Está en la página 1de 26
Determinación de proteínas Curso EMA 2013 Ing. Agr . Marta del Puerto
Determinación de proteínas
Curso EMA
2013
Ing. Agr . Marta del Puerto
Métodos para determinar proteínas Se basan en: a. Propiedad de las proteínas de absorber luz
Métodos para determinar proteínas
Se basan en:
a. Propiedad de las proteínas de absorber luz en el
UV
absorción A=280nm
a. Capacidad de unirse a ciertos colorantes
Biuret
Lowry
Acido Bicinconínico BCA
Bradford
a. Formación de derivados químicos
Propiedad de absorber luz en el espectro UV • La mayoría de las proteínas muestran
Propiedad de absorber luz en el espectro
UV
• La mayoría de las proteínas muestran una
absorción a 280 nm, la cual se atribuye al
grupo fenólico de la tirosina y al grupo
indólico del triptofano
• Tiene la ventaja de que no es necesario utilizar
reactivos y la muestra no se daña o destruye
durante la determinación.
Método de absorción UV • Se determina la cantidad de luz absorbida una solución proteica.
Método de absorción UV
• Se determina la cantidad de luz absorbida una
solución proteica.
• Para el cálculo de la concentración de dicha
solución se aplica la ley de Lambert –Beer:
A = ε ·c ·l
Donde:
• A = absorbancia
•  = Coeficiente de extinción molar.
• l = longitud de la celda.
• C = concentración
€ - coeficiente de extinción molecular : la cantidad de luz absorbida por unidad de
€ - coeficiente de extinción molecular : la cantidad de luz absorbida
por unidad de concentración
Se utiliza el coeficiente de extinción de la Albúmina de Suero Bovino
(BSA) que es de 43824 M -1 cm -1
Métodos colorimétricos • Usan reactivos determinantes de color • Miden por colorimetría en espectro luz
Métodos colorimétricos
• Usan reactivos determinantes de color
• Miden por colorimetría en espectro luz visible
• Usa curva de proteína patrón (albumina suero
bovino)
• Métodos donde la muestra se destruye
Curva patrón para métodos colorimétricos Curva patrón albumina suero bovino BSA
Curva patrón para métodos colorimétricos
Curva patrón albumina suero bovino BSA
Método de Biuret • Se basa en la formación de un complejo coloreado entre el
Método de Biuret
• Se basa en la formación
de un complejo
coloreado entre el ion
Cu +2 y los grupos NH4
de los enlaces pépticos
en medio básico (NaOH
o KOH)
Consideraciones del método de Biuret • Reacción específica • Color violeta se lee a 540nm
Consideraciones del método de Biuret
• Reacción específica
• Color violeta se lee a 540nm contra curva
estándar BSA
• La intensidad del color es proporcional a la
cantidad de proteína
• Baja sensibilidad
alta concentración
de proteína
Método de Lowry • Combina la reacción del Biuret con la reducción del reactivo de
Método de Lowry
• Combina la reacción del Biuret con la
reducción del reactivo de FOLIN-CIOCALTEAU
por los grupos aromáticos de residuos de
tirosina, triptófano, cistina cisteína e histidina.
• Origina compuesto azul intenso
• Mide a 750nm
Método del ácido bicinconínico BCA • Se basa en que las proteínas reducen los iones
Método del ácido bicinconínico BCA
• Se basa en que las proteínas reducen los iones
cúpricos del reactivo BCA a iones cuprosos en
medio básico.
• Cambio de color del verde (BCA) al morado.
OH- Cu +1
proteína + Cu +2
Cu +1
+ BCA
BCA-Cu +1
Método de Bradford • Se basa en la unión del reactivo Comassie- blue G250 a
Método de Bradford
• Se basa en la unión del reactivo Comassie-
blue G250 a las proteínas en medio ácido
• Reconoce los aa arginina, fenilalanina,
triptófano y prolina
• Origina color azul intenso A=595nm
Aa que reconoce el reactivo de Bradford
Aa que reconoce el reactivo de Bradford
Nitrógeno total o kjeldahl • El método Kjeldahl se basa en la transformación del nitrógeno
Nitrógeno total o kjeldahl
• El método Kjeldahl se basa en la
transformación del nitrógeno contenido en la
muestra en sulfato de amonio mediante la
digestión con ácido sulfúrico en presencia de
un catalizador. El ion amonio obtenido se
transforma en medio básico en amoníaco que
se destila y valora con una solución de ácido
patrón.
• DIGESTIÓN n - C -NH 2 + mH 2 SO 4 catalizadores CO 2
DIGESTIÓN
n - C -NH 2
+ mH 2 SO 4
catalizadores
CO 2 + (NH 4 ) 2 SO 4 + SO 2
proteína
calor
NEUTRALIZACIÓN Y DESTILACIÓN
(NH 2 )SO 4 + 2 NaOH
2NH 3 + Na 2 SO 4 + 2H 2 O
NH 3 + H 3 BO 3 (ácido bórico)
NH 4 + H 2 BO 3 -
(ión borato)
TITULACIÓN
H 2 BO 3 - + H +
H 3 BO 3
Tamaño de la muestra IMPORTANTE: homogeneizar la muestra: molido (<1mm) y mezclado Muestras liquidas Materiales
Tamaño de la muestra
IMPORTANTE: homogeneizar la muestra: molido (<1mm) y
mezclado
Muestras liquidas
Materiales sólidos
Vol muestra
CONT. DE
PESO DE MUESTRA
mg
Conc de N
mg/l
ml
PROTEINA
%
Menor a 20
100
Mas de 5%
1000 - 5000
Entre 20 y 50
50
5
a 30%
500
- 1500
Entre 50 y 100
25
Menos 30%
200
- 1000
Proceso de digestión • Romper los enlaces nitrogenados y liberar el nitrógeno como ion amonio
Proceso de digestión
• Romper los enlaces nitrogenados y liberar el
nitrógeno como ion amonio
• Digestión en medio ácido H 2 SO 4
• Catalizador
• Temperatura
• Tiempo
Cantidad de ácido a agregar muestra ml acido/ TRIGO g muestra Suelo 10.0 PC---- -----
Cantidad de ácido a agregar
muestra
ml acido/
TRIGO
g muestra
Suelo
10.0
PC---- ----- 12.5%
CHO------- 66.6%
MG ------- 3.5%
Grasa
9.7
Proteína
4.9
CALCULO
Carbohidratos
4.0
PC
= 12.5% * 4.9 ml/g = 0.61
CHO = 66.5% * 4.0 ml/g = 2.66
Arcilla
0.6
MG = 3.50% *
9.7 ml/g = 0.34
TOTAL
3.61 ml ácido
CATALIZADOR AGENTE REDUCTOR • Mejorar la velocidad y eficiencia de la digestión • Se usa
CATALIZADOR
AGENTE REDUCTOR
• Mejorar la velocidad y
eficiencia de la digestión
• Se usa en algunos compuestos
que requieren ser reducidos
antes de digerir
• MERCURIO
• Sulfato de cromo, zinc,
sucrosa, acido salicilico
• COBRE
• SELENIO
AGENTE OXIDANTE
• TITANIO
Acelera la descomposición
Agente antiespumante
• MEZCLAS
H2O2
DESTILACION • OBJETIVO: Convertir el nitrógeno amoniacal (NH4) en amonio (NH3) mediante el agregado de
DESTILACION
• OBJETIVO: Convertir el nitrógeno amoniacal (NH4) en
amonio (NH3) mediante el agregado de una álcali
(KOH , NaOH) que se recoge en acido bórico
• (NH) 2 SO 4 + 2NaOH ----
+ Na 2 SO 4 + 2H 2 O
2NH 3
+ H 3 BO 3 --------- NH 4 + H 2 BO 3 -
NH 3
ac
ion borato
borico
Titulación y cálculo de %N • El ion borato se titula con un ácido débil
Titulación y cálculo de %N
• El ion borato se titula con un ácido débil
• H 2 BO 3 - + HCl ---------- H 3 BO 3
• Se determina el gasto de HCl para neutralizarlo
N normalidad del acido mol/l
Gasto ml de HCl
• %N = N HCl x gasto x 14 x 100
14 g/mol
peso atómico del N
100 Factor de corrección
peso muestra
Peso muestra
gramos
Calculo de % proteína • Se usa un factor de conversión según al % de
Calculo de % proteína
• Se usa un factor de conversión según al % de
N de la muestra
• En general se usa 6.25 = 100
16
%N x 6.25 = %PC
Factor según la proteína en estudio
Factor según la proteína en estudio
Ejemplo de determinación muestra P muestra Gasto % nitrógeno Factor % PC fresca Forraje 0.8214
Ejemplo de determinación
muestra
P muestra
Gasto
% nitrógeno
Factor
% PC
fresca
Forraje
0.8214
14.9
2.47
6.25
15.44
fresco
Forraje
0.8383
15.7
2.55
6.25
15.94
fresco
Avena
0.5053
20.4
18.66
5.36
10.0
Hongos n2
0.2177
7.1
4.82
4.38
21.11
Pupasp512
0.2140
9.8
6.89
6.25
43.06
Base seca