PECES TRANSGNICOS:

APLICACIONES

Jess Blanco Piar

Sergio Bedmar Castillo
Marta Gonzlez Requena

Biotecnologa Animal

Carlos Macho Matamoros

Grado en Bioqumica

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Grado en Bioqumica

INTRODUCCIN
En los ltimos tiempos, las reservas de peces en estado salvaje estn disminuyendo
significativamente, a la vez que aumenta la demanda de alimentos derivados de recursos
acuticos en respuesta al crecimiento de la poblacin y al aumento de los niveles de
prosperidad. En este contexto, cada vez se est apostando ms por tecnologas transgnicas
por su potencial para aumentar la produccin de la acuicultura, adems de su eficiencia y
rendimiento. Se ha obtenido una gran variedad de especies transgnicas de peces con
aplicaciones acucolas, farmacuticas e industriales: lubina, besugo, carpa comn, carpa
herbvora, bagre de canal, salvelino, pez de colores, locha, medaka (pez-arroz japons), lucio,
salmn del Atlntico, tilapia, trucha arco iris y pez cebra.
Aunque cuantitativamente la mayora de los estudios de transferencia gnica en peces se han
llevado a cabo en laboratorios dedicados a investigacin bsica, tambin se han realizado
considerables progresos utilizando las tcnicas de transferencia gnica en especies de peces
cultivadas. Las aportaciones que la transferencia gnica puede hacer a la acuicultura estn
relacionadas con la introduccin de caracteres nuevos o la mejora de caracteres de inters
productivo.
Las posibles aplicaciones de estos peces transgnicos son:

Transferencia de la hormona de crecimiento

Peces resistentes al fro
Peces estriles
Peces resistentes a enfermedades
Mejoras del metabolismo
Toxicologa ambiental
Biofactoras

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PECES TRANSGNICOS Y ECOTOXICOLOGA

El uso de peces transgnicos en toxicologa ambiental est todava poco explotado. La idea es
utilizar ciertos peces modelo como sistemas de deteccin de contaminantes en el agua. As, ya
existen lneas de pez cebra y medaka que contienen un gen indicador, normalmente el de la
GFP o la luciferasa de lucirnaga, cuya expresin est bajo el control de un elemento inducible
por algn contaminante del agua. Se han utilizado promotores de heat shock, promotores
que responden a metales pesados, a hidrocarburos aromticos, o a compuestos estrognicos.
Para detectar estos compuestos contaminantes los peces se sitan en el agua que
supuestamente los contiene. Tras la incorporacin de estos compuestos, su distribucin y
acumulacin en los distintos tejidos del pez, stos son capaces de activar los promotores diana
dando lugar a la expresin del gen indicador. La protena marcadora sintetizada se puede
monitorizar fcilmente en los peces.

PECES TRANSGNICOS RESISTENTES A ENFERMEDADES

Para aumentar la resistencia general a infecciones bacterianas se ha propuesto el uso de genes
que codifiquen protenas antimicrobianas. Una de las protenas antimicrobianas mejor
caracterizadas es la lisozima. Las lisozimas son hidrolasas que rompen cierto tipo de enlaces
presentes en las paredes celulares bacterianas. Estos enzimas se encuentran en muchos tejidos
de vertebrados superiores y pertenecen al sistema inmunitario innato. Existen varios tipos de
lisozimas, que muestran actividades lticas diferentes sobre distintas especies bacterianas.
Recientemente, se han generado pez cebra transgnicos que contienen el gen de la lisozima de
pollo (lisozima de la clara de huevo), bajo el control del promotor de la queratina de hirame
(Paralichthys olivaceus). En la F2 de esta lnea transgnica la expresin de este gen era fuerte
en tejido epitelial, hgado y branquias. Se realizaron retos con dos especies bacterianas que
suelen ser patgenas para hirame, y sobre las cuales las lisozimas propias de este pez muestran
una actividad ltica muy reducida, pero no as la lisozima de la clara de huevo. En esos
experimentos entre un 60-65% de los pez cebra transgnicos sobrevivieron a las infecciones,
mientras que el 100% de los peces control murieron, lo que demuestra que esta estrategia
podra ser til para proporcionar una mayor resistencia a enfermedades bacterianas en esa
especie.
En esta misma lnea, se ha introducido el gen de la cecropina de la polilla de la seda en I.
punctatus y se han desarrollado lneas transgnicas. Las cecropinas son pequeos pptidos
catinicos que poseen algunos insectos, y que presentan actividad bactericida contra un
amplio espectro de bacterias. No son txicos para eucariotas, ya que algunos mamferos como
el cerdo tambin los sintetizan. La exposicin de estos peces transgnicos a la accin de
distintas bacterias patgenas para peces demostr que la expresin de cecropinas confera una
resistencia significativamente mayor a la infeccin bacteriana en estos peces respecto a los
controles.

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PECES ESTRILES
Los peces modificados genticamente que surgen de estas tecnologas y que presentan
caracteres fenotpicos mejorados an no han podido emplearse con fines comerciales. Esto es,
en parte, por las dificultades que existen en cuanto a una prediccin fiable del riesgo ecolgico
de los peces transgnicos, en caso de que estos escaparan al medio salvaje.
Irnicamente, adems de ser el grupo taxonmico con ms especies transgnicas, los
organismos acuticos son tambin uno de los grupos ms propensos a presentar problemas
medioambientales si se produce una liberacin accidental al medio salvaje del que hablbamos.
A diferencia de otras especies agrcolas, los peces son muy difciles de contener, y si a esto
sumamos su gran capacidad de desplazamiento podran convertirse fcilmente en una
amenaza para el ecosistema nativo.
Los mtodos transgnicos cuyo objetivo es inducir la esterilidad mediante la disrupcin de la
reproduccin sexual tienen como diana genes de hormonas asociadas con el desarrollo sexual,
de forma que el fenotipo asociado a la inactivacin de dichos genes (esterilidad) pueda ser
rescatado (revertido) mediante la administracin exgena de hormonas.
ESTRATEGIAS DE INACTIVACIN TRANSGNICA PARA INDUCIR ESTERILIDAD.
Varios investigadores han trabajado en inactivar de forma selectiva los genes involucrados en
la cascada que controla el desarrollo de las gnadas. En la mayora de casos, se ha hecho que el
DNA del gen que se quiere inactivar se introduzca en un constructo transgnico de forma que
su transcripcin d lugar a mRNA complementario al mRNA endgeno diana, con lo que se une
a ste y silencia por tanto la expresin de dicho gen. Esta es la tecnologa del RNA antisentido.
Un inconveniente a esto es que no se inhibe por completo la expresin del gen a nivel de RNA o
de protena.

A.C. Wong, A.L. Van Eenennaam. Transgenic approaches for the reproductive containment of genetically engineered fish.

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El primer experimento realizado consisti en introducir un constructo de RNA de una sola

cadena para antagonizar la produccin in vivo del gen GnRH3 de la especie trucha arcoris. En
esta especie hay dos genes GNRH3 diferentes (GnRH3A y GnRH3B), que se localizan en
diferentes cromosomas pero que codifican el mismo pptido. Este constructo era una
secuencia invertida de DNA complementaria a las ltimas 8pb del exn 1 y al exn 2 entero del
gen GnRH3 de la especie salmn del Atlntico, con el promotor Pab correspondiente, que se
expresa especficamente en las clulas cerebrales productoras de GnRH3.
Dicho RNA antisentido se expresaba y se hallaron bajos niveles de mRNA de hormona GnRH
en la trucha arcoris, sin embargo el efecto no era suficiente para producir esterilidad o afectar
a los niveles de LH o de FSH.
Se analizaron los niveles de mRNA de GnRH3A y GnRH3B en el cerebro, se observ una
disminucin en el ratio GnRH/-actina en los peces que posean el constructo. Sin embargo,
este ratio era significativamente ms bajo slo en las hembras en el caso del GnRH3A y en los
machos en el caso del GnRH3B.

S. Uzbekova, J. Chyb, F. Ferrire, T. Bailhache, P. Prunet, P. Alestrom, B. Breton. Transgenic rainbow trout expressed sGnRHantisense RNA under the control of sGnRH promoter of Atlantic salmon.

Los estudios fisiolgicos revelaron que:

Los niveles de GnRH disminuyeron significativamente en la pituitaria de machos y

hembras transgnicos en el periodo de maduracin.
Los niveles de LH y FSH no eran significativamente diferentes entre los peces
transgnicos y no transgnicos, independientemente del sexo y estadio de maduracin.
No existan diferencias en el porcentaje de machos productores de esperma a los 15
meses.

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Haba gran variabilidad en los estadios de maduracin de las hembras transgnicas a los
20 meses (desde inmaduras hasta ovuladas).

El hecho de que los niveles de FSH y LH no cambien en los peces transgnicos podra suponer
que la disminucin de GnRH en la pituitaria no era suficiente para ejercer un efecto directo en
la secrecin in vivo de gonadotropinas. Por otra parte, la variabilidad en los niveles de
maduracin en las hembras transgnicas sugiere el papel de GnRH es la sincronizacin del
desarrollo de los huevos.
Hay que decir que haba varios nucletidos que eran incompatibles entre la secuencia
antisentido del salmn y la secuencia diana de la trucha (concretamente 16pb respecto a la
secuencia del GnRH3A y 4pb respecto a la secuencia del GnRH3B), lo que llev a los autores a
sugerir que se requera una complementariedad del 100% para inducir esterilidad. Adems, se
observ que cuando un RNA antisentido produca la inhibicin de un fago mutado, ese mismo
RNA no inhiba a otros fagos mutados o bien al fago original.

S. Uzbekova, J. Chyb, F. Ferrire, T. Bailhache, P. Prunet, P. Alestrom, B. Breton. Transgenic rainbow trout expressed sGnRHantisense RNA under the control of sGnRH promoter of Atlantic salmon.

Otro estudio emple cinco constructos diferentes con el objetivo de actuar sobre el mRNA de
GnRH1, GnRH3 y de la subunidad de LH de la especie tilapia del Nilo. Los constructos eran:
a) Promotor de -actina de tilapia/secuencia antisentido de la subunidad de LH de
tilapia.
b) Promotor de -actina de carpa/secuencia antisentido de GnRH3 de tilapia.
c) Promotor de -actina de tilapia/secuencia antisentido de GnRH1 de tilapia.
d) Promotor de histona 3 de tilapia/secuencia antisentido de GnRH1 de tilapia.
e) Promotor de GnRH1 de tilapia/secuencia antisentido de GRH1 de tilapia.
En los estudios preliminares, no se detect esterilidad con los constructos a, c o d. Sin embargo,
cuando las hembras transgnicas que expresaban la secuencia antisentido de GnRH3 de tilapia

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bajo el control del promotor constitutivo de la -actina de la carpa eran cruzadas con machos
salvajes, se produca una reduccin a la mitad de la fertilidad respecto a la de las hembras
control no transgnicas. La fertilidad se reduca mucho ms en machos transgnicos cruzados
con hembras control. En algunos casos, se obtena un 0% de fertilidad con una media de un
80% de reduccin en la fertilidad.
En otro estudio se ha empleado una construccin antisentido para el gen GNRH3 de carpa bajo
el control del promotor de la actina de la misma especie. Se determin que
aproximadamente un 30% de la poblacin parental no desarrollaba gnadas y que adems la
fertilidad se restableca por la administracin de hormona exgena.
Por otra parte, se han usado ribozimas de cabeza de martillo bajo el control del promotor de la
U6 RNA polimerasa para actuar sobre cinco sitios potenciales para silenciar la expresin de
GnRH1 en tilapia. Estos sitios contienen la secuencia GUC, que se ha visto que es la ms
sensible al corte por ribozima.
En la especie pez cebra, las ribozimas se usaron con xito para conseguir el silenciamiento del
gen ntl para producir un pez con un fenotipo igual al pez que tiene una mutacin conocida en
ese mismo gen. As que este mtodo podra ser til para alcanzar una posible esterilizacin
actuando sobre los genes correspondientes. Pero la desventaja reside en que hay que
determinar la mejor diana para ejercer el silenciamiento.

A.C. Wong, A.L. Van Eenennaam. Transgenic approaches for the reproductive containment of genetically engineered fish.

No obstante, ante la ausencia de ms estudios que muestren la eficiencia del uso de secuencias
antisentido contra genes de hormonas de la reproduccin, no es posible establecer la
efectividad potencial de esta tcnica para la contencin reproductiva. Se necesita ms trabajo
para determinar si las tcnicas de RNA antisentido, ribozimas y otras, pueden conseguir
esterilidad a escala comercial, adems de los efectos pleitrpicos (producidos por un solo gen)
que podran asociarse con la inactivacin de genes diana implicados en la cascada hormonal de
la reproduccin o con el silenciamiento involuntaria de genes que no son diana.

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INTERRUPCIN TRANSGNICA DEL DESARROLLO EMBRIONARIO

Otras estrategias de contencin, o control de la reproduccin de transgnicos, tambin con
falta de publicaciones en la literatura cientfica, son los procedimientos de esterilizacin del
silvestre. Se trata de un constructo que permite la reproduccin a los animales en cautividad,
pero que los hace estriles cuando estos llegan a un medio natural, por lo tanto se trata de un
mtodo que permite el control reversible sobre la fertilidad y la reproduccin.
El constructo comprende: un primer promotor que se activa en un regin concreta (tejido
especfico) o de manera temporal unido al ADN que codifica una protena transactivadora; y un
segundo promotor que es activado por dicha protena transactivadora, este promotor a su vez
va ligado a un gen codificante para una molcula bloqueante, la cual tiene la capacidad de
interrumpir en la gnesis de gametos o en la embriognesis. Suministrando al animal
componentes que prevengan la unin de la protena de transactivacin con el segundo
promotor se controla la fertilidad. La Organizacin Cientfica de Investigacin Industrial
(CSIRO) en Australia ha iniciado investigaciones y pruebas sobre este procedimiento
experimental utilizando modificaciones transgnicas capaces de interrumpir el desarrollo de
forma reversible.
En trminos simples, el proceso est enfocado a desarrollar RNA antisentido, o fragmentos
interferentes de RNA de doble cadena, los cuales actuarn activando o reprimiendo la
expresin de genes cruciales en el desarrollo, este es el caso del gen para la protena
morfognica del hueso (zBMP2) de pez cebra, activada solamente durante el desarrollo
embrionario (Kishimoto et al., 1997).
Estos constructos estn bajo el control de elementos de respuesta a protenas
transactivadoras. En cautividad, la expresin de estos genes pueden ser inhibidos mediante la
adicin planificada de componentes exgenos como es el caso de la tetraciclina o la
doxiciclina, las cuales se unen fuertemente al elemento transactivador y evitan que existan
nuevas interacciones de estos con los elemento de respuesta a transactivacin. En la
naturaleza, donde no pueden estar presentes estos componentes inhibidores de protenas
transactivadoras, el constructo se expresar e inactivar genes esenciales para el desarrollo,
resultando en la muerte del embrin.
En este artculo se describe el bloqueo del gen zBMP2, una protena expresada solamente
durante la etapa ms temprana del desarrollo larval, y esencial para el desarrollo normal de los
tejidos especficos del pez cebra.
De forma ms detallada el mtodo para llevar a cabo el bloqueo se desarrolla de la siguiente
manera:

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A.C. Wong, A.L. Van Eenennaam. Transgenic approaches for the reproductive containment of genetically engineered fish.

Se pretende bloquear el gen zBMP2, gen codificante para la protena morfognica del hueso
en pez cebra, de crucial importancia para su desarrollo embrionario. Para ello lo primero ha
sido buscar y seleccionar un promotor de actividad temprana, pero que se restrinja con el paso
de un periodo de tiempo, y adems que comparta el mismo espacio de expresin que zBMP2,
de esta manera se consigue que los productos de ambos genes se expresen al mismo tiempo.
Dicho promotor est acoplado a un gen codificante para un activador translacional de
respuesta a tetraciclina (tTA).
En ausencia de tetraciclina el activador translacional se va a unir al elemento de respuesta a
tetraciclina, que activar el promotor CMV, el cual permite la expresin del gen mutado
SMAD5. Este gen va a expresar fragmentos de ARN de cadena simple o doble,
complementarios al producto del gen zBMP2, de manera que se producir un bloqueo
continuo de este gen, y se impide as el desarrollo larval.
En presencia de tetraciclina el tTA no puede interaccionar con el promotor del gen bloqueante,
de manera que el desarrollo se producir con normalidad.
En experimentos en los cuales se inyecto RNA de doble cadena correspondiente al gen zBMP2
directamente sobre el embrin, el bloqueo de la viabilidad embrionaria no fue muy exitosa, ya
que la tasa de embriones que sobrevivieron fue relativamente alta. Esto podra ser debido a
una fuerte presin de seleccin sobre embriones viables, especialmente los que tienen ventajas
transgenefitness, incluso una pequea tasa de supervivencia en el medio natural podra ser
motivo de una gran preocupacin. La contencin tambin puede verse comprometida si los
componentes exgenos que disparan la inactivacin de la transactivacin apareciesen en el
entorno natural.
Este tipo de enfoque sobre la contencin de los peces transgnicos es anlogo a la controvertida
tecnologa terminator desarrollada para la contencin de plantas transgnicas. A pesar de su

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alto potencial, no se han dado experimentos exitosos usando la tecnologa terminator, la cual
requiere que tres genes diferentes sean activados de una manera bastante especfica, y ha sido
reportada por profesionales en la revisin de la revista.
Tambin hay investigaciones llevadas a cabo por la industria privada para conseguir distintos
enfoques transgnicos para la contencin.
En 2003, Aqua Bounty Technologies recibi una subvencin de 1,68 millones de dlares,
procedente del Instituto Nacional de Estndares y Tecnologa del Programa de Tecnologa
Avanzada (NIST ATP) para desarrollar un mtodo de introduccin de genes en peces, los cuales
puedan ser manipulados qumicamente para interrumpir sus los ciclos normales reproductivos
(NIST Advanced Technology Program, 2003). El proyecto detalla brevemente su intencin de
explorar cinco estrategias de ingeniera gentica con carpa comn y pez gato, as como
manipulaciones en criaderos para conseguir primero 100% de esterilidad y despus revertir dicha
esterilidad. Aunque la financiacin del proyecto concluy en septiembre de 2006, no hay ms
detalles los resultados o los avances conseguidos, ni estn disponibles dichos estudios al pblico
actualmente.
ESCISIN TRANSGNICA GONADO-ESPECFICA
Una estrategia diferente para prevenir la propagacin de transgenes que no involucre la
esterilidad es eliminar el transgn de las gnadas de peces transgnicos conservando las
ventajas de la expresin del transgn en tejido somtico, eliminando as el riesgo de que estos
transgenes estn presentes en gametos y que puedan introducirse en las poblaciones silvestres.
Este enfoque hace uso de recombinasas especficas, tales como Cre y FLP, que son enzimas
que pueden catalizar eventos de escisin, de insercin o inversin en el ADN en secuencias de
reconocimiento especficas. Cre (provoca recombinacin) es una protena de 38 kDa del
bacterifago P1 que puede recombinar secuencias de reconocimiento de ADN diana de 34 pb
llamadas sitios loxP (locus de cruzamiento en P1). FLP (abreviatura de "Flip-flop") es una
protena de 43 kDa del crculo de 2 micras de la levadura, Saccharomyces cerevisiae. Como
Cre/loxP, FLP tambin recombina secuencias de reconocimiento de ADN de 34 pb llamados
sitios FRT (diana de reconocimiento de FLP). Se han utilizado recombinasas especficas de sitio
para catalizar la escisin del transgn en plantas y mamferos flanqueando el transgn diana
con los sitios de reconocimiento de la recombinasa. El transgn se escinde mediante la
exposicin del sitio de reconocimiento que flanquea al transgn a la protena recombinasa, por
lo general mediante el cruce de la lnea transgnica con una lnea transgnica que expresa
recombinasa. El control espacial de la inactivacin de genes depende del promotor que se
utiliza para regular la expresin de la recombinasa.

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A.C. Wong, A.L. Van Eenennaam. Transgenic approaches for the reproductive containment of genetically engineered fish.

Varios estudios han demostrado que la recombinasa Cre puede mediar la supresin especfica
de sitio eficaz de transgenes en los peces zebra. Cre mRNA y el plsmido de expresin de DNA
de Cre que contenan transgenes de la protena verde fluorescente (GFP) o de la protena
fluorescente roja (RFP) flanqueados por sitios loxP se microinyectaron en el pez zebra. Se
alcanzaron eficiencias de hasta el 100% en embriones de pez cebra con transgenes diana
integrados de manera estable. Pan et al. (2005), tambin In Vitro, sintetizaron Cre RNA para
demostrar que el sistema de recombinacin Cre/loxP escindir de forma eficaz y exacta una
construccin gnica GFP dirigido por el promotor mylz2 especfico de msculo. Recientemente,
una forma inducible-shock de calor del sistema Cre/loxP se ha utilizado para generar mltiples
tipos de tumores inducidos por Ras y la hiperplasia en el pez cebra transgnico.
Hu et al. (2006) describen un experimento de cruzar dos lneas transgnicas de pez-zebra, uno
que expresan la ARN polimerasa de T7 bajo el control de un promotor de protamina-esperma
especfico, y el otro que expresa un gen de la recombinasa Cre dirigido por un promotor T7,
para escindir un gen marcador fluorescente de la protena de los testculos de la descendencia
masculina del pez cebra. Cuando se cruzaron las dos lneas, la expresin de la ARN polimerasa
T7 en la gnada masculina activa el promotor T7 para expresar Cre, que escinde el transgn de
los testculos de la descendencia masculina. Una vez ms, no hay detalles de los mtodos
experimentales o las tasas de xito fueron proporcionados en la publicacin. Aunque se afirma
que el transgn se escinde especficamente de las gnadas de la descendencia, no se indica si
esta incluye la descendencia femenina. Asimismo, no est claro si los transgenes de reciente
introduccin, el gen de la polimerasa de T7 impulsado por la protamina y el gen de la
recombinasa Cre T7 impulsada, se incluyeron en el evento de escisin ya que ellos tambin
constituiran transgenes. Esto pone de manifiesto una de las debilidades de este tipo de
enfoque de la eliminacin de los transgenes, y es que recapitula el problema de la transmisin
del transgn. El proceso de escisin del transgn de destino desde la gnada a su vez introduce

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un nuevo transgn hereditario (es decir, la recombinasa) y sus secuencias reguladoras en el

ADN del organismo. Adems, si los reproductores transgnico lograron escapar de su
confinamiento y aparearse con las poblaciones nativas de peces, la contencin reproductiva
sera violada. Aunque, esto podra evitarse si los reproductores transgnico se plantearon y se
cri en una instalacin sin salida al mar garantizada slo con la descendencia que se les permita
ser cultivadas en jaulas y jaulas marinas ms tradicionales. Este enfoque, sin embargo, no
aborda el problema de la competencia entre los peces transgnicos escapados y congneres
salvajes.
Incluso puede argumentarse que el escape de peces transgnicos que expresan recombinasa
plantea una amenaza para las poblaciones de peces nativos que los peces transgnicos
hormona del crecimiento. La exposicin prolongada a recombinaciones puede provocar
reordenamientos cromosmicos y reducir la fertilidad de las lneas de recombinasa que
expresan. Esto se cree que es un resultado de sitios de "pseudo-reconocimiento" en el genoma
de eucariotas. Para evitar este problema, es posible limitar la expresin de la recombinasa por
el flanqueamiento del transgn de la recombinasa con sus propios sitios de reconocimiento de
tal manera que la expresin de la protena recombinasa elimina simultneamente tanto el
transgn de destino y la auto-escisin del locus cis recombinasa. La paradoja de este enfoque
es que no es posible establecer la lnea de expresin de la recombinasa debido a que el locus
del transgn de la recombinasa ser escindido de las clulas germinales y por lo tanto ausente
en los gametos.
Los enfoques transgnicos analizados en este artculo implican la introduccin de nuevos
"transgenes de contencin" en el genoma de los peces transgnicos, y estas secuencias deben
a su vez ser diseadas para cumplir con las normas reguladoras y tienen libertad para operar
con respecto a la propiedad intelectual. Dados los extensos procesos de regulacin que han
sido asociados con la aprobacin de organismos genticamente modificados que expresan
protenas bien caracterizadas que han estado histricamente presentes en el suministro de
alimentos y son generalmente considerados como seguros (GRAS), puede ser que conseguir
esta "contencin de transgenes" a travs del proceso de regulacin ser an ms difcil que la
superacin de los obstculos tcnicos necesarios para reducir estos enfoques a la prctica.
Aunque los enfoques de contencin transgnicos tienen el potencial de reducir al mnimo los
riesgos ecolgicos de los peces transgnicos liberados o escapados, las incertidumbres
asociadas a estos mtodos tambin pueden representar un objetivo de bienvenida por los
opositores a la ingeniera gentica y proporcionar un desincentivo ms para la adopcin
comercial de estos enfoques.
La prevencin de la reproduccin sexual en niveles cercanos al 100% es un desafo de enormes
proporciones dada la fuerte presin de seleccin para la reversin a la fertilidad. Los enfoques
knockout de genes, aunque no est disponible actualmente para las especies de peces
comerciales, pueden representar la forma ms fiable para garantizar la ausencia de un

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producto especfico de genes reproductivos. Rutinariamente, poder eliminar la funcin de

genes especficos ha sido la ambicin de muchos animales genetistas. El establecimiento de
lneas de clulas madre embrionarias permiti el desarrollo de tcnicas de knockout de genes
especficos en el ratn. Desafortunadamente, la generacin de heredables y mutaciones
especficas en otros vertebrados se ha visto frustrada por la incapacidad de establecer lneas de
clulas madre embrionarias. Sin embargo, el cultivo a largo plazo de las clulas que pueden
contribuir a la lnea germinal y la recombinacin homloga han sido recientemente reportados
en el pez cebra. Lneas de clulas madre pluripotentes han sido establecidas en medaka, la
perca de mar, la dorada, besugo, la platija japonesa, el rodaballo, y la lubina asitica, sin
embargo, la lnea de competencia del germen in vivo de estas lneas celulares an no ha sido
demostrada. El lento avance en la bsqueda de clulas madre embrionarias pluripotentes en la
ltima dcada ha fomentado la investigacin en distintos criterios para la orientacin de genes
en los peces. La transferencia nuclear de clulas somticas de clonacin a partir de clulas
cultivadas se ha logrado en los dos medaka y pez cebra, y en el futuro este enfoque puede
ofrecer la oportunidad ms prometedora para knockouts de genes especficos en especies
comerciales. Irreversiblemente la ablacin de un gen reproductivo dedicado como LH, es un
enfoque atractivo para la produccin de peces obligatoriamente estril que slo puede ser
hecha frtil por la administracin exgena de hormonas. Tales peces no confiaran en la
expresin de protenas transgnicas para conferir esterilidad y pueden ofrecer a promotores y
agencias reguladoras un enfoque seguro y eficaz para llevar a cabo la contencin de
reproduccin de peces transgnicos.
ESTRATEGIA ON-OFF
En un estudio realizado sobre pez cebra, se llev a cabo una estrategia donde la descendencia
es estril pero asegura que la generacin parental permanece frtil. Para ello, se produjo una
lnea transgnica que expresara el activador transcripcional GAL4 (TG1), y otra lnea que
expresara el RNA antisentido dnd bajo el control de cinco unidades de efector UAS (TG2). Estas
dos lneas eran frtiles, pero en la descendencia hbrida (TG3) GAL4 induce la transcripcin del
RNA antisentido para silenciar la expresin del gen dnd endgeno. Esto afecta a la migracin
de las clulas germinales primordiales, que son las precursoras de las clulas germinales, ya
que el gen dnd es esencial para la migracin normal y la supervivencia de las clulas germinales
primordiales. Deriva en apoptosis y por tanto en la esterilidad o reduccin de la capacidad
reproductiva de los individuos adultos.

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Y. Zhang, J. Chen, X. Cui, D. Luo, H. Xia, J. Dai, Z. Zhu, W. Hu. A controllable on-off strategy for the reproductive
containment of fish.

No haba diferencias significativas en el nivel de mRNA del dnd endgeno entre la

descendencia hbrida y las lneas salvajes en los estadios de 1 clula, 1000 clulas y ovoide. Sin
embargo, el nivel en la lnea hbrida era notablemente ms bajo en los estadios de 50% epibolia
y 3-somita.

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Y. Zhang, J. Chen, X. Cui, D. Luo, H. Xia, J. Dai, Z. Zhu, W. Hu. A controllable on-off strategy for the reproductive
containment of fish.

El gen dnd codifica una protena de unin al RNA que se puede unir a la regin 3 no traducida
del mRNA de nanos1 y tdrd7 para protegerlos de la represin mediada por miR-430. De esta
forma, los niveles de expresin de esos dos genes pueden reflejar a su vez el nivel de protena
DND. Los niveles de mRNA de nanos1 y tdrd7 tambin eran normales en la descendencia
hbrida en los primeros estadios, pero eran ms bajos en los estadios de 50% epibolia y 3somita.

Y. Zhang, J. Chen, X. Cui, D. Luo, H. Xia, J. Dai, Z. Zhu, W. Hu. A controllable on-off strategy for the reproductive
containment of fish.

Se conclua por tanto que la expresin del gen dnd se reprima por el antisentido inducido por
el sistema GAL4/UAS durante la embriognesis temprana.
Respecto a las clulas germinales primordiales, la cantidad en los embriones TG3 se redujo en
el 79% de dichos embriones a las 20 horas tras la fertilizacin y en el 67% de los embriones a las
24 horas de la fertilizacin. Adems, casi no quedaban clulas germinales primordiales en un
148% de los embriones a las 24 horas.

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containment of fish.

Evaluando la capacidad reproductiva, se observ que un 308% de machos de la descendencia

hbrida fallaban al fertilizar los huevos de hembras salvajes, mientras que un 31% de hembras
de la descendencia hbrida no producan huevos tras ser estimuladas por machos salvajes. Una
parte de ellos s se reproduca, pero la tasa de fertilizacin/fecundidad disminua tanto para
machos como para hembras. Los individuos que no se reproducan se denominaron TG3-1 y los
que s TG3-2.

Y. Zhang, J. Chen, X. Cui, D. Luo, H. Xia, J. Dai, Z. Zhu, W. Hu. A controllable on-off strategy for the reproductive
containment of fish.

Lo hallado se relaciona con la metilacin de la secuencia UAS. La metilacin de las cinco

unidades de UAS era menor en los individuos que eran estriles (TG3-1) respecto a los que
tenan una tasa menor de reproductividad (TG3-2). En el primer caso, como la metilacin era
menor se produca una mayor cantidad de antisentido dnd, teniendo como resultado un mayor
silenciamiento del dnd endgeno, por lo que los individuos TG3-1 efectivamente presentaban
un menor nivel de dnd endgeno (como era de esperar) que los TG3-2. Esto se observ gracias
al gen de la protena EGFP, cuya expresin quedaba regulada por las secuencias UAS, y que

Biotecnologa Animal

Grado en Bioqumica

mostraba un mosaicismo tanto en las larvas como en las gnadas de los adultos, adems este
mosaicismo variaba entre unos individuos y otros. Estas diferencias podan dar lugar a la
variacin en el nmero de clulas germinales que sufran apoptosis, generando adultos con
diferentes capacidades reproductivas.

Y. Zhang, J. Chen, X. Cui, D. Luo, H. Xia, J. Dai, Z. Zhu, W. Hu. A controllable on-off strategy for the reproductive
containment of fish.

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Grado en Bioqumica

Poco a poco, la produccin de organismos transgnicos se est viendo impulsada dado el gran
nmero de aspectos y aplicaciones que puede cubrir. En concreto, los peces se estn
empleando para la investigacin y otros fines como los ya comentados. Sin embargo, son
necesarios ms estudios y el perfeccionamiento de los mismos para conseguir una mayor tasa
de xito, adems de evitar el problema del escape de dichos peces al medio, que se puede
conseguir mediante distintas tcnicas que an deben ser objeto de un anlisis ms profundo
por parte de los investigadores.

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