris y Susana, 2006). Por lo
tanto, se eligió la concentración de alginato de sodio al 0,3% para
experimentos posteriores.
3.2.4. Efecto de la dosificación de biomasa
Según informes anteriores (Rodgers y Bunce, 2001; Lin et al., 2013), la
porosidad de los geles estuvo estrechamente relacionada con la concentración de
células bacterianas incrustadas. Por esta razón, se investigó el efecto de la
dosificación de biomasa incrustada sobre la biodegradación de fenol en varias
dosificaciones de biomasa que van desde 2,5% a 12,5% (v/v). Como se mostró en
Figura 2d, con un aumento en la dosis de biomasa del 5,0% al 10,0%, la tasa de
degradación del fenol se incrementó gradualmente y alcanzó el máximo (16,4 mg/
(L·h)) con una dosis de biomasa del 10,0%. Sin embargo, un mayor aumento en la
dosis de biomasa condujo a una disminución de la tasa de degradación del fenol
(14,45 mg/(L·h)). Este hallazgo se puede atribuir a que grandes cantidades de
células atrapadas pueden conducir fácilmente a la saturación dentro de las perlas,
lo que podría haber bloqueado el espacio de crecimiento de las células (Hsieh et
al., 2008). En consecuencia, tales fenómenos de saturación celular podrían resultar
en una menor tasa de degradación por parte de las células inmovilizadas (Bai y
Abraham, 2003). Además, la cantidad de oxígeno en las perlas podría afectar la
tasa de biodegradación de los microorganismos aeróbicos (Wang et al., 2001). Por
lo tanto, se seleccionó una dosis de biomasa del 10% para experimentos
posteriores.
3.2.5. Efecto de la concentración inicial de fenol
Dado que se sabe que algunos contaminantes de hidrocarburos, incluido
el fenol, tienen un efecto inhibitorio sobre la actividad de la biomasa,
B.Ruan et al.
Fig. 3.Efecto de la concentración inicial de fenol sobre la degradación de fenol por células
inmovilizadas y células libres: (a) eliminación de fenol por células inmovilizadas con el
tiempo; (b) la tasa de degradación del fenol por células inmovilizadas y células libres a
diferentes concentraciones iniciales; T = 30 °C. Los datos son la media ± desviación
estándar de tres repeticiones.
concentración de fenol juega un papel importante en el proceso de
biodegradación (El-Naas et al., 2009; Lu et al., 2012). Para evaluar la
degradación de fenol por perlas inmovilizadas y células libres, se llevaron a
cabo experimentos por lotes a diferentes concentraciones de fenol que
oscilaban entre 50 y 300 mg/L.Fig. 3a mostró los resultados del efecto de la
concentración inicial de fenol en el proceso de biodegradación usando
perlas incrustadas de la cepa GY2B a pH 7.0 y 30 °C. Se encontró que GY2B
inmovilizado en perlas de PVA-alginato-caolín reveló una degradación
eficiente del fenol a diferentes concentraciones iniciales dentro de las 48 h.
Es obvio nuevamente que la reducción en la concentración de fenol es
prácticamente lineal con el tiempo, por lo tanto, la velocidad de degradación
es constante para todas las concentraciones iniciales de fenol dadas. Se
calcularon los resultados experimentales de las tasas de degradación de
diferentes concentraciones, aumenta al aumentar la concentración inicial y
puede alcanzar un máximo (17.09 mg/(L h)) a 100 mg/L (Fig. 3b). Más allá de
este valor, disminuye la tasa de eliminación de fenol. Esto se puede atribuir
al efecto inhibitorio del fenol.
El modelo de Haldane era apropiado para describiresfingomonassp. Cinética
de crecimiento de células GY2B en fenol debido a su simplicidad matemática y
amplia aceptación para representar la cinética de crecimiento de sustratos
inhibidores (Chung et al., 2005; Zhai et al., 2012). La tasa de crecimiento específica
(μ, h−1) de células en un sistema por lotes se definió como:
1dX denX
m= = eliminación del 39 %, mientras que las perlas inmovilizadas completaron el
X dt dt
dóndeXes la concentración celular en g/L (base seca) o en unidades de
absorbancia a 600 nm (DO). El valor de m se determina en el
fase exponencial de la curva de crecimiento. El modelo inhibitorio de Haldane se
puede expresar como:
Ecotoxicología y seguridad ambiental 162 (2018) 103–111
Figura 4.Tasas de crecimiento específicas experimentales y predichas (modelo de
Haldane) del cultivo a varias concentraciones iniciales de fenol.
S
m= mmáximo
kS+S+ (S2/ki) (5)
dóndemmáximoes la tasa de crecimiento específica máxima (h−1);kSes el coeficiente
de saturación medio (mg/L);kies la constante de inhibición para el crecimiento
celular (mg/L).
Las tasas de crecimiento específicas predichas del cultivo por el modelo de
Haldane se compararon con los datos experimentales enFigura 4. Los datos μ se
emplearon para determinar los parámetros de Haldane mediante un ajuste de
curva no lineal usando el origen 8.5 basado en Windows 10. Los parámetros de
Haldane para inmovilizadosesfingomonassp. GY2B crecido en fenol se obtuvieron
como mmáximo=0,501 horas−1,ks = 70,5 mg/L, yki=121,7 mg/L (R2= 0,927). Está claro
que la ecuación de Haldane se correlacionó considerablemente con los datos
experimentales inmovilizados y que la tasa de crecimiento específica máxima se
produjo a una concentración de fenol de 90 mg/L (Figura 4). Sin embargo, los
datos experimentales de celdas libres no parecen ajustarse bien al modelo de
Haldane (mmáximo=0,405 horas−1,ks= 45,33 mg/L, yki=
109,9 mg/L, R2= 0,864). Cuando las concentraciones estuvieron entre 50 y 100 mg/
L, los valores de tasa de crecimiento específico aumentaron gradualmente con el
aumento de fenol; más allá de 100 mg/L, con el aumento de fenol se observó una
reducción considerable en la tasa de crecimiento específica. Esto indicó que el
fenol tiene un efecto inhibidor considerable sobre las capacidades de
biodegradación, especialmente en concentraciones superiores a 100 mg/L. La
toxicidad del fenol en altas concentraciones puede dañar las células microbianas a
través de la alteración de la permeabilidad selectiva de la membrana
citoplasmática y la desactivación de enzimas (Hsieh et al., 2008; Lu et al., 2012). Sin
embargo, al formar una estructura de red cruzada, las perlas podrían actuar como
una barrera física beneficiosa contra la toxicidad del fenol y reducir el efecto de
inhibición del sustrato resultante (Covarrubias et al., 2012). Esto mejorará la
capacidad de degradación del fenol a una alta concentración de fenol. Por otro
lado, se considera que la menor tasa de biodegradación a bajas concentraciones
iniciales de fenol se debe al control de la transferencia de masa, es decir, menos
fenol es accesible para la biomasa (Dursun y Tepe, 2005).
Con una concentración inicial de fenol de 100 mg/L, la degradación por GY2B
libre seguía siendo efectiva y el 87 % del fenol se eliminó en 6 h, mientras que este
tiempo se prolongó a 20 h con una concentración de fenol de 150 mg/L (Figura S2
). Al aumentar la concentración de fenol, las bacterias exhibieron una degradación
muy limitada dentro de las primeras 8 h y el tiempo requerido para alcanzar el
equilibrio de degradación se extendió a más de 24 h. A la concentración de fenol
más alta de 250 mg/l, las células libres tardaron 38 h en lograr una tasa de
(4)
proceso de degradación en el mismo tiempo. Estos resultados indicaron que las
células libres pueden ser incapaces de resistir los efectos tóxicos del fenol a
concentraciones de fenol más altas. Las perlas inmovilizadas podrían proporcionar
protección para GY2B y resistir parcialmente los efectos adversos de la inhibición
del sustrato para acelerar significativamente el proceso de biodegradación.
Para realizar el mecanismo de difusión exacto, la cinética de adsorción
107
B.Ruan et al.
Figura 5.Gráfica de difusión intrapartícula de la adsorción de fenol en perlas de caolín,
alginato de sodio y PVA a varias concentraciones iniciales.
Los datos de PVA-alginato de sodio-perlas de caolín fueron analizados más a fondo por un
modelo de difusión intrapartícula (Doke y Khan, 2017):
t=kdt 1/2+C
dónde tes la cantidad de fenol de adsorción por perlas inmovilizadas en
en cualquier momento (mg fenol/g perlas).kdes la constante de velocidad de
difusión intrapartícula (mg g−1min−1/2), yCes una constante que da idea del espesor
de la capa límite (mg g−1). De acuerdo con este modelo, si la trama detcontra t1/2da
una línea recta, entonces el proceso de adsorción es controlado por la difusión
intrapartícula y si los datos exhiben gráficas multilineales, entonces dos o más
pasos controlan el proceso de adsorción (Wu et al., 2009a). En el presente estudio,
los gráficos de difusión intrapartícula muestran multilinealidad en el proceso de
adsorción (Figura 5), lo que indica que la adsorción de fenol por las perlas
inmovilizadas no se controló solo con la difusión intrapartícula. La primera parte
lineal más nítida se puede atribuir a la adsorción en la superficie externa en la que
la tasa de absorción de fenol fue alta debido a la rápida adsorción del fenol a
través de la solución en la superficie externa de las perlas inmovilizadas. La
porción lineal gradual posterior se refiere a la difusión lenta de poros
intrapartículas. Las dos etapas en el gráfico sugieren que el proceso de adsorción
de fenol por inmovilizado ocurre por adsorción en la superficie externa y difusión
intrapartícula (Ofomaja, 2010). Tanto la adsorción de la superficie externa como la
difusión dentro de las perlas inmovilizadas controlan el proceso de difusión
intrapartícula.
3.2.6. Degradación en condiciones ácidas y alcalinas fuertes
Es ampliamente conocido que el valor de pH del medio de degradación
influiría en la actividad de las enzimas y, por lo tanto, en la tasa de
crecimiento microbiano. Además, también podría afectar la estructura de las
cuentas (Liu et al., 2009). Para determinar el efecto del valor de pH inicial del
medio de degradación sobre la degradación de fenol por células
inmovilizadas y células libres, se llevaron a cabo experimentos en
condiciones ácidas fuertes (pH 1 y 3) y alcalinas (pH 10 y 12). Los resultados
experimentales se muestran enFigura 6. Para las células libres, cuando el pH
era de 1,0, la cepa GY2B apenas sobrevivía, de manera similar, la actividad
de degradación de fenol de las células libres se inhibía completamente a un
pH de 3,0. Sin embargo, las células inmovilizadas aún mantuvieron mayores
eficiencias de degradación (más del 95%) en las mismas condiciones. Todos
ellos confirmaron que las células inmovilizadas pueden tolerar un pH más
bajo que las células libres, aunque el período de degradación se prolongó a
14 h y 16 h, respectivamente. Cuando el valor de pH inicial del medio de
degradación se elevó a 10 y 12, tanto las células suspendidas libres como las
inmovilizadas presentaron alguna degradación de fenol. En contraste con
condiciones ácidas, las células libres mostraron una mejor capacidad de
adaptación en condiciones alcalinas. Es notable que la tasa de degradación
del fenol mejoró significativamente a pH 10 y 12 y puede alcanzar hasta el 70
% y el 50 %, respectivamente.
Ecotoxicología y seguridad ambiental 162 (2018) 103–111
(Figura 6b). Esto podría deberse a la neutralización del medio por los metabolitos
ácidos acumulados de la degradación del fenol. (Hsieh et al., 2008). Por otro lado,
la estructura de redes cruzadas en las perlas inmovilizadas podría generar
metabolitos ácidos a partir de las perlas y evitar que vuelvan a entrar (Ha et al.,
2009). Para investigar el efecto de las perlas inmovilizadas en el pH de las
soluciones de cultivo, se monitorearon los cambios temporales de pH en la
biodegradación de fenol a un pH inicial de 7 (Figura S3). El rango de variación del
pH fue mucho menor para el sistema con células inmovilizadas que para el
sistema con GY2B libre. El efecto amortiguador (que brinda resistencia contra un
entorno desfavorable) de las perlas inmovilizadas probablemente se atribuya a la
adsorción del subproducto ácido producido por GY2B en las perlas. Estos
resultados indicaron que las perlas inmovilizadas actúan como una barrera que
podría proteger las células internas de compuestos tóxicos y tienen una fuerte
adaptabilidad a ambientes ácidos y alcalinos.
3.2.7. Degradación en presencia de ion cromo hexavalente
La presencia de iones de metales pesados en las aguas residuales puede
tener efectos perjudiciales sobre la actividad de biodegradación del fenol. Se
evaluó el efecto del ion cromo hexavalente sobre la biodegradación del fenol y la
concentración inicial de cromo hexavalente fue de 1 mg/L. Pero inesperadamente,
los resultados indicaron claramente que el ion de cromo hexavalente tuvo un
(6) efecto positivo parcial en la biodegradación del fenol como se ve en Figura 7. La
presencia de 1 mg/L de Cr(VI) pareció mejorar la biodegradación del fenol por
parte de las células libres, con una ligera reducción (alrededor del 10%) en la
concentración de Cr(VI). Aunque la relación de biodegradación de fenol no cambió
mucho en ausencia y presencia de Cr(VI) dentro de las 12 h por células libres, el
tiempo de reacción se redujo mucho a la mitad. Al comienzo de la reacción, la
adición de Cr(VI) retrasó la biodegradación. La velocidad de degradación del fenol
mejoró gradualmente con el aumento del tiempo de reacción. Estos resultados
confirmaron que la degradación de fenol por parte de las células libres estaba
acompañada de una reducción de Cr(VI). Durante el proceso, se usó fenol como
fuente de carbono y se transformó en gas de bajo peso molecular.
ácidos orgánicos en masa o incluso HCO- 3y H2O, así como también se usó como
donantes de electrones para la reducción de Cr(VI) (Canción et al., 2009; Huang et
al., 2016). Inesperadamente, la presencia de Cr(VI) pareció tener un efecto
ligeramente negativo sobre la biodegradación del fenol por parte de las células
inmovilizadas (Figura 7). Puede interpretarse como la adsorción de Cr(VI) por las
perlas inmovilizadas para evitar que el sustrato entre en las perlas, aunque las
células inmovilizadas aún mostraban una tasa de biodegradación de fenol
considerable. De manera similar, los resultados experimentales también
mostraron que otros contaminantes como el Hg2+y cd2+tuvo efectos insignificantes
sobre la tasa de biodegradación del fenol (no indicado en la figura). Los resultados
anteriores fueron consistentes con los hallazgos informados anteriormente (El-
Naas et al., 2009).
3.2.8. Reutilización y estabilidad de almacenamiento de células inmovilizadas.
El uso repetido es una enorme ventaja en la aplicación práctica de las células
inmovilizadas debido al ahorro de tiempo y la reducción de costes (Wu et al.,
2009b). Las perlas inmovilizadas se probaron en varios procesos de degradación
de fenol consecutivos para determinar si hubo desactivación de células después
de un uso repetido. La degradación repetida del fenol mediante la reutilización de
células inmovilizadas se llevó a cabo en condiciones óptimas (1,0 % de caolín, 10 %
de PVA, 0,3 % de alginato de sodio y 10 % de suspensión celular). Las células
inmovilizadas se añadieron a 100 ml de MSM que contenía 100 mg/l de fenol.
Después de 6 h de biodegradación, se descartó el medio anterior y se lavaron las
perlas con agua estéril antes de transferirlas a 100 ml de medio fresco. Como se
mostró enFigura 8a, la tasa de degradación aumentó en los primeros 3 ciclos. Las
células inmovilizadas podrían reutilizarse durante un máximo de 16 ciclos y
alcanzar una elevada eliminación total del 99,5 %. Esta capacidad de degradación
de fenol estable después de la aclimatación repetida se puede atribuir al
crecimiento continuo de la cepa GY2B dentro de las perlas (Hsieh et al., 2008). Con
el cultivo repetido de fenol, se formó una biopelícula debido a la secreción de una
cantidad significativa de sustancias poliméricas extracelulares (EPS) de GY2B. Esta
biopelícula debería proporcionar un entorno adecuado para la degradación del
fenol en fenol repetido.
108
B.Ruan et al. Ecotoxicología y seguridad ambiental 162 (2018) 103–111

Figura 6.Efecto del pH de la solución inicial sobre la eliminación de fenol por células inmovilizadas y células libres: (a) condición ácida, (b) condición alcalina; concentración inicial de fenol
= 100 mg/L; T= 30 °C. Los datos son la media ± desviación estándar de tres repeticiones.

cultivos. La estructura de las perlas se destruyó y se produjo una fuga de células durante
16 ciclos, por lo que no se pudo realizar ningún lote adicional.
La estabilidad durante el almacenamiento y la operación a largo plazo es importante
en la aplicación a escala industrial. Las perlas se almacenaron en agua estéril en
refrigeración a 4 °C. Después de 0, 15, 30, 45, 60, 75 y 90 días, las células inmovilizadas se
calentaron hasta 30 °C y se añadieron al medio fresco con 100 mg/L de fenol.Figura 8b
mostró que las células inmovilizadas mantienen una tasa de degradación de fenol
estable con la extensión del tiempo de almacenamiento y podrían eliminar el 99% de
fenol después de almacenarse durante 90 días a 4 °C. Además, las perlas mantuvieron su
estabilidad fisiológica y tenían una alta resistencia mecánica. Por el contrario, la tasa de
eliminación de células libres disminuyó drásticamente durante más de 30 días, incluso se
perdieron actividades después de 45 días (Figura 8b). Estos resultados sugirieron que las
células inmovilizadas tienen una mayor estabilidad de almacenamiento que las células
libres y poseen un gran potencial en la aplicación práctica.

Figura 7.Efecto del Cr(VI) sobre la biodegradación; concentración inicial de fenol = 4. Conclusiones
100 mg/L; concentración inicial de Cr(VI) = 1 mg/L; T = 30 °C. Los datos son la
media ± desviación estándar de tres repeticiones.
Los geles de alginato de sodio y PVA con caolín como vehículo poroso se pueden

Figura 8.Eliminación repetida de fenol mediante la reutilización de células inmovilizadas (a) y estabilidad de almacenamiento de la actividad de degradación de fenol (b). Los datos son la media ± desviación estándar de tres
repeticiones.

109
B.Ruan et al.
se utilizó para inmovilizar la cepa GY2B, y las perlas se aplicaron con éxito para la
biodegradación de fenol. Las condiciones óptimas de inmovilización con esta cepa
incluyeron 1,0 % de caolín, 10 % de PVA, 0,3 % de alginato de sodio y 10 % de
suspensión celular. En comparación con las células suspendidas libremente (11,49
± 1,29 mg/(L·h)), la tasa de degradación de fenol por parte de las células
inmovilizadas (16,79 ± 0,81 mg/(L·h)) mejoró significativamente. Los resultados
experimentales también mostraron que las capacidades de biodegradación de la
cepa GY2B se ven muy afectadas por la concentración inicial de fenol y el valor de
pH. Ya sean células inmovilizadas o células libres, las concentraciones más altas de
fenol pueden inhibir la biomasa y reducir la tasa de biodegradación. Las perlas
inmovilizadas revelaron una degradación eficiente del fenol a concentraciones
iniciales más altas dentro de las 48 h, mientras que las células libres pueden ser
incapaces de resistir los efectos tóxicos del fenol en las mismas condiciones. Sin
embargo, la menor tasa de biodegradación a bajas concentraciones iniciales de
fenol se atribuye al control de la transferencia de masa. Aunque la concentración
residual de fenol en el proceso de biodegradación fue estrechamente lineal con el
tiempo, la tasa de degradación aumentó al aumentar la concentración inicial y
puede alcanzar un máximo de 100 mg/L. El modelo inhibidor de Haldane
proporcionó un mejor ajuste de los datos experimentales y la tasa de crecimiento
específica máxima se produjo a una concentración de fenol de 90 mg/L. Los
gráficos de difusión intrapartícula de dos porciones lineales distantes mostraron
que tanto la adsorción de la superficie externa como la difusión de los poros
estaban activas. Las células inmovilizadas pueden tolerar cambios ácidos más
amplios y mantener mayores eficiencias de degradación (más del 95 %) en
condiciones alcalinas.2+y cd2+no mostró ningún efecto sobre la tasa de
biodegradación del fenol. Inesperadamente, la presencia de 1 mg/L de Cr(VI)
mejoró mucho la biodegradación de fenol por parte de las células libres, mientras
que mostró una ligera promoción de la biodegradación por parte de las células
inmovilizadas. Los experimentos por lotes revelaron que las células inmovilizadas
se repitieron 16 veces y se eliminó más del 99,5% de fenol. También mantuvo una
tasa de degradación de fenol estable con la extensión del tiempo de
almacenamiento y pudo eliminar el 99 % de fenol después de almacenarse
durante 90 días a 4 °C. Estos resultados demuestran que las perlas con células
inmovilizadas se pueden utilizar potencialmente en un sistema de tratamiento de
aguas residuales fenólico práctico y económico.
Agradecimientos
Los autores agradecen el apoyo financiero del Programa Nacional de
Investigación y Desarrollo Clave de China (2017YFD0801000), la Fundación
Nacional de Ciencias Naturales de China (Subvención Nos. 41673092,
41472038, 41273122), el Plan de Ciencia y Tecnología de la provincia de
Guangdong, China (No. 2014A020216002, 2016B020242004), el programa de
apoyo especial de Guangdong para millones de talentos de ingeniería
líderes (No. 201626011) y el Programa de Ciencia y Tecnología de
Guangzhou, China (No. 201604020064).
Apéndice A. Información de apoyo
Los datos complementarios asociados con este artículo se pueden encontrar
en la versión en línea enhttp://dx.doi.org/10.1016/j.ecoenv.2018.06.058.
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