RECONOCIMIENTO DE PROTEÍNAS

BIURET: FUNDAMENTO, REACTIVOS, PROCEDIMIENTO, USOS

El Biuret es un reactivo que se emplea para la determinación de

proteínas de cadena larga y de cadena corta. Es especialmente
utilizado en el área de química analítica y uroanálisis para
investigar la concentración de proteínas totales en suero, plasma
y orina.
Los valores de proteínas pueden aumentarse o disminuirse en
ciertas patologías. Suelen presentarse cuadros de
hipoproteinemias en pacientes con enfermedad renal, en desnutridos y en pacientes con infecciones
crónicas.
Mientras que se observa hiperproteinemia en patologías como el mieloma múltiple, lupus eritematoso
sistémico, endocarditis bacteriana, meningitis bacteriana, macroglobulinemia de Waldenstrom, entre otras.
Por otra parte, la presencia de proteínas en la orina se debe a la filtración de albúmina por el riñón. Esto es
un comportamiento patológico que debe estudiarse.
En este sentido, el Biuret es de gran utilidad, pues permite cuantificar la presencia de proteínas en suero,
plasma, orina, entre muchas otras muestras.
Inclusive el Biuret se puede emplear para investigar la presencia y la concentración de proteínas en
muestras poco exploradas o de cutilizado en el área de investigación.
La prueba de Biuret se fundamenta en detectar los enlaces peptídicos. La prueba se da en medio alcalino.
La muestra debe contener al menos dos enlaces peptídicos para que se pueda formar un complejo de color
violeta-púrpura. El complejo se forma por la unión de los enlaces y el ión de cobre.
Fundamento
El reactivo de Biuret está compuesto por hidróxido de potasio, sulfato cúprico y tartrato de sodio y de
potasio. El hidróxido de sodio se utiliza para alcalinizar el medio, ya que esta condición es indispensable
para que se dé la reacción.
Las sustancias que reaccionan con las proteínas es el sulfato cúprico, mientras que el tartrato de sodio
tiene como función no permitir la formación de hidróxido de cobre, el cual tiende a precipitar e interfiere en
la reacción.
Si en la muestra se encuentran sustancias que posean enlaces peptídicos (polipéptidos o proteínas) la
prueba dará positiva.
Una reacción se interpreta como positiva cuando la solución se torna de color violeta. El color se produce
por la formación de un complejo entre al menos dos enlaces peptídicos que poseen el grupo CO-NH y los
cationes cúpricos.
El complejo violeta se puede formar de dos maneras: una es por la pérdida de protones de los grupos
amidas que se unen al metal (desprototación), y la otra por la unión de los electrones de oxígeno y nitrógeno
que se encuentren libres y se unen con el cobre.
Esta reacción puede variar en intensidad y en el color dependiendo del tipo de proteína.
La prueba se puede realizar de forma cualitativa o cuantitativa. En la forma cualitativa se reporta como
positivo o negativo. Mientras que en la forma cuantitativa se puede medir la concentración por el método
espectrofotométrico.
La reacción se lee entre 540-560 nm. La intensidad del color es directamente proporcional a la
concentración de enlaces peptídicos de la muestra.
Reactivos
-Hidróxido de sodio (NaOH) al 20%
-Sulfato cúprico pentahidratado al 1% (CuSO4. 5H2O)
Procedimiento
Técnica
-Colocar 100 µl de la muestra o del patrón a analizar en un tubo de ensayo.
-Adicionar 2 ml de hidróxido de sodio.
-Mezclar muy bien.
-Adicionar 5 ml de reactivo de Biuret.
-Mezclar y dejar en reposo 25 minutos a temperatura ambiente, tapar y proteger de la luz.
-Observar la formación o no de color y medir espectofotométricamente.
Interferencias
Sustancias que interfieren en la prueba de Biuret
Aunque no es muy frecuente, hay que destacar que durante la ejecución de esta prueba pueden interferir
algunas sustancias. Por ejemplo, la presencia de amonio puede inhibir la formación del color.
Así mismo, otras sustancias podrían absorber a la misma longitud de onda, como por ejemplo ciertos
pigmentos.
Por otra parte, se puede generar una interferencia cuando otra sustancia diferente al enlace peptídico forma
un complejo con la sal cúprica. Ejemplo: algunos carbohidratos y ciertos lípidos.
En caso de que la muestra a analizar presente algún tipo de precipitado, esta debe filtrarse o centrifugarse
antes de montar la prueba.
Sustancias que no interfieren en la prueba de Biuret
La prueba no se ve afectada por la presencia de:
-Bilirrubina hasta una concentración de 20 mg/dl.
-Hemoglobina hasta una concentración de 750 mg/dl.
-Dextrano hasta una concentración de 30 g/L.
-Triglicéridos hasta una concentración de 4000 mg/dl.
Ventajas
-Es un método sencillo de ejecutar.
-Es una prueba económica.
-Tiene alta especificidad para proteínas.
-Pocas interferencias.
Desventajas
Tiene poca sensibilidad para detectar bajas cantidades de proteínas. El trabajo realizado por Fuentes y
colaboradores afirma que el método de la prueba de Biuret posee un límite de detección de 1 mg/ml de
proteína y un límite de cuantificación de 3 mg/ml.
Sin embargo, otra investigación realizada en la Universidad de Amazonía reportan valores mucho más
bajos. El límite de detección que el estudio reporta es de 0,020 mg/ml y el límite de cuantificación de 1.33
mg/ml.