Caracterización de la actividad peroxidasa en la hemolinfa de camarones peneidos.

Study of
peroxidase activity in the hemolymph of penaeid shrimp.
Luritza Margarita Peña Molina
Raico Laria Lamela.
RESUMEN
Se analizó el comportamiento de la actividad peroxidasa en la hemolinfa de camarones de la
especies Litopenaeus schmitti y L. vannamei en el Centro de Investigaciones Pesqueras de
La Ciudad de la Habana, procedentes del Centro de Desove Yaguacam, Cienfuegos. Se
emplearon camarones en estado juvenil de 7 a 10 g de peso corporal mantenidos en
estanques de cultivo. Fueron seleccionados al azar, y se verificó que estuvieran sanos y en
estadío de intermuda según el estado de la setogénesis. Las muestras de hemolinfa se
tomaron del sinus dorsal y se colectaron con y sin solución anticoagulante. La actividad
peroxidasa se determinó por el método del Pirogalol. Se determinó mayor actividad
peroxidasa en el interior de los hemocitos de ambas especies de camarones y el análisis
espectral evidenció un máximo de absorción a los 400 nm correspondiente a la banda de
Soret.
Palabras claves: camarón, actividad peroxidasa, hemolinfa.
ABSTRACT
The performance of peroxidase activity in the hemolymph of shrimps of the species
Litopenaeus schmitti and L. vannamei, from the spawning centre in Yaguacam, Cienfuegos,
was analyzed in the Fishing Research Center (Centro de Investigaciones Pesqueras) of
Havana. Young specimens in pond culture, in a weight range of 7 to 10 grams, were used for
this research. The shrimps were selected randomly, examined to establish they were healthy
and in intermolt state according to the setal development. The hemolymph samples were
taken from the dorsal sinus, collected with and without anticoagulant solution. Peroxidase
activity was determined by Pyrogallol method. The results showed a larger peroxidase activity
inside the hemocytes of both species of shrimps and the spectral analysis revealed a
maximum of absorption at 400nm, corresponding to the Soret band.
Key words: shrimp, peroxidase activity, hemolymph.

INTRODUCCIÓN
La sostenibilidad y desarrollo del cultivo del camarón está amenazada por problemas
ecológicos y patológicos que se incrementan en la mayoría de los productores de esta
especie. La prevención y el control de las enfermedades es una prioridad para asegurar la
durabilidad de esta industria (Bachère, 2000). Por ello es necesario desarrollar métodos
confiables y reproducibles que permitan evaluar el estado de salud de las poblaciones de
crustáceos que se encuentran en cultivo.
Varios ensayos cuantitativos para evaluar los efectores de respuesta de defensa ya han sido
probados y optimizados en diferentes especies de camarones como Penaeus stylirostris,
Litopenaeus vannamei, P.monodon, P. Pauliensis y el Litopenaeus schmitti. Entre estas
técnicas se mencionan el sistema de la profenoloxidasa (Söderhäll et al., 1996; Söderhäll y
Serenius, 1998), proteínas de acción antibacteriana (Adams, 1991, Chisholm y Smith 1992,
Noga et al., 1996, Destoumieux et al., 1997), el número total y diferencial de hemocitos
(Rodríguez y Le Moullac, 2000), la respuesta oxidativa a través de la generación del óxido
nítrico, la actividad hemoaglutinante (Espinosa et al., 2002; Rodríguez et al., 2001a;
Rodríguez et al., 2001b) y la actividad de fagocitosis. Todos estos efectores forman parte de
los mecanismos de respuesta inmune innata presente en los invertebrados y es responsable
de proteger al animal del ataque de bacterias, virus y agentes extraños.
La determinación de la actividad de enzimas peroxidasas tiene grandes aplicaciones en
técnicas inmunoquímicas y de diagnóstico clínico debido a su gran estabilidad, facilidad de
conjugación con las inmunoglobulinas y sencillez para detectarla por métodos colorimétricos
en los que se emplea un gran número de reactivos, la prolifenoloxidasa ha sido la más
estudiada, aunque se han identificado otras en el citoplasma de los hemocitos como la
fosfatasa ácida, ß gluconasa, esterasas no específicas y la peroxidasa. A pesar de que ha
sido demostrada la presencia de moléculas con actividad peroxidasa en la hemolinfa de
crustáceos incluyendo los camarones peneidos, poco se conoce sobre su comportamiento
cinético.
El objetivo de la investigación fue analizar el comportamiento de la actividad peroxidasa en la
hemolinfa de camarones de las especies Litopenaeus schmitti y L.vannamei.

MATERIALES Y MÉTODOS
La investigación se desarrolló en el Centro de Investigaciones Pesqueras de La Ciudad de la
Habana durante tres años (2003-2006).
Para la caracterización de la actividad peroxidasa en los diferentes componentes de la
hemolinfa del camarón, se emplearon camarones en estado juvenil de 7 a 10 g de peso
corporal, de las especies Litopenaeus schmitti y L. vannamei, mantenidos en estanques de
cultivo procedentes del Centro de Desove Yaguacam, Cienfuegos. Se seleccionaron al azar, y
se verificó que estuvieran sanos y en estadio de intermuda según el estado de la setogénesis
(Betancourt et al., 1993).
Las muestras de hemolinfa se tomaron del sinus dorsal con el empleo de jeringuillas plásticas
desechables y agujas 21G y se colectaron con y sin solución anticoagulante (citrato de sodio
(FLUKA) 27 mM, NaCl (Riedel de Haën) 336 mM, glucosa (BDH) 115 mM, EDTA (FLUKA) 9
mM, pH 7) (Söderhäll y Thornqvist, 1997) para el caso del plasma y el suero respectivamente.
Ambos tipos de muestras fueron centrifugadas a 200 gravedades para eliminar los elementos
celulares presentes en la hemolinfa y conservadas a –20°C hasta su uso.
Se obtuvo además, un lisado de hemocitos (HLS) el que se preparó a partir de hemocitos
obtenidos por centrifugación a 200 gravedades de muestras con anticoagulante (citrato de
sodio 30 mM, ácido cítrico (Riedel de Haën) 26 mM, 10 mM EDTA, NaCl 0.45 M, glucosa 0.1
M, EDTA 9 mM, pH 4,6) (Sritunyalucksana et al. 2001). El pellet se lavó una vez con la
solución anticoagulante. El homogenato de células fue rápidamente centrifugado a 12, 000
gravedades para obtener el lisado de hemocitos o HLS. Esta muestra fue conservada a –
20°C hasta su uso. En cada una de estas muestras se determinó la actividad peroxidasa por
el método del Pirogalol (SIGMA) (Welinder, 1979).
Se determinación el espectro de absorción del patrón de peroxidasa (HRP: EC. 1.11.1.7,
SIGMA tipo IV, RZ 3:1) y de las muestras de plasma obtenidas con el empleo de un
espectrofotómetro Genesys 2 TM, cubriendo las longitudes de onda desde los 400 hasta los
700 nm.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Los resultados de la actividad enzimática de la peroxidasa (POD) en las diferentes
preparaciones de la hemolinfa para las dos especies de camarones analizadas se muestran
en la tabla No I.
Tabla I Comportamiento de la actividad peroxidasa (POD) en las diferentes preparaciones de hemolinfa
de juveniles de L. vannamei y L. schmitti.
a,b,c exponentes diferentes difieren significativamente para p<0.05
ND no determinado

Actividad POD (U)

Muestras Litopenaeus vannamei Litopenaeus schmitti

Suero ND 0,75 + 0,011 b

Plasma 0.0000b 1,52 + 0,016 b
HLS 15,37 + 0.09 a 339,7 + 3,5 a

Según los datos que se muestran en la tabla, en las muestras de lisado de hemocitos se
evidenció un cambio en la absorbancia con el tiempo de reacción en presencia de Pirogalol y
peróxido de hidrógeno. Estos valores de actividad resultaron superiores y estadísticamente
significativos (p < 0.05) con respectos a los encontrados en el suero y el plasma de la
hemolinfa de los ejemplares analizados. El hecho de que la mayor actividad peroxidasa se
encuentre fundamentalmente en las preparaciones de lisado de hemocitos, sugiere que dicha
actividad está localizada en el interior de los hemocitos de Litopenaeus schmitti y L.
vannamei.
Trabajos publicados por Sritunyalucksana et al. (2001), han demostrado que existe en el
camarón Penaeus monodon una proteína que posee actividad de adhesión celular y
peroxidasa, esta proteína, conocida como peroxinectina, es transcripta en el interior de los
hemocitos o células sanguíneas en estas especies, y se expresa constitutivamente. Además,
muestra una alta similitud con varias peroxidasas tanto de vertebrados como de invertebrados
y contiene todos los residuos necesarios para la actividad catalítica de la peroxidasa lo que
sugiere la presencia de esta actividad en dicha molécula.
Un análisis espectral tanto del patrón de peroxidasa de rábano picante (HRP) como de las
muestras de plasma de camarón (Fig. 1) revela comportamientos similares, en ambos casos
se puede observar un pico de absorbancia alrededor de los 400 nm, mientras que entre los
500 y 600 nm tanto para la HRP como para las muestras de plasma se muestra un hombro
característico en la curva.
 (a)
(b)
Fig.
1

Comportamiento de los espectros de absorción (400nm – 700 nm) (a) del patrón de HRP y la muestra de
hemolinfa de camarón (M1) (b) libres y en combinación con H 2O2 3% durante 20 segundos.

Al analizar el espectro de absorción de la muestra de plasma de hemolinfa de camarón en

comparación con la peroxidasa de rábano picante (HRP), la presencia de un máximo de
absorbancia a los 400 nm y un amplio espectro de absorción desde los 500 hasta los 600 nm
aproximadamente es indicativo de la presencia de grupos hemos de alto spin , lo cual es muy
similar a lo informado para la ascorbato peroxidasa nativa, en la cual se ha identificado la
presencia de la banda de Soret, típica de grupos hemo, a los 406 nm y los máximos de
absorción a los 500 y 631 nm (Obinger et al.1999).

La combinación de la muestra de HRP y plasma con 20 µL de peróxido de hidrógeno (H 2O2)

3% durante 20 segundos mostró comportamiento espectral diferentes. En el patrón HRP
ocurrió un aumento de los valores de absorbancia de la HRP en combinación con el H2o2,
con respecto a la HRP libre, mientras que las muestras de plasma tuvieron una tendencia
similar.
En el plasma no se evidenció ningún cambio en el espectro de absorción al ser mezclada con
peróxido de hidrógeno, como ocurrió con el patrón puro de la HRP. Este cambio en el
espectro se debe a la formación del compuesto LiP I POD I [Fe IV-OR+]. El resultado de la
formación de este compuesto intermediario debió provocar una disminución de la absorción
en la banda de Soret (406 nm), lo cual no ocurrió en ninguno de los dos casos. Solo para la
HRP se produjo un aumento de la absorción, efecto que pudiera deberse a la presencia de un
equivalente de oxidación contenido en un residuo de aminoácido el que no está acoplado
electrónicamente al grupo hemo y por consiguiente lo que se monitorea es la reacción del
compuesto I con un donante de electrones (Obinger et al. 1999). Esta reacción conduce a la
formación del intermediario LiP II o POD II [Fe IV-O]. Brück et al. (2003) señalan que la
formación del compuesto LiPII ocurre tres segundos después de mezclar cantidades de
peróxido de hidrógeno con la peroxidasa nativa, siendo su tiempo de vida en ausencia de
sustrato mayor de 560 segundos.
En el caso del plasma, el hecho de que no ocurran cambios en el espectro de absorción al ser
mezclado con peróxido de hidrógeno puede estar dado por la presencia en la muestra de
otras moléculas capaces de reaccionar inmediatamente con el compuesto I y retornar a la
enzima a su estado nativo después de 20 segundos de reacción, tiempo en el que se llevó a
cabo el experimento. Entre estas moléculas se pueden encontrar las enzimas lisososomales,
las que ejercen un efecto sinérgico con la peroxidasa sobre el peróxido de hidrógeno (Roch,
1999) y que normalmente participan en los mecanismos de toxicidad oxidativa
Es posible que en las preparaciones de lisado de hemocitos así como en el plasma se mida la
actividad peroxidasa asociada a la molécula de peroxinectina, aunque para comprobar esta
hipótesis sería necesario realizar estudios que impliquen el aislamiento, purificación y
caracterización de esta proteína. Gross et al. (2001), describe en una librería genómica
construida a partir de hemocitos del camarón Litopenaeus vannamei solo la presencia de la
secuencia correspondiente a la peroxinectina dentro del grupo de moléculas relacionadas con
el metabolismo oxidativo. Sin embargo, la glutatión peroxidasa (GPx), una seleno proteína, es
una enzima que participa en la respuesta de estrés oxidativo celular formando parte del
conjunto de enzimas antioxidantes que intervienen en la eliminación de las EROs y la misma
ha sido descrita en el camarón Palaemonetes argentinus nobilis (Neves et al. 2000), por lo
que también pudiera asumirse su presencia en el plasma interactua con el sustrato.

CONCLUSIONES
Existe actividad peroxidasa en el interior de los hemocitos de los camarones de la especia L.
schmitti y L. vannamei.
La actividad presente en el plasma presenta un máximo de absorción a los 400 nm
característico de los grupos hemo de las proteínas ferroprotoporfirinas (peroxidasas y
citocromos).

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Recibido: 20 de mayo del 2010.

Aceptación: 26 de mayo del 2010.

Luritza Margarita Peña Molina

Universidad Vladimir Ilich Lenin, Las Tunas, Cuba.
Email: luritzapm@ult.edu.cu
Raico Laria Lamela.
Centro de Investigaciones Pesqueras Yaguacam