Instituto de Ciencias Biomédicas

Manual de técnicas
de biología
molecular

Aris Emilia Camarena González

223896
Profesor José Luis Castellanos Lira Lara
Tabla de contenido
Manual de técnicas de biología molecular .................................................................. 1

Introducción....................................................................................................................................... 6
Manejo de muestras .......................................................................................................................... 6
Selección de la muestra ................................................................................................................. 6
Toma de la muestra ....................................................................................................................... 7
Preservación................................................................................................................................... 8
Contaminación de muestra ............................................................................................................... 9
Resultados falsos positivos ............................................................................................................ 9
Resultados falsos negativos........................................................................................................... 9
Articulo............................................................................................................................................... 9
Extracción de ácidos nucleicos ....................................................................................................... 10
Elección del método de extracción ............................................................................................. 10
Fuente del ácido nucleico ............................................................................................................ 10
Extracción de DNA ......................................................................................................................... 11
Técnica fenol-cloroformo............................................................................................................ 11
Extracción de DNA por la técnica de salting OUT....................................................................... 13
Extracción de RNA ......................................................................................................................... 13
Técnica de isotiocianato de guanidina/fenol-cloroformo ............................................................. 13
Otros métodos de extracción .......................................................................................................... 13
Gradiente con cloruro de cesio ................................................................................................... 13
Cromatografía por exclusión de tamaño ................................................................................... 14
Cromatografía de intercambio iónico ....................................................................................... 14
Cromatografía de absorción ....................................................................................................... 14
Articulo............................................................................................................................................. 14
Electroforesis ................................................................................................................................... 15
Elementos necesarios para una electroforesis............................................................................... 15
Cámara de electroforesis ............................................................................................................ 15
Gel ................................................................................................................................................. 15
Geles de agarosa ...................................................................................................................... 15
Geles de acrilamida ................................................................................................................. 16
Buffer de corrimiento.................................................................................................................. 17
Marcador de peso molecular ...................................................................................................... 17
Buffer de carga ............................................................................................................................ 17
 Transiluminador ultravioleta ..................................................................................................... 18
Electroforesis horizontal ................................................................................................................. 18
Electroforesis vertical ..................................................................................................................... 18
Procedimiento general para una electroforesis ............................................................................ 18
Electroforesis de ácidos nucleicos .............................................................................................. 18
Visualización de las muestras ................................................................................................. 19
Electroforesis de proteínas ......................................................................................................... 19
Visualización de las muestras ................................................................................................. 20
Aplicaciones de la electroforesis..................................................................................................... 21
Articulo............................................................................................................................................. 21
Enzimas de restricción .................................................................................................................... 21
Origen de las enzimas de restricción ............................................................................................. 22
Nomenclatura .................................................................................................................................. 22
Clasificación de enzimas de restricción ......................................................................................... 22
Tipo I ............................................................................................................................................ 22
Tipo II........................................................................................................................................... 22
Tipo III ......................................................................................................................................... 23
Aplicaciones de las enzimas de restricción .................................................................................... 23
Tipos de cortes producidos por las enzimas de restricción ......................................................... 23
Isoesquizómeros........................................................................................................................... 23
Familias de enzimas de restricción ................................................................................................ 23
Factores que afectan la actividad de las enzimas de restricción ................................................. 24
Condiciones de almacenamiento y conservación de las enzimas de restricción ........................ 24
Selección de la enzima de restricción adecuad ............................................................................. 24
Eficiencia en el uso de las enzimas de restricción ......................................................................... 24
Cantidad de enzimas adecuada para un ensayo ........................................................................... 25
Articulo............................................................................................................................................. 25
Vector de clonación y expresión ..................................................................................................... 25
Clonación ......................................................................................................................................... 25
Vectores de clonación ...................................................................................................................... 26
Clasificación de vectores ............................................................................................................. 26
Vectores de clonación .............................................................................................................. 26
Vectores de expresión.............................................................................................................. 26
Elementos que forman un vector de clonación ......................................................................... 26
Plásmidos ..................................................................................................................................... 26
 Bacteriófagos ............................................................................................................................... 27
Cósmidos ...................................................................................................................................... 27
Cromosomas artificiales ............................................................................................................. 27
Vectores de expresión...................................................................................................................... 27
Componentes de los vectores de expresión................................................................................ 27
Aplicaciones de la clonación molecular ......................................................................................... 28
Genoteca ....................................................................................................................................... 28
Genotecas de DNAc ................................................................................................................. 28
Genotecas de DNAg................................................................................................................. 28
Producción de proteínas recombinantes ................................................................................... 28
Articulo............................................................................................................................................. 29
Tipos de PCR y aplicaciones .......................................................................................................... 29
Características de la amplificación in vitro y requerimientos necesarios para la PCR ............ 30
DNA polimerasa .......................................................................................................................... 30
DNA molde................................................................................................................................... 30
Desoxinucleótidos ........................................................................................................................ 31
Amortiguadores ........................................................................................................................... 31
Cloruro de magnesio ................................................................................................................... 31
Iniciadores.................................................................................................................................... 31
Diseño de iniciadores y su papel en la especialidad de la PCR ........................................... 31
Esquema de la PCR ......................................................................................................................... 32
Termociclador ............................................................................................................................. 32
Inicio de la desnaturalización ..................................................................................................... 33
Ciclos de amplificación ............................................................................................................... 33
Desnaturalización .................................................................................................................... 33
Alineación................................................................................................................................. 33
Extensión .................................................................................................................................. 33
Amplificación final .................................................................................................................. 33
Almacenamiento temporal ..................................................................................................... 33
Cantidad del producto por PCR .................................................................................................... 33
Sensibilidad de la técnica de PCR .................................................................................................. 34
Modalidades de la técnica de PCR................................................................................................. 34
PCR convencional ....................................................................................................................... 34
PCR semicuantitativa ................................................................................................................. 34
 PCR cuantitativa ......................................................................................................................... 35
PCR múltiple ............................................................................................................................... 35
PCR selectiva ............................................................................................................................... 35
PCR in situ ................................................................................................................................... 35
PCR anidada ................................................................................................................................ 35
PCR en punto final ...................................................................................................................... 35
PCR en tiempo real ..................................................................................................................... 36
Retrotranscripción como paso previo a la PCR ........................................................................... 36
Aplicaciones de la PCR ................................................................................................................... 37
Diagnóstico como aplicación de la PCR ........................................................................................ 37
Articulo............................................................................................................................................. 37
Secuenciación del DNA y microarreglos ....................................................................................... 38
Secuencia .......................................................................................................................................... 38
Método química o degradación de Maxam Y Gilbert.............................................................. 38
El método de “didesoxi” de Sanger ........................................................................................... 40
Método automatizado ................................................................................................................. 41
Secuencia de alto rendimiento.................................................................................................... 43
Microarreglos .................................................................................................................................. 43
Articulo............................................................................................................................................. 44
CONCLUSIÓN ................................................................................................................................ 44
REFERENCIAS .............................................................................................................................. 44

Introducción
Objetivo
Dar a conocer las diferentes técnicas de
biología molecular, profundizar en ellas,
con, sus ventajas, características y las
aplicaciones que tienen, así como, la
mención de artículos que se encuentran
fundamentados por las técnicas que se
describirán.
Resumen
Este trabajo propone exponer las técnicas
de biología molecular fundamentales en la
actualidad para los investigadores. La
exposición de cada técnica se presentará
de manera sistematizada con sus ventajas,
inconvenientes de manera detallada para
poder tener muy claro cuáles son sus
aplicaciones en la actualidad. Entre las
principales técnicas se encuentran: la
electroforesis, la PCR, la secuenciación de
DNA, la clonación de genes y extracción
de ácidos nucleicos.
Key Words
Técnicas, DNA, RNA, aplicaciones,
enzimas
Abstract
This work proposes to expose the currently
fundamental molecular biology techniques
for researchers. The exposition of each
technique is in a systematic way with its
advantages, disadvantages in detail in
order to be very clear about its applications
today. Among the main techniques are:
electrophoresis, PCR, DNA sequencing,
gene cloning and nucleic acid extraction.
Manejo de muestras
La realización de las técnicas moleculares
debe llevarse a cabo por personal
almamente calificado en el área de
biología molecular. No obstante, los
resultados que se obtengan no solo
dependerán de la prueba, sino también de
la toma y conservación apropiada de la
muestra. El majeño de muestras implica
tres pasos fundamentales: selección, toma
y preservación de la muestra.
Selección de la muestra
Se debe de elegir la muestra que contenga
el ácido nucleico (DNA o RNA) de interés.
De aquí surgen dos alternativas: estudio de
ácidos nucleicos del individuo o detección
de ácido nucleicos exógenos.
En la figura 1 se señala algunos casos en
los que se puede utilizar
el análisis molecular e indica el tipo de
muestra adecuado para las necesidades.
Figura 1
Estudio de ácidos nucleicos de un
individuo
Análisis de la estructura genómica de un
individuo
Para este estudio nuestra molécula de
interés es el DNA genómico que se
encuentra en el núcleo de la célula. Todas
las células un individuo poseen el mismo
conjunto de material genético (genoma).
Por ello, la muestra para analizar puede
ser de cualquier célula nucleada. No
obstante, hay que elegir la muestra que
conlleve procedimientos muy invasivos y
la menor cantidad de riesgos e
incomodidad para el individuo. La
muestra elegida para el análisis de la
estructura del genoma de un individuo es
sangre periférica con anticoagulante;
contiene eritrocitos, leucocitos y
plaquetas. Los leucocitos son las únicas
células nucleadas en este tejido, es por
eso por lo que gracias a estos es posible la
extracción de DNA genómico.
Estudio de la expresión génica de un individuo
Para le análisis de la estructura del RNA
mensajero (RNAm). Este estudio revelará
las modificaciones bioquímicas que
experimenta el organismo en respuesta a
una situación en específico o momento
metabólico. La expresión génica es
regulada de manera especial y temporal,
la regulación especial representa la base
de la diferenciación celular. Esto quiere
decir que los genes no se expresan en
todos los tejidos, sino que cada tejido u
órgano únicamente los genes necesarios
para su funcionamiento. Por otro lado, la
regulación temporal, se refiere a que esta
regulación depende del momento
metabólico en el que se encuentra el
individuo. Estudiar la expresión génica
resulta elemental en investigaciones para
evaluar la repuesta a una variable
específica y contribuir al conocimiento de
la patología y fisiología. No obstante, en
la práctica, el estudio de la expresión de
genes es complejo y por el momento no
se considera una herramienta de
diagnóstico de uso rutinario y al alcance
de todos.
La muestra de elección dependerá del
tejido donde este expresado el gen de
interés: si se expresa en el hígado, una
biopsia de hígado, si se expresa en tejido
tumoral, una biopsia al tejido dudoso.
Detección de ácidos nucleicos exógenos
DNA Exógenos
Las técnicas de biología molecular permiten la
detección de DNA ajeno al paciente, bacterias y
virus de DNA, por lo que resulta útil para el
diagnóstico molecular de enfermedades por
microrganismos. Para la detección de genomas
exógenos, la muestra dependerá de la historia
natural del microorganismo infectante.
RNA Exógenos
La detección de RNA exógeno a través de
estudios moleculares en una práctica
continua en investigación. La muestra de
elección dependerá, al igual que la
detección de DNA, de la historia natural
de la partícula infectante.
Toma de la muestra
En la toma de muestra para el estudio es
necesario tener en cuenta ciertos factores y
recomendaciones que son presentadas a
continuación para garantizar que la toma
de la muestra sea exitosa.
Uso de material libre de nucleasas
Las nucleasas son enzimas sumamente
estables que degradan el RNA, por lo que
se necesita la ausencia de estas enzimas en
el material que se destine para análisis
molecular como las puntas y tubos de
plástico, que deben ser nuevos y estériles,
otros materiales que es recomendable usar
son el vidrio y el metal ya que se pueden
calentar a grandes temperaturas e inactivar
las nucleasas por horas.
Uso de guantes y cubrebocas
Las enzimas DNAsas y RNAsas se
encuentran en nuestra saliva, y el sudor,
por lo que para evitar que las nuestras se
degraden es necesario usar guantes y
cubrebocas y el cambio continuo cuando
se trabaja con ácidos nucleicos.
Limpieza total
Tanto las bacterias como los hongos y
células muertas que se encuentran en
nuestra piel son ricas en RNAsas, por eso
se recomienda tomar las muestras que se
analizaran en un ambiente higiénico,
desinfectar la superficie de trabajo con
agentes de naturaleza inhibidora de
RNAsas, como el fenol, DEPC
(Dietilpirocarbonato de sodio).
Anticoagulante
Sustancias que inhiben la cascada de
coagulación y que se utiliza para la toma
de muestras. El ácido
etilendiaminotetraacético (EDTA) es el
coagulante usado con más frecuencia, otro
coagulante muy común es el citrato de
sodio. El uso de la heparina no es muy
recomendable, ya que puede interferir en
procedimientos posteriores como la
reacción en cadena de la polimerasa (PCR).
DNA O RNA de glóbulos blancos
Para poder aislar el DNA o RNA a partir
de los leucocitos se debe tomar una
muestra de sangre periférica en un tubo
nuevo, estéril con anticoagulante. La
cantidad de sangre extraída dependerá del
método de extracción de ácidos nucleicos
que vaya a emplearse. Las muestras de
DNA pueden guardarse hasta por 5 días a
4°C sin que el material genético se vea
afectado. Para la obtención de RNA el
procesamiento debe ser preferiblemente de
inmediato para evitar la degradación de
esta.
DNA o RNA de suero
Se toman 3 ml de sangre, se deja a
temperatura ambiente el tiempo mínimo
para la formación de un coagulo (20
minutos máximo). Seguido de esto la
muestra se centrifuga a 3000 rpm durante
10 minutos para lograr separar el suero, y
se transfiere a un tubo nuevo y estéril. Se
extrae los ácidos nucleicos del suero y se
guardan a -20°C hasta que se procese.
DNA o RNA de biopsia
La expresión génica la base de la
diferenciación celular, por lo que el
estudio de la expresión génica de un
individuo involucra a toma de una biopsia
del tejido de interés. También se puede
realizar la búsqueda de ácidos nucleicos
exógenos en un tejido especifico. La
biopsia se realiza por el personal médico
experto, es un método invasivo que
representa un riesgo par ale paciente y se
requiere un uso de equipo costoso.
Otros fluidos biológicos
En caso de la orina, líquido
cefalorraquídeo o líquidos de punción se
debe tomar la muestra en recipientes
estériles para evitar la contaminación de
la muestra.
Preservación
Los ácidos nucleicos son susceptibles a
degradarse por las nucleasas que están
presentes en todas las células. La
preservación de los ácidos nucleicos su
objetivo es la inactivación de las nucleasas.
Biopsia
Como se mencionó anteriormente, las
biopsias se emplean por lo general para el
estudio de la expresión génica (RNA);
aunque también puede extraerse DNA
exógeno o del paciente. A pesar de ello, los
cuidados en el manejo de las biopsias están
dirigidos en un principio a la preservación
de RNA por ser una molécula fácil de
degradar.
Fluidos biológicos Resultados falsos positivos
Siempre que la molécula de interés sea Se obtiene cuando una muestra se
RNA las muestras deben mantenerse a - contamina con otra, debido a un
70°C o en nitrógeno líquido hasta que se procesamiento inadecuado y da como
lleve la extracción de este mismo. resultado la detección de DNA o de RNA
DNA de leucocitos ajeno a la muestra de interés.
Las muestras de sangre para la obtención Resultados falsos negativos
de leucocitos y la posterior extracción de Surgen cuando el DNA o RNA presentes en
DNA pueden mantenerse a una una muestra de degradan por acción de las
temperatura de 15°C y 25°C hasta por 48 nucleasas, lo que los convierte en
horas; a 4°C por días o inmediatamente a - indetectable a la sensibilidad del método
70°C. No obstante, para garantizar el buen molecular utilizado
resultado de la obtención de DNA en
buena cantidad y calidad utilizando
métodos económicos de extracción debe
llevarse lo antes posible.
RNA o DNA en suero
El suero debe mantenerse a -70°C o en
nitrógeno líquido.
Uso de métodos comerciales
Actualmente el desarrollo de la biología
molecular y la ingeniería genética han Figura 2
permitido el diseño de moléculas o
sustancias que preservan la integridad de Articulo
los ácidos nucleicos manteniendo las
muestras de -20°C, 4°C y a temperatura
ambiente. Igualmente, se disponen de
El artículo de Cristina Gil “Uso de
métodos comerciales para la extracción de
muestras biológicas humanas con fines de
ácidos nucleicos de muestras no frescas,
investigación” habla sobre el hecho de que
que ofrecen un rendimiento aceptable a
las muestras biológicas son depósitos de
partir de muestras no almacenadas de
información sobre las características
manera adecuada. La diferencia del
genéticas de un individuo. Los
rendimiento se puede ver claramente en
investigadores, los laboratorios clínicos y
los costos ya que un método de extracción
de investigación tienen almacenadas
casero puede tener un costo 100 veces
muestras biológicas, a veces obtenidas
menor a uno comercial.
mediante asistencia (sobrantes o
reservadas para revisión diagnóstica o
Contaminación de muestra
validación de nuevas tecnologías), o
Pueden obtenerse resultados no fidedignos
muestras residuales recolectadas con fines
como las muestras no se procesas o
de investigación para proyectos
conservan de forma adecuada llamados
específicos. La Ley de Investigación
“falsos positivos” y “falsos negativos”
Biomédica y el Real Decreto 1716/2011,
regulan su tratamiento con fines de
investigación en el ámbito biomédico,
aportando una solución para el
almacenamiento de las muestras
destinadas a tal fin. La posibilidad de
utilizar este material biológico para fines
no previstos originalmente plantea muchas
preguntas. En este caso, trataremos la
información obtenida y utilizada por el
interesado, consentiremos su uso y
almacenamiento, y destrucción del
material biológico si fuera necesario.
Extracción de ácidos nucleicos
Los ácidos nucleicos (DNA y RNA)
reciben su nombre por el hecho de ser
moléculas con características acídicas, y
haberse localizado en un inicio en el
núcleo de la célula. Para poder estudiar
estos ácidos es necesario aislarlos del resto
de los componentes celulares (proteínas,
lípidos). También dependiendo el interés
del estudio se aislará ya sea el DNA o el
RNA.
Elección del método de extracción
La extracción es el primer paso por seguir
para la mayoría de los estudios de biología
molecular y para las técnicas de DNA
recombinante. En la actualidad existen
distintas técnicas para la extracción de
ácido nucleicos que se adecuan a las
necesidades de cada estudio o
investigación. Para la elección del método
de extracción se suelen usar los siguientes
criterios en función de lo que se quiera
obtener.
• Tipo de ácido nucleico que se extraerá:
DNA de cadena sencilla (DNAss),
DNAds, RNA total, RNA mensajero
(RNAm) o RNA ribosomal (RNAr).
• Organismos origen del ácido nucleico:
mamíferos, plantas, procariotas o virus.
• Fuente del ácido nucleico: cultivo
celular (biopsias generalmente),
sangre (leucocitos), fluidos (orina,
suero, líquido cefalorraquídeo, etc.)
• Técnica que se utilizará el ácido
extraído: según el uso que se vaya a
tener, los requerimientos de
rendimiento, pureza y tiempo de
extracción varían acorde a la
metodología que se vaya a aplicar,
como PCR, clonación,
retrotranscripción.
En el área médica, el DNA genómico suele
extraerse para su uso como una PCR
cualitativa para diagnóstico,
determinación de variantes alélicas o
clonación de vectores. Por otro lado, el
RNA se extrae para realizar una reacción
de retrotranscripción y, después una PCR
que determine los niveles de expresión
génica en condiciones y momentos
determinados. El DNA mitocondrial, por
su parte, se extrae para diagnosticar
enfermedades mitocondriales o para el
análisis de la evolución.
Fuente del ácido nucleico
Teóricamente el DNA y el RNA se pueden
extraer de cualquier célula, los único que
no se consideran son los eritrocitos ya que
estos pierden su núcleo para que exista una
mayor cantidad de hemoglobina en ellos.
Las fuentes posibles para la extracción de
estos ácidos son: leucocitos, suero, plasma,
biopsia, orina, heces, líquido
cefalorraquídeo, sinovial, amniótico,
esputo, esperma, raspado bucal, etc. Por
razones de ética, se prefieren las muestras
no invasivas frente a cualquier biopsia o
toma invasiva de líquido.
Independientemente del tipo de muestra
utilizada para la extracción se tiene que
realizar técnicas minuciosas que
involucran lisis de la célula, separación,
purificación, precipitación, lavado y
disolución. Durante la extracción de
ácidos nucleicos y en especial del RNA se
deben utilizar instrumentos, nuevos y
estériles libres de nucleasas y el uso de
guantes y cubrebocas para la degradación
de la muestra a causa de las enzimas antes
mencionadas, así como para impedir
cualquier contaminación con ácidos
nucleicos exógenos. Todo proceso deber
realizarse en frio para evitar la
degradación, por último, se conserva la
muestra congelada hasta antes de iniciar la
extracción.
Extracción de DNA
Las técnicas más utilizadas para la
extracción de ácidos nucleicos son muy
diversas e incluyen procesos tanto
químicos como físicos que las diferencian.
Técnica fenol-cloroformo
Fundamental en la lisis total de las células
y sus estructuras subcelulares mediante la
utilización de detergentes con la posterior
eliminación de las proteínas mediante su
extracción y la de componentes lipídicos
con solventes orgánicos. Esto deja al DNA
puro y listo para su separación por
precipitación en soluciones alcohólicas. Es
la técnica mayormente utilizada por la
cantidad y la calidad de DNA obtenido.
Lisis de las células y liberación de DNA
El primer paso para la extracción en la
homogenización del tejido y la lisis con
detergentes (docedil sulfato sódico, SDS)
capaces de romper la membrana celular y
nuclear, y liberar el material genético de
las células de la muestra. Este punto es
crítico ya que debe ser lo suficientemente
agresivo para la fragmentación del tejido y
la rotura de las membranas sin llegar a
degradar el ácido nucleico. La
disgregación del tejido y su
homogenización se lleva a cabo en un
buffer de lisis que contiene sales, un
detergente y proteína k, que libera el DNA
de las histonas. En caso de DNA, la
homogenización se lleva a cabo con un
homogeneizador manual para evitar la
rotura mecánica de la molécula; para el
RNA se utiliza por su parte un
homogeneizador eléctrico. Para las células
que contiene pared celular como las
células vegetales, se prefiere el empleo de
sonicadores, los cuales, mediante ondas de
sonido rompen la pared y la membrana
celular y nuclear. Cuando la extracción se
hace a la sangre periférica, es
recomendable el uso de tubos con ácido
etilendiaminotetraacético como
anticoagulante, debido a que la heparina
interfiere con enzimas como la polimerasa
y las enzimas de restricción. A su vez es
necesario eliminar los eritrocitos, por su
alto contenido en hemoglobina y
careciente de núcleo contaminan la
muestra. La lisis de eritrocitos se lleva a
cabo por adición de una solución
hipotónica a base de cloruro de amonio.
La inactivación de las nucleasas previene
la digestión enzimática de los ácidos
nucleicos, lo que permite la obtención de
fragmentos largos de DNA y RNA.
Extracción de proteínas y lípidos con
solventes orgánicos
Al finalizar la lisis celular y la inactivación
de las nucleasas, se retiran los restos
celulares, proceso conocido como
purificación. Los métodos de purificación
combinan estrategias como la
extracción/precipitación, la cromatografía,
la centrifugación, electroforesis y la
separación por afinidad. Para la extracción
por la técnica de fenol-cloroformo, se
utiliza una disolución 25:24:1 v/v para el
fenol: cloroformo: alcohol isoamílico, que
funciona como un antioxidante de iones
metálicos. El alcohol isoamílico se emplea
para reducir la espuma que puede
generarse al agitar la solución. Esta
solución tiene como propósito
desnaturalizar las proteínas, entre ellas las
nucleasas, y mantiene la separación de la
fase orgánica de la acuosa tras la
centrifugación de la muestra. La
eliminación de las proteínas
componentes no hidrosolubles del
halogenado celular se efectúa con la
formación de dos fases con propiedades de
solubilidad particulares. El DNA es poco
soluble en fenol por lo que suele
estabilizarse con una solución
amortiguadora de Tris que lo mantiene en
un pH de 8 a 8.5, lo que hace que le DNA
permanezca en la fase acuosa.
Precipitación de DNA
El DNA que se encuentra disuelto en la
solución acuosa se precipita al añadir
alcohol (isopropanol o etílico), debido a
que los ácidos nucleicos son insolubles en
soluciones alcohólicas. Cuando se emplea
etanol, la cantidad que se debe añadir en el
doble del volumen de la fase acuosa,
mientras que al añadir isopropanol
solamente se requiere agregar el 0.7 veces
el volumen de la fase acuosa.
Para facilitar la precipitación también
suelen añadirse ácidos monovalentes (K+,
Na+, NH4+) a la solución de ácidos
nucleicos cargados negativamente, con el
fin de generar sales insolubles en alcohol
de fácil precipitación. La precipitación se
ve favorecida al ser incubado en bajas
temperaturas (-20°C); una centrifugación
posterior permite la obtención de una
pastilla o botón del ácido nucleico en el
fondo del tubo, al decantar el alcohol.
Lavado del DNA
El DNA que se obtiene de la precipitación
se debe lavar con etanol al 70%, por lo
menos dos veces. El contenido de alcohol
de esta solución mantiene el DNA
precipitado y el H2O permite la disolución
de las sales presentes. Pasados los dos
lavados, se seca el botón de DNA, esto
permite la evaporación de alcohol.
y Disolución del DNA y adición de
RNAsa
Inmediatamente del lavado del alcohol, la
pastilla de DNA se diluye en soluciones
que aseguren su preservación, como en
agua estéril y libre de DNAsas o bien
soluciones amortiguadoras, como el buffer
Tris EDTA (TE). La cantidad de
disolvente para disolver del DNA debe ser
mínima para mantener una concentración
optima de ácido nucleico que permita su
empleo en técnicas posteriores, pero lo
suficiente para lograr una disolución total
de DNA. El DNA se disuelve por pipeteo
constante del botón hasta lograr una
solución homogénea. Los estudios
demuestran que la disolución del DNA en
buffer TE preserva por mayor tiempo y en
mejores condiciones que cuando se
disuelve en agua estéril, no obstante, es
preferible disolver el RNA en agua-dietil
pirocarbonato al 0.1% lo que evita la
interferencia de las sales de las soluciones
amortiguadoras y lo preserva de las
RNAsas. Para poder eliminar el
contaminante proveniente de la extracción
la solución de DNA es incubada por una
hora a 37°C con RNAsas para evitar que el
RNA interfiera en la cuantificación y en
posteriores técnicas.
Extracción de DNA por la
técnica de salting OUT
Si bien muchos oasis y soluciones son
comunes al método de extracción por
fenol-cloroformo, la principal diferencia
con esta metodología radica en el uso de
una solución concentrada de sales en lugar
de solventes orgánicos para la lisis celular
y la extracción de proteínas. La adición de
una solución saturada de las sales provoca
la agregación de proteínas y debris celular,
lo que permite la separación de los ácidos
nucleicos. Por lo regular, estas soluciones
se preparan a saturación de NaCl. Una
centrifugación posterior a la adición de la
solución concentrada de sales precipita el
debris y las proteínas, y deja libre el DNA
en el líquido del sobrenadante, que se
traspasa a un nuevo tubo para su lavado y
precipitado.
Extracción de RNA
La extracción de RNA de celular
eucariotas se lleva a cabo para desarrollar
estudios de expresión génica, para el
diagnóstico de enfermedades ocasionadas
por virus de RNA o, en el caso de bacterias,
para el análisis de expresión de genes o
validar la clonación de DNA
complementario en un vector. Al extraer
RNA existen dos posibilidades: extracción
de RNA total o extracción oclusiva de
RNAm. Este último es menos complejo y
más económico que la extracción de RNA
total.
Técnica de isotiocianato de
guanidina/fenol-cloroformo
El isotiocianato de guanidina y el fenol se
utilizan como componentes de la solución
de lisis. Es un potente desnaturalizante de
proteínas con capacidades de inhibir
RNAsas. Por lo que es muy utilizado en la
extracción de RNA. El fenol y el
cloroformo se utilizan en la extracción del
RNA con los mismos fines que en la
extracción del DNA. La solución fenólica
empleada en la extracción del RNA es
ácida, para favorecer la extracción de RNA
sobre la de DNA. Posteriormente, el RNA
es purificado a partir de la fase acuosa
mediante precipitación a baja temperatura
con isopropanol y con ayuda de una
centrifugación de manera similar a como
se hace con el DNA.
Otros métodos de extracción
Los métodos comerciales para la
extracción de ácidos nucleicos suelen
basarse en cromatografía de intercambio
aniónico, y emplean algún tipo de columna.
Los kits son rápidos y proporcionan una
buena calidad del ácido nucleico, no
obstante, son costosos en comparación a
los métodos convencionales de extracción.
Gradiente con cloruro de cesio
La centrifugación en gradientes de CsCl
sirve para la purificación de ambos ácidos
nucleicos, aunque su principal uso es el
aislamiento del DNA genómico y
plasmídico. Es una técnica laboriosa,
prolongada y que requiere equipo
especializado, como una ultracentrífuga.
Este método es preferible utilizarse para la
elaboración de genotecas de DNAc (DNA
complementario), donde se requiere una
alta pureza e integridad o para aislar RNA
de tejido con altos niveles de RNAsa
endógenasa, como en el páncreas.
Cromatografía por exclusión de
tamaño
Esta técnica se fundamenta en la
separación de ácidos nucleicos de acuerdo
con su peso molecular, empelando una
columna empaquetada con una matriz de
gel conformada por partículas poliméricas
orgánicas o de sílice; ambos materiales
estables y con un contenido bajo un grupo
iónico, originan una red de poros
hidrofílicos uniformes. Las moléculas de
gran tamaño no penetrarán en los poros de
polímero, por lo que migran más
rápidamente que la de menor tamaño que
sí son capaces de penetrar la en la matriz.
Cromatografía de intercambio
iónico
Empleada comúnmente para la separación
de proteínas, se ha convertido en un
método alterno que permite la
concentración y purificación de DNA de
calidad, de manera rápida y con la misma
eficacia que la extracción por gradientes
de CsCl. Los ácidos nucleicos interactúan
con las resinas de carga positiva de la
columna de intercambio iónico, por lo que
el ácido nucleico cargado negativamente
se retiene y permite que otras moléculas,
como proteínas o lípidos, se eluyan
primero, dejando los ácidos nucleicos
retenidos en la columna, los cuales se
eluirán empelando condiciones que
rompan su enlace con los compuestos
iónicos de la resina purificados.
Cromatografía de absorción
Los ácidos nucleicos en solución se fijan
de forma selectiva en sílice o vidrio, en
presencia de sales caotrópicas, mientras
que proteínas, metabolitos y otro
contaminante se elimina mediante lavado.
Después de ello, los ácidos nucleicos se
recuperan con una solución hiposalina.
La importancia de la calidad del ácido
extraído es crucial para el uso posterior en
técnicas moleculares, por lo que el
personal que realice estos procedimientos
debe estar capacitado para observar las
buenas prácticas de laboratorio, condición
indispensable para obtener una cantidad y
una calidad adecuada de DNA o RNA.
Articulo
La extracción de DNA es un requisito
previo importante para la mayoría de los
estudios biológicos y sigue siendo objeto
de una amplia investigación. Según
algunos estudios, el DNA muestra cierto
grado de capacidad de adsorción en papel
de filtro fabricado con materiales
adsorbentes de fibra vegetal. Este estudio
demuestra la estrecha correlación entre la
cristalinidad y la higroscopicidad en
adsorbentes a base de fibra vegetal
utilizados para la extracción de DNA y
propone por primera vez el concepto de
adsorción de DNA en adsorbentes a base
de fibra vegetal.
Comenzando con la selección de varios
tipos de adsorbentes basados en fibras
vegetales conectadas a tierra, continuamos
con la extracción de nuevos adsorbentes
basados en fibras vegetales, papel de
bambú y algodón desengrasado, y
logramos aumentar su eficiencia de
extracción de DNA a 4,2 veces más que la
de los enfoques actuales. Se seleccionaron
nanodrop, electroforesis y PCR para
demostrar la cantidad, calidad, integridad
y utilidad del DNA extraído. Además, se
estudiaron la cristalinidad, la
higroscopicidad, la distribución del
tamaño de los poros y la composición de
los adsorbentes a base de fibras vegetales
para explorar su correlación en un intento
por comprender el principio subyacente a
este tipo particular de adsorción. Los
hallazgos de este estudio pueden
extenderse aún más a la extracción de otros
tipos de ácidos nucleicos con propiedades
bioquímicas similares.
Electroforesis
El uso de electroforesis es una gran técnica
dentro de las técnicas moleculares, por lo
que supone una parte importante del
procedimiento sistemático del análisis de
los ácidos nucleicos y las proteínas. Casi
todas las biomoléculas poseen carga
eléctrica cuya magnitud depende del pH
del medio donde se encuentran dichas
biomoléculas; por ende, pueden
desplazarse cuando se ven sometidas a un
campo eléctrico hacia el polo de carga
contraria al de la molécula. Al contrario de
las proteínas que pueden poseer tanto
carga negativa como positiva, los ácidos
nucleicos solo poseen carga negativa, por
su estructura de fosfato. Por lo que, en una
electroforesis, los ácidos nucleicos se
dirigirán al polo positivo (ánodo).
El principio de la electroforesis consiste en
el desplazamiento proporcional de las
moléculas a través de un gel u otro tipo de
matriz porosa, según su peso molecular o
tamaño.
Elementos necesarios para una
electroforesis
Para poder realizar una electroforesis es
necesario el uno de elementos que se
describirán a continuación.
Cámara de electroforesis
La cámara de electroforesis es un
dispositivo que permite la generación de
un campo electrónico alrededor de un gel
donde se deposita la muestra. Este campo
se genera dentro de una solución
amortiguadora en la que se encuentra
sumergido en el gel que contiene las
muestras; el alto contenido de electrolitos
permite la transmisión de la corriente
eléctrica. La cámara cuenta con dos polos
que se conectan a una fuente de energía.
En las cámaras de electroforesis vertical el
polo positivo se encuentra en la parte
inferior de la cámara y en la horizontal en
uno de los extremos, en ambas cámaras el
polo positivo se distingue con el color rojo
y el negativo con el negro.
Gel
La muestra debe colocarse sobre un medio
de soporte para evitar perturbaciones
mecánicas durante la separación. El
soporte ideal es un gel semisólido o
gelatinoso, compuesto por polímeros que
forman una especie de malla o microporos
tridimensionales por donde avanzarán las
moléculas, según su peso molecular, lo
que permite la separación por tamaño de
los diferentes componentes de la muestra.
Para la separación de ácidos nucleicos se
usan geles de agarosa o acrilamida y para
proteínas, solo es utilizado el gel de
acrilamida.
Geles de agarosa
La agarosa es un polisacárido extraído de
algas marinas que tiene la propiedad de
mantenerse en estado sólido a temperatura
ambiente y se disuelve fácilmente en
temperatura de 50°C a 60°C, se torna
líquida y se solidifica cuando se enfría
formando un gel muy poroso. Para la
elaboración del gel es necesario pesar la
cantidad de agarosa requerida, se disuelve relajada. Esto refleja tres bandas de
en una solución amortiguadora adecuada tamaño diferente, aunque se trate del
de la misma composición y concentración mismo plásmido. Por eso en la
que el buffer de corrimiento y se calienta electroforesis es importante la
hasta formar una solución. Sin dejar de linearización y la eliminación de estructura
enfriar se vacía inmediatamente sobre un secundaria por desnaturalización de la
molde de forma rectangular y en uno de los muestra. La concentración de agarosa más
extremos se coloca un aditamento en utilizada para la electroforesis de ácidos
forma de peino con la finalidad de generar nucleicos es de 0.5% a 2%.
orificios donde se colocarán las muestras.
Geles de acrilamida
La agarosa posee ventajas sobre la
La acrilamida es un polímero sintético,
acrilamida, ya que este al ser extraído de
termoestable, incoloro y químicamente
algas marinas no es un compuesto tóxico y
inerte, con lo que se pueden generar geles
permite el análisis de ácidos nucleicos con
con un amplio intervalo de tamaños de
pesos moleculares variados, según la
poro. El gel de poliacrilamida es el
concentración de agarosa que se utilice.
resultado de la polimerización química de
No obstante, su poder de resolución es
una mezcla de acrilamida y bisacrilamida.
menor que el de los geles de poliacrilamida.
El tamaño de poro de un gel de acrilamida
La concentración de agarosa se escoge
está determinado por la concentración total
según el tamaño del ácido nucleico que se
de acrilamida presente, que generalmente
vaya a analizar. El tamaño de los poros de
se maneja en proporción de 19:1.
la matriz dependerá de la concentración de
Regulando la concentración de ambas y su
agarosa utilizada, y la concentración de
proporción se consiguen distintas
agarosa en inversamente proporcional al
porosidades, siempre menores que la de
tamaño del poro obtenido; a mayor
los geles de agarosa. Cuando la acrilamida
concentración, menor el tamaño de los
se encuentra en una disolución acuosa
poros, y viceversa, si los poros son
experimenta autopolimerización de forma
pequeños la migración del ácido nucleico
espontánea y lenta, con el resultado de que
(lineal, es este caso) será más lenta.
las moléculas de acrilamida se unen
Durante la electroforesis, los ácidos
cabeza con cola. En presencia de un
nucleicos con un peso molecular alto
sistema generador de radicales libres se da
migran al ánodo más lentamente que los de
una polimerización vinílica en la cual se
peso menor. En el caso de ácidos nucleicos
activan los monómeros de acrilamida,
no linealizados, como plásmidos
quedan en estado de radical libre y
circulares, RNA con estructura secundaria
reaccionan velozmente para formar
o DNA de gran longitud, la migración no
polímeros de carga lenta. El polímero en
sólo depende del peso molecular si no
disolución no forma un gel, sino que se
también del grado de empaquetamiento
encuentra en estado viscoso debido a que
que presenta la muestra. En la
las cadenas pueden deslizarse unas sobre
electroforesis de un plásmido, se
otras; la formación del gel requiere que
visualizan tres conformaciones distintas de
varias cadenas queden trabadas. A
la misma molécula: la forma
diferencia del gel de agarosa, la acrilamida
superenrollada, la semirelajada y una
es una neuro toxina por lo que debe
manejarse con extremo cuidado. También
es indispensable mantenerla en un lugar
refrigerado, seco y oscuro para reducir la
autopolimerización y la hidrolisis. La
bisacrilamida, o N, N, - metilenbisacrimida,
está compuesta por dos moléculas de
poliacrilamida enlazadas por sus grupos
aminos, no reactivos. Este compuesto
polimeriza juntamente con la acrilamida y
establece puentes entre las cadenas
lineales de poliacrilamida, con lo que se
evita su deslizamiento y conduce a la
formación del gel.
El gel de acrilamida es capaz de soportar
mayores voltajes que la agarosa y es
susceptible de teñirse por varios
procedimientos, y también puede
desteñirse en caso necesario. Los geles de
acrilamida pueden digerirse para extraer
fracciones separadas o desecados para su
exposición radiográfica y registro
permanente. La electroforesis con estos
geles se realiza en cámaras verticales, La
electroforesis de proteínas emplea geles de
acrilamida de dos capas de gel a diferente
concentración de acrilamida, un gel
superior o concentrado y un gel inferior de
separación o de resolución.
Buffer de corrimiento
El buffer de corrimiento es de la misma
composición y pH que el buffer con el que
se prepara el gel de resolución, ya sea de
agarosa o acrilamida. Éste proporciona el
medio para la transmisión de la corriente
eléctrica y mantiene el pH sin variaciones
mientras se realiza el corrimiento en el
caso de los ácidos nucleicos, pueden
emplearse TBE o TAE como buffer de
corrimiento. El buffer TBE contine Tris
base, ácido bórico y EDTA, y se maneja a
un pH de 7.2. El buffer TAE contine Tris
base, ácido acético y EDTA ajustado a un
pH de 8.5.
Marcador de peso molecular
Son moléculas de DNA o de proteínas que
permiten determinar por comparación el
tamaño de los fragmentos de ácidos
nucleicos o proteínas contenidos en la
muestra sometida a electroforesis. Los
marcadores de peso molecular se
encuentran disponibles comerciales en una
amplia aridad. En caso de los marcadores
de peso molecular de ácidos nucleicos,
estos pueden ser fagos o plásmidos
sometidos a corte con enzimas de
restricción que generan fragmentos con
incrementos de tamaño. Los marcadores
de peso molecular de proteína suelen ser
una serie de proteínas de peso molecular
conocidos, las cuales pueden estar teñidas
o coloreadas. En los casos en que la
electroforesis sea un paso previo para la
técnica de Wertern blot, también se
dispone de marcadores de peso molecular
de proteínas recombinantes que contienen
un sitio de unión a inmunoglobulina.
Buffer de carga
Tiene como fin brindar peso, densidad y
color a la muestra, lo que facilita su
depósito en el pocillo y evita su salida del
gel; también permite monitorear el
corrimiento de la muestra en el gel. Se
emplea en relación 1:3 para ácidos
nucleicos o 1:6 para proteínas, respecto a
la cantidad de muestra. El buffer de carga
de ácidos nucleicos contiene Tris, azul de
bromofenol, azul de xileno y glicerol.
Mientras que el buffer de carga de
proteínas contine Tris-HCl, pH 6.8
ditiotritiol (DTT), SDS, glicerol y azul de
bromofenol.
Transiluminador ultravioleta
El Transiluminador transite luz de espectro
ultravioleta a través de la muestra,
excitando la muestra cromogénica que
emite energía fluorescente que permite
visualizarla. El Transiluminador es el
sistema empleado con más frecuencia por
ser simple y efectivo. En general emiten
energía a una longitud de onda a 302nm,
aunque también existen para 254 y 365nm;
y suele contar con un botón para baja/alta
intensidad por si se requiere una menor
exposición de la muestra a la luz
ultravioleta. Algunos también permiten la
selección de entre dos longitudes de onda,
lo que los hace más flexibles. Una vez que
se tienen los materiales necesarios existen
dos maneras de realizar la electroforesis,
horizontal y vertical.
Electroforesis horizontal
Se lleva a cabo con gel de agarosa para
ácidos nucleicos. Para el corrimiento el
buffer debe cubrir el gel, con la finalidad
de evitar que se seque por el calentamiento
inducido por el paso de la corriente
eléctrica. Al momento de cargar las
muestras en los pocillos, se puede optar
por hacerlo en seco; consiste en llenar
parcialmente la cámara con líquido de
corrimiento de tal manera que la parte
superior del gel no se cubra de buffer para
que los pocillos puedan llenarse sin
interferencia del líquido. Una vez cargada
la muestra, se pone a correr por uno
minutos a bajo voltaje hasta que la muestra
entre en el gel y entonces se cubre del todo
con el buffer de corrimiento.
Electroforesis vertical
Empleada exclusivamente con el gel de
poliacrilamida, se utiliza para ácidos
nucleicos y proteínas pequeñas. El gel
debe de estar entre dos placas
rectangulares de vidrio donde la corriente
eléctrica se genera gracias al buffer en el
que se encuentra embebido el gel y se llena
las cubetas o compartimientos del ánodo y
el cátodo.
Procedimiento general para
una electroforesis
1. Preparar un gel de agarosa o
acrilamida a la concentración
requerida.
2. Mezclar las muestras a analizar con un
buffer de carga adecuado.
3. Cargar las muestras en el gel.
4. Realizar la corrida electroforética al
voltaje pertinente.
5. Visualizar los ácidos nucleicos.
Electroforesis de ácidos nucleicos
Método más común para la electroforesis
de DNA es elaborar un gel horizontal de
agarosa, con una concentración de 0.5% a
2%. La carca eléctrica de la molécula de
DNA la otorgan sus grupos fosfatos, de
carga negativa, y cuyo número es igual al
doble del número de pareas de bases.
Debido a que la forma de la molécula de
DNA siempre es la misma, lo único que de
lo que dependerá la movilidad de los
ácidos nucleicos será la longitud del DNA
y se representará en bandas. El corrimiento
se realiza a voltajes de entre 25 y 100 V; a
mayor voltaje mayor velocidad de
corrimiento, Si los fragmentos de DNA
son pequeños o bien requiere discernir
entre fragmentos de ácidos nucleicos con
una diferencia de longitud de 1 a 20 pb, es
recomendable utilizar un gel de
poliacrilamida que permita esa resolución.
Las agarosas con un punto de fusión bajo
permiten la preparación de geles a
elevadas concentraciones y se aconseja
para obtener una buena separación de
moléculas de DNA con <1000 pb. Son
idóneos para preparar geles analíticos de
productos procedentes de técnicas de
reacción en cadena de la polimerasa (PCR).
Algunas son capaces de separar
fragmentos que difieren entre 10 y 20 pb.
Para la preparación del gel debe
estandarizarse primero que la
concentración de agarosa es la más
adecuada, según la muestra que se desee
separar.
El volumen de agarosa depende del
tamaño de la cámara de electroforesis; 20
a 25 ml son suficientes para las
dimensiones más comunes. La agarosa
tarda en solidificar 20 minutos, mientras
que la poliacrilamida, alrededor de 30
minutos. Una vez solidificado el gel se
añade el buffer de corrimiento a
concentración 1x, cubriendo
perfectamente el gel y se retiran los peines.
Debe considerarse el uso de un marcador
de peso molecular en uno de los carriles,
para la determinación del peso molecular
de la muestra.
Una vez depositadas las muestras en el
pocillo se procede a la transmisión de la
corriente eléctrica. Se conectan los cables
de la fuente de energía de cada polo
eléctrico a la cámara de electroforesis en el
electrodo que le corresponda y se aplica un
voltaje de acuerdo con el peso molecular
de las moléculas de DNA que se separarán.
Para el producto de PCR se recomienda
usar voltajes de entre 75 y 100 V; para
muestras de DNA genómico y plasmídico
es recomendable entre 25 y 75 V.
Durante el corrimiento se monitorea la
migración de la muestra con colores que
contiene el buffer de carga, donde se
observa el color azul y el verde
correspondiente a los colorantes azul de
bromofenol y azul de xileno.
Existen múltiples factores que pueden
afectar la migración del DNA, como la
concentración del gel utilizado y el tamaño
de la molécula de DNA muestra, el
empaquetamiento del DNA, el voltaje, la
temperatura del buffer de corrimiento, la
contaminación con agentes intercalaste en
la muestra, la composición del buffer del
corrimiento, etc.
Visualización de las muestras
Para poder visualizar las muestras se
utilizan colorantes fluorescentes, el
bromuro de etidio, que tiene la propiedad
de intercalarse entre las bases nitrogenadas
del DNA y RNA. Por esta propiedad es un
agente mutagénico y debe manipularse con
cuidado, por lo general, se incorpora a la
agarosa antes de permitir la solidificación,
o puede agregarse luego del corrimiento a
0.5mg/ml. El bromuro de etidio es de un
color naranja fluorescente cuando es
expuesta a la luz ultravioleta. La señal
fluorescente es proporciona a la cantidad
de producto. Su sensibilidad permite
detectar aproximadamente 30 pg de ácido
nucleico por banda. El bromuro de etidio
es teratogénico, mutagénico y cancerígeno,
por lo que para este procedimiento es
necesario el uso de guantes. Para los geles
de acrilamida una alternativa es el nitrato
de plata.
Electroforesis de proteínas
Es el método más empleado para
electroforesis de proteínas a cabo de un
sistema discontinuo; es decir, un gel
conformado por dos geles de
poliacrilamida, que difieren en su
concentración, composición y pH. Los
geles están unidos pero limitados por una
fase de separación visible a contraluz; para
lograrlo deben prepararse por separado
esperando la polimerización total del
primero, para continuar con la del segundo;
de lo contrario, en estado líquido se
mezclarían.
Es importante recordar que en el caso de
los geles de acrilamida para ácidos
nucleicos solo se tiene una fase constituida
por el gel de resolución, donde las
moléculas de DNA migraran generando un
patrón electroforético, según su tamaño.
Para la electroforesis de proteínas, la
acrilamida se prepara a partir de una
solución al 30% de acrilamida-
bisacrilamida 19:1. Esta se mezcla con el
buffer correspondiente y una solución de
SDS; además, se añade persulfato de
amonio (APS) y N, N, N, N, N-
tetrametiletileenodiamina (TEMED) como
polimerizadores en concentraciones del
orden de 1 a 10 mM.
El gel de acrilamida se forma entre dos
vidrios, y el sistema completo se sumerge
en el buffer de corrimiento dentro de la
cámara vertical de electroforesis.
Para la preparación de la muestra de
proteína se realiza una reacción
fisicoquímica, en la que se rompe el enlace
peptídico y puestes de disulfuro por acción
de detergentes iónicos, reactivos
reductores y temperaturas elevadas, que
finalizan con la desnaturalización de la
proteína hasta su estructura primaria. La
muestra mezclada con el buffer de carga se
deposita con cuidado en los pocillos,
evitando la contaminación del pocillo
contiguo. Se necesita considerar el uso de
un marcador estándar de proteínas para la
medición del peso molecular de la muestra.
Una vez colocadas las muestras de
proteínas en cada pocillo de gel, se
conectan los cables correspondientes de
los electrodos a la fuente de energía, con la
selección de voltaje o amperaje adecuado.
Para el cálculo del voltaje es importante
conocer la distancia en centímetros del gel
desde la parte superior hasta la parte
inferior. La electroforesis se realiza hasta
que el colorante, visualizado como una
línea azul, haya llegado a los límites de la
parte inferir del gel.
Visualización de las muestras
Si es necesario, el gel se sumerge en un
recipiente que contiene colorante azul
brillante de Coomasie y se incuba por unos
minutos, lo que permitirá la visualización
de las bandas de proteínas. El proceso de
la coloración se basa en la atracción
electrostática del enlace peptídico de las
proteínas sobre grupos de ácidos sulfónico,
que tiñe la proteína de color azul. Después
de este proceso se lava y se procede a la
incubación en frio (4°C) en cloruro de
plata al 0.1%; posteriormente, se lava e
incuba con carbonato de sodio al 2% en
formalina al 0.04%, que actúa como
revelador. Finalmente, se incuba con
soluciones de ácido acético antes de
fotografiar o escanear.
Algunas veces, el gel se seca para
conservarlo. Para ello primero se
deshidrata en glicerol-metanol y,
posteriormente, se coloca una lámina de
celofán hidrofílico y no plastificado que
cubra totalmente el gel. Se cubre el gel con
un segundo celofán remojado en agua y se
sella con calor. Es aquí donde se deja secar
en condiciones ambientales por alrededor
de dos días, también se puede acelerar el
proceso con el uso de desecadores de geles.
Algunas proteínas pueden migrar
anormalmente y aparecer con un peso
molecular mayor que el esperado; esto
puede deberse a que presentan
modificaciones postraduccionales en su
estructura. Así mismo, si existe
desnaturalización de las proteínas, se
considera que la proteína está degradada y
suelen aparecer manchas difusas es todo el
carril.
Aplicaciones de la electroforesis
Algunos de los usos de la electroforesis
para ácidos nucleicos en geles de agarosa
son determinar el tamaño molecular de los
ácidos nucleicos, analizar fragmentos
cortados con enzimas de restricción,
comparar los tamaños de distintos tipos de
DNA, aislar y recuperar fragmentos de
DNA purificados para clonaciones
moleculares, y analizar productos de PCR.
A su vez la electroforesis puede ser un
proceso previo a las técnicas de
hibridación como Southern blot (DNA) o
el Northern blot (RNA), donde la
presencia de determinada secuencia del
ácido nucleico es una mezcla de moléculas
se distinguen por su tamaño, la cual se
conforma por hibridación con una sonda
específica. Hablando de proteínas, la
electroforesis se aplica para la
identificación de fracciones proteicas o
proteínas particulares por tamaño, como es
el caso de la electroforesis de globulinas, o
proteínas séricas.
Articulo
La electroforesis diagonal es un método
relativamente simple para analizar la
formación de disulfuro de proteínas
mediante electroforesis secuencial no
reductora/reductora. Las proteínas que no
forman disulfuros se someten a una
electroforesis en dos dimensiones,
formando una diagonal a lo largo de la
segunda dimensión, por encima de la cual
se ubican las proteínas que contienen
disulfuros de cadena, y las proteínas que
forman disulfuros se ubican debajo de la
diagonal. Por lo tanto, este método puede
detectar e identificar disulfuros de
proteínas.
Enzimas de restricción
Son una herramienta primordial para la
ejecución de diversos ensayos útiles en
investigación clínica, desde la
determinación de polimorfismos de
longitud de fragmentos de restricción
(RFLP), así como la construcción de
vectores de DNA recombinante y
clonación de secuencias de DNA
provenientes de humano, virus o bacterias
y demás macroorganismos de interés para
la generación de conocimiento o para su
aplicación en el área de la medicina. Entre
las enzimas que modifican los ácidos
nucleicos se encuentran las nucleasas,
enzimas capaces de cortar los enlaces
fosfodiéster que unen los nucleótidos de
una cadena de ácidos nucleicos. Las
nucleasas son consideradas endonucleasas
si son capaces de cortar enlaces
fosfodiéster en nucleótidos localizados
dentro de la cadena de ácidos nucleicos, y
reciben el nombre de exonucleasas si
cortan los enlaces fosfodiéster de los
nucleótidos en os extremos de las cadenas.
Las enzimas de restricción presentan
actividades endonucleasa, son de origen
bacteriano y cortan los enlaces de
fosfodiéster de DNA en una secuencia
especifica denominada secuencia diana. El
uso de estas enzimas como herramientas
biotecnológicas surgió de la necesidad de
cortar las largas cadenas de DNA
genómico para manipularse y analizarse en
fragmentos más pequeños. El uso de las
enzimas de restricción y otras enzimas que
modifican ácidos nucleicos como la ligasa,
permitió el desarrollo de la metodología
del DNA recombinante.
Origen de las enzimas de
restricción
Las endonucleasas de restricción forman
parte de la maquinaria con la cuenta de la
bacteria para defenderse de infecciones
virales. El DNA de la bacteria que produce
la enzima de restricción no se ve afectado
por su propia enzima, debido a que las
bacterias metilan determinadas secuencias
a si propio DNA ciertas secuencias a su
propio DNA para diferenciarlo del DNA
viral por medio de una enzima
metiltransferasa en bases específicas, que
generalmente son las reconocidas por sus
propias enzimas de restricción.
Nomenclatura
Por acuerdo internacional la nomenclatura
de las enzimas de restricción se asigna por su
origen bacteriano y se define basándose en
las siguientes reglas:
1. Tres letras en cursiva que
corresponden al nombre de la bacteria
de donde fue atraída (p. ej.,
Escherichia coli (Eco); Haemophilus
influenzae (Hin)). La primera letra, en
mayúscula, corresponde al género; las
otras dos, a la especie.
2. La cepa o estirpe, si la hubiese (p. ej.,
EcoR, aislada de la cepa “RY13” de
E. coli).
3. En números romanos, un número para
distinguir si hay más de una
endonucleasa aislada de esa misma
especie (p. ej., EcoRI, EcoRV).
4. Todas deberían de indicar con una
“R” por restricción o una “M” por
metilasa, según la función de la
enzima, pero generalmente se omite.
Clasificación de enzimas de
restricción
De acuerdo con su función las enzimas de
restricción son clasificadas en tipo, I, II,
III.
Tipo I
Las enzimas que pertenecen a este grupo
reconocen una secuencia especifica de
nucleótidos y hacer un corte aleatorio en la
doble cadena en cualquier secuencia del
DNA y a una distancia aproximada de
1000 pb del sitio de corte, también tiene la
función de metilar su propio genoma.
Estas enzimas necesitan ATO para
moverse a lo largo de la molécula de DNA
desde el lugar de reconocimiento hasta el
sitio de corte.
Tipo II
Son enzimas que reconocen secuencias
específicas y hacen cortes de la doble
cadena de DNA en el mismo sitio de
reconocimiento. Estas enzimas sólo tienen
actividades de restricción no de metilación
y son utilizadas en ingeniería genética, por
que cortan el DNA en secuencias
especificas reconocidas. Requieren Mg2+
como cofactor y no requieren de DNA. Las
secuencias de reconocimiento de estas
enzimas son palindrómicas, esto quiere
decir, que se leen igual en las dos cadenas
de DNA.
Tipo III
Estas enzimas reconocen una secuencia
específica y cortan el DNA fuera de la
secuencia diana. Tiene, al igual del tipo I,
actividad de metilasa y la necesidad de
ATP para desplazarse a lo largo de la
molécula de DNA.
Aplicaciones de las enzimas de
restricción
Las enzimas de restricción son una
herramienta básica en clonación e
ingeniería genética; se utilizan, entre otros
fines, realizar mapas de restricción de
plásmido o genomas. Estos mapas se
definen como la serie de fragmentos que se
generan por el corte con determinadas
enzimas, específicos en tamaño (y
secuencia) y que permiten emplearlos para
la caracterización de dicho DNA. Esta
herramienta es sumamente importante
para la clonación de polimorfismos, como
la técnica de RFLP, según se presente o no
el sitio del corte de una enzima de
restricción, se puede establecer la variante
alélica, ya que el peso molecular del
fragmento o fragmentos de DNA
generados permitirá la caracterización de
la secuencia. Así mismo, la construcción
de moléculas de DNA recombinante
implica el obvio empleo de las enzimas de
restricción ara definir y delimitar las
secuencias que se insertarán en el
constructo recombinante. Esto permite un
manejo adecuado sin el riesgo de
degradación manipulación para la
construcción de bibliotecas genómicas,
que se discuten en el capítulo de vectores
de clonación.
Tipos de cortes producidos por
las enzimas de restricción
Los cortes que realizan las enzimas de
restricción sobre la cadena de DNA
pueden generar dos estructuras o formas:
cohesivas o romas. Los cortes cohesivos,
también llamados pegajosos, se generan
porque la enzima corta en cada cadena de
DNA entre nucleótidos localizados en
posiciones diferentes respecto al eje de la
secuencia de diana.
Estos cortes generan extremos
monocatenarios en un segmento de 3 a 5
bases de longitud, por lo que en esta
fracción la falta de cadena complementaria
facilita su interacción con otro fragmento
en monocadena con secuencia
complementaria. Los extremos generados
proporcionan la unión especifica entre
segmentos de diferentes de DNA, pero
cortados por la misma enzima. Los
extremos romos se generan porque la
enzima corta en ambas cadenas de DNA
sobre un mismo eje, por lo que dichos
extremos son de doble cadena, y la unión
entre fragmentos de DNA con extremos
romos es más inespecíficas, ya que no
depende de la complementariedad de
regiones monocadena.
Isoesquizómeros
Se denomina isoesquizómeros a las
enzimas de restricción obtenidas de
diferentes especies bacteriana pero que
reconocen la misma secuencia de diana de
DNA y cortan entre diferentes nucleótidos
de dicha secuencia.
Familias de enzimas de
restricción
Una familia de enzimas de restricción está
formada por aquella que no
necesariamente reconocen la misma
secuencia diana, pero produce extremos
cohesivos similares y extremos cohesivos
idénticos. Estas características favorecen
que dos fragmentos cortados con estas
enzimas pueden recombinarse de manera
específica gracias a la complementariedad
de sus bases en los extremos cohesivos
generados.
Factores que afectan la
actividad de las enzimas de
restricción
Entre los factores que más afectan la
actividad de las enzimas de restricción se
encuentran:
• La pureza biológica del DNA.
Contaminación de la muestra con otros
DNA impiden el buen funcionamiento
de las enzimas.
• Los contaminantes como detergentes y
estabilizadores, ya que
concentraciones elevadas de sales y
detergentes inhiben la actividad
enzimática.
• Modificaciones en el pH y temperatura
de incubación. Variaciones leves en
estos parámetros inhiben
enormemente la actividad de las
enzimas.
• El grado de metilación del DNA, ya
que algunas enzimas son inhibidas por
metilación en ciertas secuencias.
Condiciones de
almacenamiento y
conservación de las enzimas de
restricción
Las enzimas de restricción, al igual que
muchas otras proteínas, pueden disminuir
su vida media y en consecuencia su
actividad, al ser conservadas y manejadas
de forma inadecuada fuera el rango idóneo
de temperatura. Para usarlas se requiere un
contenedor que asegure la menor variación
de temperatura posible.
Selección de la enzima de
restricción adecuad
Todos los organismos poseen un mapa de
restricción que indica la posición donde se
encuentran los sitios de corte para muchas
de las enzimas conocidas. Cuando se
quiere realizar el corte en un plásmido
conocido o comercial, por ejemplo, se
revisa el mapa de restricción, el cual ofrece
un listado en orden alfabético de las
enzimas que son capaces de cortar dicho
DNA, el tipo, sitio, el número y el tamaño
de corte de cada fragmento generado. En
el caso del DNA genómico es necesario
conocer la secuencia completa con la que
se va a trabajar para conocer los sitios de
corte. Se realiza ingresando dicha
secuencia a una base de datos
especializada para estudios de restricción
y, de esta manera, se obtiene un listado de
las posibles enzimas que reconocen la
secuencia de diana. Se selecciona la
enzima tomando en cuenta las
características experimentales ajustándose
al objetivo de interés.
Eficiencia en el uso de las
enzimas de restricción
Las hojas de instrucciones o insertos
proporcionados por el proveedor
contienen las características y la
descripción de las condiciones óptimas de
actividad de las enzimas de restricción
disponibles comercialmente. Estas
condiciones se ajustan al volumen de
reacción requerido según la tecnología a
utilizar. Se debe tener en cuenta la
temperatura óptima de exposición, la
presentación comercial de la enzima
(unidades de enzima por microlitro), el
tiempo de incubación y la posible
necesidad de aditivos como albúmina,
ATP, etc.
Cantidad de enzimas adecuada
para un ensayo
La cantidad de enzimas utilizada en una
reacción dependerá de la concentración de
DNA en la muestra a digerir. La
concentración de las enzimas descritas en
la hija de instrucciones del proveedor. Una
unidad de enzima se define como la
cantidad de enzima requerida para
producir la digestión completa de un
microgramo de DNA sustrato en 60
minutos a la temperatura óptima de acción
de la enzima. El tiempo de incubación de
la reacción puede ser el incrementado si la
enzima utilizada está cerca de su fecha de
caducidad, No obstante, el tiempo no debe
aumentarse demasiado, ya que, aunque el
DNA es una molécula resistente, se corre
el riesgo de su degradación.
Articulo
Recientemente, se han desarrollado
muchos métodos diferentes de genotipdo
de polimorfismo de nucleótido único
(SNP). Sin embargo, la mayoría de ellos
son caros. El genotipado de SNP
utilizando enzimas de restricción es un
método rentable. Sin embargo, la
extracción de enzimas de restricción de
SNP en secuencias genómicas sigue
siendo un desafío para los investigadores
sin experiencia en genómica y
bioinformática. El desarrollo futuro
incluirá un mayor refinamiento del
software PCR-RFLP para proporcionar
una mejor visualización y un entorno más
interactivo para el genotipado de SNP y la
integración del software con otras
herramientas utilizadas en los estudios de
asociación.
Vector de clonación y
expresión
Hasta la década de los 70’s, el DNA era
una molécula cuyo análisis era muy
problemático, por lo que era demasiado
larga y estaba conformada solo por cuatro
monómeros. En esa época la secuencia de
nucleótidos del DNA solo había podido
estudiarse indirectamente a través de la
secuencia de aminoácidos en la proteína o
por su expresión en el RNA. Es por eso por
lo que el descubrimiento de las enzimas de
restricción facilitó en gran medida el
estudio del DNA. Cada uno de los
fragmentos se analizada por separado y fue
posibles multiplicarlos a través de la
técnica de reacción en cadena de la
polimerasa (PCR). Gracias a la
especificidad del reconocimiento de las
secuencias que pueden ser cortadas por las
enzimas de restricción ha sido posible la
identificación, el aislamiento y la
clonación de fragmentos de DNA
originarios de diferentes organismos, para
producir moléculas de DNA recombinante.
Clonación
La clonación de DNA, o clonación
molecular, es la introducción de un
fragmento de DNA, llamado inserto, en
una molécula de DNA, llamada vector,
que puede replicarse de forma autónoma e
independiente del genoma de la célula
huésped. El resultado es la obtención de
millones de copias de una molécula
recombinante o clon molecular compuesto
por DNA del inserto y del vector. El
inserto puede ser DNA obtenido de
cualquier organismo y puede permanecer
como DNA genómico (DNAg), DNA
complementario (DNAc), producto de
retrotranscripción de RNA, producto de
PCR o RNA obtenido por transcripción in
vitro.
Vectores de clonación
Se define como una molécula de DNA de
doble cadena, con la capacidad de albergar
un fragmento de DNA exógeno.
Clasificación de vectores
De acuerdo con su uso, los vectores se
clasifican en vectores de clonación y
vectores de expresión.
Vectores de clonación
Los vectores que son de clonación se
consideran así, si su finalidad es el
almacenamiento de secuencias y la
obtención de grandes cantidades del DNA
insertado o de la molécula recombinante.
Estos vectores suelen ser plásmidos, fagos,
fagémidos, cósmidos y cromosomas
artificiales bacterianos o de levadura.
Vectores de expresión
Los vectores de expresión son aquellos
cuyo objetico es producir un transcrito
(RNA) o la proteína producto de ese
transcrito. Estos vectores pueden ser
plásmidos o fagos.
Elementos que forman un vector
de clonación
Todos los vectores de clonación poseen en
su estructura los siguientes elementos
básicos comunes:
a) Origen de replicación: es una
secuencia en el DNA del vector que
provee un sitio único de
reconocimiento a las proteínas que
identifican el sitio de inicio de la
replicación. Los plásmidos se
caracterizan por tener un solo sitio ORI
en su genoma.
b) Marcador de selección: es un gen que
por lo regular confiere resistencia a un
antibiótico o genera un fenotipo
particular con el cual puede
seleccionarse la célula que incorporó el
vector. Por lo habitual los marcadores
de selección son único en los vectores,
aunque existen algunos plásmidos que
tienen dos. También existen
marcadores que permiten que la célula
transformada emita fluorescencia
cuando se expones a la luz ultravioleta.
c) Sitio de clonación múltiple: es un
fragmento de DNA que contiene una
serie de sitios únicos de
reconocimiento para enzimas de
restricción, muy cercanos entre sí. Los
sitios de restricción más comunes
presentes en el sitio de clonación
múltiple de la mayoría de los vectores
con para las enzimas EcoRI, Hind III.
Plásmidos
Los plásmidos son pequeñas moléculas
circulares de DNA que se replican y
transfieren con independencia del
cromosoma bacteriano. De manera natural
constituye el material génico móvil de las
bacterias, donde funcionan como medio de
transporte de genes a otras bacterias.
Cuando una bacteria se produce, estos
plásmidos se transfieren a la célula
descendientes por distribución equitativa
del citoplasma bacteriano durante la
división celular.
Los plásmidos han sido manipulados
genéticamente en el laboratorio con el fin
de preservar solo las características
deseables, eliminar el DNA innecesario y
añadirle otras que no poseen forma natural.
Bacteriófagos
Son virus que infectan naturalmente
bacterias y se comportan como parásitos
intracelulares obligados que se multiplicas
haciendo uso de la maquinaria biosintética
de las bacterias. Al igual que los plásmidos,
los bacteriófagos se replican de forma
autónoma, portan información genética y
pueden conferirle a la bacteria nuevas
propiedades o desarrollarle procesos
patológicos.
Para poder convertirlo en un vector, el
bacteriófago silvestre es modificado
genéticamente. Estas modificaciones
consisten en la adición de sitios de
restricción específicos y la eliminación de
aquellos genes que no se requieren parala
la replicación, lo que permite la
incorporación de fragmentos de DNA de
mayor longitud que los plásmidos
Cósmidos
Ciertos estudios de análisis de DNA
genómico requieren de la clonación de
fragmentos de DNA grandes. En estos
casos es recomendable utilizar los
cósmidos ya que pueden aceptar insertos
de hasta 45kb.
Los cósmidos son vectores híbridos del
DNA de un plásmido, y los sitios cos del
bacteriófago. Los cósmidos derivados del
fago P1 pueden admitir 85 kb de DNA
exógenos. Además, contiene los genes de
selección y un sitio de ORI del plásmido,
por lo que se replica de manera
independiente del genoma bacteriano,
como lo hacen los plásmidos.
Cromosomas artificiales
Fragmentos de DNA de mayor tamaño
pueden clonarse en cromosomas
artificiales de bacterias (BAC) o levaduras
(YAC), que se replican como un
cromosoma independiente dentro de
bacterias o levaduras. Este tipo de vectores
son particularmente útiles para estudios de
mapeo de cromosomas, por su capacidad
de almacenar fragmentos de gran tamaño.
Un BAC es un constructo derivado del
plásmido, capaz de regular la distribución
equitativa de plásmidos después de la
división bacteriana.
Los YAC son cromosomas artificiales que
contienen telómeros, origen de replicación,
un centrómero de levadura y un marcador
de selección para su identificación en las
células que contengan.
Vectores de expresión
Los vectores de expresión se emplean con
dos finalidades: generar RNA producto de
la transcripción o bien producir la proteína
codificada en las secuencias génicas que
portan. Los vectores de expresión son
plásmidos o bien bacteriófagos.
Componentes de los vectores de
expresión
En su estructura los vectores de expresión
poseen los elementos básicos presentes en
los vectores de clonación, además de
contar en su secuencia con por lo menos un
promotor fuerte. Se caracterizan por
constituir un sistema, de inducción simple
y efectivo, tener una baja expresión basal
y ser fácilmente transferible a otras cepas.
También debe contener secuencias de
terminación de la transcripción y adición
de la cola de poliadenilación, ya que esto
protegerá la transcripción de la
degradación por nucleasas y, por lo tanto,
aumentará su vida media. Otro factor
importante presente en un vector de
expresión es el sitio de unión al ribosoma,
que es la secuencia Shine-DalgRNAo que
precede el codón de inicio AUG de la
traducción en los RNA procariotas.
Aplicaciones de la clonación
molecular
La clonación de genes tiene muchas
aplicaciones y es una de las principales
fuerzas impulsoras de la biotecnología y la
metodología del DNA recombinante. Este
método se puede utilizar para producir
proteínas eucariotas en bacterias
(proteínas recombinantes) como hormonas,
antibióticos, vacunas, crear cultivos
transgénicos resistentes a plagas o sequías,
producir animales transgénicos capaces de
producir proteínas recombinantes para
producir en su leche, etc. crear bibliotecas
de genomas, o bibliotecas de genes, que
han permitido la secuenciación completa
de los genomas de humanos y otros
organismos.
Genoteca
Una biblioteca genómica o genoteca
consiste en una colección de fragmentos
de DNA, provenientes del genoma de un
organismo, clonados en vectores para
facilitar su estudio.
Genotecas de DNAc
Las bibliotecas de DNAc se construyen a
partir de secuencias de RNAm utilizando
una reacción in vitro que sintetiza una
primera cadena de DNAc utilizando una
DNA polimerasa con actividad de
transcriptasa inversa. El mRNA no
copiado en cDNA se elimina añadiendo la
enzima RNase H. Una segunda hebra de
cDNA, complementaria a la
retrotranscripción resultante, se sintetiza
mediante una reacción de PCR (consulte el
capítulo Reacción en cadena de la
polimerasa) o mediante el uso de una
polimerasa de cDNA que utiliza una sola
hebra de cDNA como plantilla. Este
DNAc de doble cadena se clona luego en
un vector. Obtención de una biblioteca de
DNAc.
Genotecas de DNAg
Para crear bibliotecas de DNA, es
necesario aislar DNAg del organismo de
interés. Este DNAg se corta con enzimas
de restricción para generar fragmentos
cuyos extremos son complementarios a los
del vector de clonación. Una vez que se ha
construido la biblioteca, se seleccionan el
clon o los clones que portan el DNA que
contiene el gen de interés. Los métodos
más comunes para identificar clones
recombinantes en una biblioteca de genes
son la hibridación con una sonda marcada),
el uso de anticuerpos contra la proteína de
interés o la selección de clones en función
de la actividad biológica de la proteína.
Producción de proteínas
recombinantes
La clonación molecular ha hecho posible
determinar la función de múltiples
proteínas y producir proteínas
recombinantes, eliminando el gasto y la
dificultad de producir hormonas o
proteínas terapéuticamente necesarias que
antes estaban disponibles en pequeñas
cantidades debido a la falta de fuentes en
la fabricación de hormonas o proteínas
aisladas. o purificar. La precisión en la
fabricación de las proteínas recombinantes
ha revolucionado el dominio
biotecnológico, que presente es una lonja
déspota en el espacio de la biología
molecular y cubre más de 10% de toda la
habilidad farmacéutica. Para maximizar la
expresión de las proteínas se emplean
promotores fuertes que aseguren por arriba
de 10% del rotundo de las proteínas
celulares, no obstante, esto impone un
censo metabólico a las células bajando el
apresuramiento de su crecimiento, por lo
que ciertas proteínas recombinantes
pueden terminar tóxicas para las células
que las producen. También puede alterarse
la secuencia del gen de tenacidad
sustituyendo codones para los que hay
RNAt poco frecuentes y reemplazarlos por
aquellos que codifican para el mismo
aminoácido, ya que se usan más en el
cuerpo huésped. Asimismo, la fabricación
de proteínas recombinantes en flora
presenta el lucro de que su disponibilidad
es prácticamente ilimitada de biomasa, y
los costos de fabricación música bajos,
pues una ocasión pudiente la labor nunca
se requiere particular especializado, nunca
presenta inconvenientes de enrarecimiento
con patógenos animales, endotoxinas
bacterianas o secuencias de DNA
oncogénicas. Una ventaja adicional es que
las plantas permiten el almacenamiento
estable de la proteína recombinante en
semillas y tubérculos, lo que facilita su
conservación, transporte y distribución.
Esto permite el abaratamiento de costos
respecto a otros sistemas de producción.
La clonación molecular ha incrementado
las perspectivas iniciales de la
metodología del DNA recombinante y, de
cierta manera, sentó las bases para la
clonación de organismos e impulsó el
desarrollo de la biotecnología, que ha
tomado un papel protagónico en las
ciencias de la salud.
Articulo
Se ha analizado la posibilidad de utilizar
pRS4, un plásmido críptico de
Pediococcus pentosaceae, como vector de
clonación selectivo para bacterias del
ácido láctico. Los resultados obtenidos
mostraron que pRS4C1 es un vector de
clonación derivado de pRS4 que puede
transformar de forma estable Lactobacillus
plantarum, Pediococcus lactis y
Lactobacillus. pentosaceus, una bacteria
del ácido láctico utilizada como iniciador
en la industria alimentaria, pero no
transforma Enterococcus faecalis, una
bacteria del ácido láctico considerada
indeseable debido a su origen fecal normal.
Las modificaciones posteriores de
pRS4C1, incluidos los cambios en la
posición del marcador de resistencia al
cloranfenicol y/o mutaciones puntuales en
el codón de inicio del gen que codifica la
proteína de replicación, no corrigieron la
pérdida de expresión de pRS4 en E. coli.
faecalis, pero conserva la capacidad de
transformarse y expresarse de manera
estable en los Lactobacillus y Pediococcus
antes mencionados. Estos resultados
sugieren que pRS4 puede usarse como
vector de clonación selectivo para la
manipulación genética de bacterias ácido-
lácticas beneficiosas sin el riesgo de
transferencia horizontal de material
genético a ciertas bacterias ácido lácticas
indeseables que pueden existir en el
mismo alimento que el primero. .
Tipos de PCR y aplicaciones
La reacción en cadena de la polimerasa
(PCR) se considera una de las técnicas
más sensibles y específicas de las pruebas
moleculares. Esta técnica se basa en una
replicación exponencial in vitro de una
molécula de DNA genómico (DNAg) o
DNA complementario (DNAc), mediante
ciclos repetitivos, que constan de tres
temperaturas. En cada uno de los ciclos
las moléculas se duplican hasta que los
reactivos se agotan.
Características de la
amplificación in vitro y
requerimientos necesarios para
la PCR
La amplificación in vitro de la PCR se
apega a las mismas reglas de replicación;
esto es, se basa en una secuencia que le
sirve de molde, y por complementariedad,
sintetiza la cadena antiparalela. También,
la síntesis de la cadena sigue la dirección
5’-3’ ya que necesita de un nucleótido con
el extremo 3’ libre que proporcione el
grupo OH para la adición del siguiente
nucleótido, con lo que forma el enlace
fosfodiéster.
Para que se lleve a cabo el PCR se requiere
una cadena de DNAg o DNAc que sirve
del molde, una enzima DNA polimerasa,
cofactores necesarios para la actividad
correcta de la DNA polimerasa, para la
síntesis del producto de PCR y
oligonucleótidos o primers.
DNA polimerasa
En la actualidad, la Taq DNA polimerasa
es la enzima más empleada para la PCR;
tiene como función polimerizar una nueva
cadena de DNA tomando como molde otra
ya existente. Debido a que en cada ciclo de
la PCR se lleva la mezcla de reacción a
temperaturas de 95°C, se requiere de una
DNA polimerasa capaz de soportar dichas
temperaturas. Anteriormente, esta
necesidad se cubría agregando E. coli a
cada ciclo de la DNA polimerasa, que se
inactiva a 95 °C y debe reponerse después
de cada paso de desnaturalización (95 °C).
Sin embargo, el descubrimiento de una
bacteria que habita en géiseres que habita
en temperaturas cercanas al punto de
ebullición del agua ha permitido el
aislamiento de la polimerasa Taq de la
bacteria Thermophilus aquaticus. Con ello,
la técnica pudo hacerse más eficiente, pues
dicha enzima soporta los 95°C, y la
cantidad inicial de enzima añadida a la
reacción es suficiente como para
suplementar los 25 a 40 ciclos de
amplificación. La concentración de Taq
polimerasa que se recomienda es de 1 a 2.5
U/reacción de PCR, y su tasa de error en la
incorporación de bases es de 4 × 10-4. Esta
enzima es capaz de polimerizar un
promedio de 1000 nt/minuto.
DNA molde
Para la PCR teóricamente se requiere de
una sola molécula, cuya secuencia sirva de
molde para la amplificación, ya sea de
DNA o de DNAg. El DNA se puede
obtener de cualquier muestra biológica, y
la mayoría de las técnicas de extracción de
ácidos nucleicos proveen de moléculas de
calidad adecuada para realizar la PCR Si
se quiere amplificar RNA, antes de la PCR
se requiere realizar una reacción previa: La
retrotranscripción, que permite convertir
RNA a DNAc, menos lábil que una cadena
de RNA. Las técnicas actuales empleadas
en la PCR permiten realizar la
amplificación a partir de 300ng de DNA
genómico, o bien desde 25 a 100 ng en el
caso de DNAc o DNA proveniente de
genes clonados en vectores. Es necesario
resaltar que en el caso de la amplificación
de DNAc obtenido por retrotranscripción a
partir de RNA durante los primeros ciclos
de la PCR se realiza la síntesis de la cadena
complementaria de DNAc, lo que
permitirá la amplificación de la secuencia
cono DNA de doble cadena (DNAds) en
los ciclos posteriores de la PCR
Desoxinucleótidos
Para que la polimerasa realice su función
necesita que existan Desoxinucleótidos en
la mezcla de la reacción para poder
sintetizar la nueva hebra de DNA, los
desoxinucleótidos libres, cuando no forma
hebra de ácidos nucleicos, se encuentran
en forma trifosfatada, estructura molecular
necesaria para su estabilidad. Los
desoxinucleótidos trifosfatados deben
adicionarse en una concentración optima
entre 50 y 200 μM, cantidades mayores de
200 μM pueden producir incorporaciones
erróneas, mientras que concentraciones
menores a 50 μM se consideran
insuficientes para la síntesis adecuada.
Amortiguadores
Las soluciones amortiguadoras
proporcionan el pH y concentraciones de
sales adecuadas para la correcta función de
la DNA polimerasa. Este buffer se maneja
un pH de 8.4 y está compuesto por Tris-
HCl y KCl.
Cloruro de magnesio
El cloruro de magnesio actúa como
cofactor de la DNA polimerasa y
suplementa a una concentración entre 1.0
y 2.5 mM. Esta concentración debe
optimizarse de manera experimental para
cadena PCR, porque un exceso de
magnesio reduce una amplificación
inespecífica de productos de PCR.
Iniciadores
El diseño adecuado de los iniciadores de la
DNA polimerasa es la clave para el éxito
de una PCR. Estos oligonucleótidos, se
pueden utilizar para reconocer por
complementariedad secuencias blanco del
DNA molde junto con la ayuda de
secuencias específicas. En la PCR
convencional, su utiliza un par de
indicadores para delimitar los extremos del
producto que se desea amplificar. Su
función radica en proporcionar un extremo
3’ libre el que se han de añadir los
nucleótidos consecutivos mediante
enlaces fosfodiéster, debido a que la DNA
polimerasa necesita iniciar la síntesis
partiendo de un 3’OH preexistente. Los
iniciadores reciben el nombre de sentido y
antisentido, según la secuencia a la que da
origen. El iniciador sentido es
complementario y antiparalelo a la cadena
3’-5’, por otro el primer antisentido es
complementario y antiparalelo a la cadena
5’-3’ por lo que polimerización originará
la cadena 3’-5’. En la PCR la
concentración óptima de los iniciadores es
de 0.3 a 1 μM/reacción, ya que un exceso
favorecería la formación de dímeros entre
dos primers parcialmente
complementarios, o bien de estructuras
secundarias por complementariedad
parcial de un primer con el mismo.
Diseño de iniciadores y su papel en la
especialidad de la PCR
Los iniciadores definen el tamaño del
fragmento que se ha de ampliar. El tamaño
de los productos a ampliar se encuentra
entre 100 y 1000 pb, aunque se
recomienda que sea de entre 200 a 500 pb.
En el caso de que se desee analizar la
expresión de un RNAm convertido en
DNAc, los primers se diseñan de tal
manera que uno de estos hibride en una
secuencia exónica y el otro
oligonucleótido lo haga en otra secuencia
exónica; de este modo, la amplificación
del producto del tamaño esperado asegura
que solo los RNAm se han amplificado, si
existe el caso de que una secuencia de
DNAg se haya amplificado, el producto
será de tamaño diferente.
La secuencia de los iniciadores debe ser
altamente específica para el gen de interés
y procurar un contenido de nucleótidos G-
C de 40 a 60% y una longitud óptima entre
los 18 y 30 nt. Así mismo debe evitarse un
diseño que permita la complementariedad
o la formación de estructuras secundaria
inter e intra-primers, sobre todo cuando
estas estructuras se encuentran el extremo
3, indispensablemente para la adición de
nucleótido.
La secuencia y la longitud de los
iniciadores es determinada por su
temperatura de fusión (Tm), la cual defina
como aquella a la que el 50% de los
iniciadores se encuentra en estructura de
cadena lineal. Se procura un diseño tal que
la Tm de ambos primer sea muy similar y
no presente más de 5°C de diferencia con
la Tm del producto que se va a amplificar,
lo que garantiza temperaturas de
alineamiento similares para ambos primers
y eficiencia de amplificación adecuada. La
Tm aumenta según la longitud del
iniciador, por lo que un iniciador por
debajo de las 18 nt hibridaría de forma
inesperada en la cadena molde y originaría
productos inespecíficos. Por otro lado, los
iniciadores extremadamente largos
requieren de Tm superiores a 65°C. Existe
una variedad de métodos para la
determinación la Tm de los iniciadores,
pero todas tomadas en consideración el
contenido de nucleótidos, sobre todo G y
C, la longitud del primer y la
concentración de Na+ en el tubo de PCR.
Hoy en día, muchos programas
computacionales permiten el diseño
semiautomatizado de los primer, tomando
en cuenta los parámetros antes
mencionados. Una vez diseñado los
oligonucleótidos deben verificarse contra
alineaciones inespecíficas en las mismas
secuencias blanco o bien en otras
secuencias, empleando el programa
BLAST. Este software coteja una posible
hibridación, total o parcial, con algunas
secuencias reportadas en el Gene Bank que
pudiera interferir con la especificidad de
los primers y su empleo correcto. En caso
de hibridación con otras secuencias
reportadas en el bando de genes su diseño
debe replantearse.
Esquema de la PCR
1. Inicio de la desnaturalización
2. Ciclos de amplificación
• Temperatura de desnaturalización
• Temperatura de alineación
• Temperatura de extensión
3. Amplificación final
4. Almacenamiento temporal
Termociclador
Es el equipo en el cual se realiza la PCR.
Tiene la capacidad de cambiar la
temperatura de la muestra en cuestión de
segundos, lo que generalmente se logra
mediante calentamiento/ enfriamiento por
resistencia eléctrica de una placa metálica,
que distribuye la temperatura de manera
homogénea durante tiempos programados
en el rango de segundos a minutos.
Normalmente los rangos de temperatura
que abarca el equipo van de 4 a 96°C.
Debido a que las PCR que se incuban son
soluciones acuosas, los equipos cuentan
con una placa metálica a modo de tapa, la
cual se mantiene a 103°C para evitar la
condensación del agua en las tapas de los
tubos donde ocurre la reacción. Por lo que,
se evita que la concentración de los solutos
se modifique, lo que alteraría las
condiciones óptimas para la DNA
polimerasa y la termodinámica de
hibridación de los primers. Para el
enfriamiento se generan flujos de aire frío,
lo que permite descensos de temperatura
relativamente rápidos.
Inicio de la desnaturalización
Se necesita una temperatura de 95°C para
que la doble cadena de DNA se
desnaturalice, hablando del DNA
genómico, o el rompimiento de estructuras
secundarias, en el DNAc. Esta temperatura
se mantiene por cinco minutos al inicio de
la PCR.
Ciclos de amplificación
Un ciclo normal de PCR convencional está
constituido de las tres temperaturas
siguientes:
• 95°C: desnaturalización por unos 30
segundos.
• 55 a 60°C: alineación por 30 a 40
segundos.
• 72°C extensión, según la longitud del
producto que se va a amplificar,
considerando la adición de 1000
nucleótidos en 60 segundos.
El ciclo de temperatura se repite
continuamente por 30 a 35 ocasiones.
Cada temperatura cumple con una función
específica.
Desnaturalización
Se realiza a 95°C y tiene como finalidad
desnaturalizar la doble cadena de DNA y/o
destruir las estructuras secundarias del
DNA, lo que permite el acceso de los
primers a la cadena molde en sus
secuencias complementarias. Esta
temperatura se mantiene por 30 segundos.
Alineación
En esta fase, la temperatura se encuentra
en un rango entre 55°C y 60°C, en el cual
la mayoría de los iniciadores hibridan, lo
que genera energía cinética necesaria para
que los iniciadores busquen en las cadenas
de DNA su secuencia complementaria y
formen los puentes de hidrógeno con la
cadena molde, dejando el extremo 3’OH
disponible y listo para la adición de los
nucleótidos consecutivos por la DNA
polimerasa.
Extensión
Se produce a la temperatura óptima para el
funcionamiento de la DNA polimerasa
empleada, por lo que dependerá ésta para
la PCR. En el caso de la Taq polimerasa,
la más utilizada es de 72°C.
Amplificación final
Una vez finalizados los ciclos designados
para la PCR, la temperatura de extensión
se mantiene por cinco minutos, lo que
permite que la polimerasa termine la
extensión de los productos a los cuales se
encuentra unida.
Almacenamiento temporal
Durante la programación de los ciclos de
la PCR se programa también un ciclo final
de 4°C por varias horas, lo que permite
conservar los productos de PCR hasta que
se retiren los tubos de reacción del equipo.
Cantidad del producto por PCR
Teóricamente, en cada uno de los ciclos de
amplificación se duplica la cantidad de
producto inicial. Así, el producto de PCR
aumenta exponencialmente conforme al
número de ciclos de PCR (n). Sin embargo,
el producto de PCR depende del número
inicial de copias del molde de DNA (T),
por lo que se aplica la fórmula que indica
que si se parte del doble de moléculas
iniciales de DNA se obtendrá el doble de
producto:
P = (2)nT
Sensibilidad de la técnica de
PCR
La PCR es una técnica sumamente
sensible y específica, al alcance de la
mayoría de los laboratorios de biología
molecular. Bajo las condiciones y diseño
de oligonucleótidos apropiados se puede
obtener una sensibilidad y una
especificidad de 100%. No obstante, en
experimentación es difícil obtener estos
resultados, ya que múltiples factores
influyen de manera crucial en el desarrollo
de una PCR, como la selección de un
sistema adecuado de detección del
producto amplificado, el diseño correcto
de primers y sondas, la calidad de la
muestra que se va a amplificar, el control
de los inhibidores de la reacción, la
contaminación ambiental, la
contaminación con otros productos de
PCR, la optimización de las condiciones
de reacción, la concentración de reactivos,
el termociclador empleado, etc. El control
y el manejo correcto de cada uno de estos
factores influirán en la calidad de la PCR.
Esta sensibilidad es su principal
característica y desventaja: una PCR puede
proporcionar un diagnóstico temprano,
pues tan sólo con pocas copias del genoma
de un patógeno puede determinarse su
presencia. Sin embargo, esta misma
característica hace que la realización de
una PCR sea una tarea para el especialista
y que siempre deba tenerse cuidado de
evitar un acarreamiento de material que
pueda contaminar la reacción y producir
falsos positivos.
Modalidades de la técnica de
PCR
Esta técnica ha evolucionado desde su
invención. Hoy en día, gracias a los
múltiples sistemas de detección, a
variantes en los iniciadores y a la cantidad
de pares de primers empleada se dispone
de diversas variantes de la técnica, que se
enlistan a continuación:
PCR convencional
Se basas en la detección del producto de
amplificación mediante una electroforesis
en gel de agarosa o acrilamida. El producto
es visualizado por una banda. La
intensidad de la banda se considera
proporcional a la cantidad de producto
amplificado y su longitud se verifica
interpolando contra un marcador de peso
molecular comercial de longitudes
conocidas. El análisis de imagen de la
banda del producto de PCR permite medir
su intensidad mediante software y realizar
una medición semicuantitativa de las
bandas de los productos de PCR obtenidos
en diversas muestras. La
semicuantificación puede ser respecto a
cualquiera de las muestras contenidas en el
gel.
PCR semicuantitativa
Permite saber los niveles de expresión de
un gen (RNAm) en particular, y normaliza
los niveles encontrados de este gen con los
encontrados en un gen de expresión
constitutiva, que se expresa de manera
constante en la célula. Al realizar una
relación entre la expresión del gen de
interés con la expresión del gen
constitutivo el índice que se obtenga
indicará la expresión real del gen de interés
y se reporta como porcentaje de expresión.
Esto permite su comparación con otras
muestras analizadas de la misma manera.
PCR cuantitativa
El producto de PCR es cuantificable, lo
que permite reportar en números
absolutos la cantidad de un
microorganismo o del RNAm de un gen
en una muestra. Para la cuantificación
absoluta se amplifica al mismo tiempo
una curva con muestras de concentración
conocida del DNA que se quiere analizar.
Los resultados de las muestras se
traslapan a los valores de la curva y de
esta manera se conoce la concentración de
la muestra.
PCR múltiple
En este tipo de PCR se realiza la
amplificación de más de un fragmento de
DNA en una sola reacción de PCR con dos
o más juegos de primers. Tiene la ventaja
de que ahorra tiempo y reactivos, pero
presenta el inconveniente de que el diseño
de los primers debe ser adecuado para que
no se complementen entre ellos
(hibridaciones inespecíficas). Esta técnica
se utiliza para el análisis simultáneo de
múltiples marcadores moleculares
asociados a alguna enfermedad, para la
detección simultánea de varios agentes
patógenos, organismos genéticamente
modificados, etcétera.
PCR selectiva
Para esta PCR diseñan primers capaces de
hibridar solamente en secuencias con
presencia de una mutación, por lo que, en
caso de estar ausente, no se produce un
producto de PCR. Como control se
produce una PCR con primers diseñados
para la amplificación de la forma silvestre
del gen, cuyos resultados deben coincidir
con los obtenidos con los primers que
amplifican la mutación. En caso de
homocigatos sólo una de las dos
reacciones debe resultar positiva, en el
caso de heterocigenos ambas reacciones
resultan positivas.
PCR in situ
Se realiza en una muestra de tejido
embebida en parafina o congelada y
cortada en criostato. No requiere
extracción del DNA del tejido. En la
laminilla se añaden los reactivos
necesarios para la PCR y se colocan en un
termociclador especial. Esta modalidad de
PCR permite saber qué tipo celular
presente en un tejido expresa un
determinado gen o cuál célula está
infectada por un patógeno.
PCR anidada
Esta variante de la PCR convencional
proporciona mayor sensibilidad a la
técnica, al amplificar las secuencias de
DNA en dos rondas de amplificación con
distintos pares de iniciadores o primers en
cada una. primero se realiza una PCR con
un par de iniciadores externos para
amplificar una región de DNA extensa,
que contiene el segmento diana que se
desea amplificar. Después, este producto
de amplificación sirve de molde para una
segunda PCR con otro par de iniciadores
internos para amplificar una región más
pequeña. Por lo tanto, la longitud del
producto de amplificación de la segunda
PCR, o PCR anidada, será menor que la
del primer producto de PCR.
PCR en punto final
El producto de PCR se analiza después de
25 a 35 ciclos en el punto previo a la
saturación de la reacción, mediante un gel
de electroforesis. Presenta la desventaja de
que diferente cantidad de material de
inicio da lugar a una cantidad diferente de
producto al final, además de que diferente
cantidad de material de inicio da lugar a la
misma cantidad de producto al final, de la
reacción, también presenta las desventajas
de que depende de la resolución del gel de
agarosa, que suele ser baja y no permite
detectar pequeños cambios en la
concentración
PCR en tiempo real
Las desventajas que presenta la PCR fue lo
que llevo a los investigadores a diseñar una
tecnología que solventara estos
inconvenientes conocida como PCR en
tiempo real. La reacción de amplificación
es la misma, lo que cambian es el método
de detección del producto amplificado y su
temporalidad. La detección de las copias
del producto de PCR, un láser que detecta
fluorocromos acoplados a los primer o a
una sonda de hibrida en medio de los
primers, que se degradan y libera su
fluorocromo por la acción exonucleasa 3’-
5’ de la polimerasa. Por medio de la
detección de la fluorescencia liberada
durante la reacción de amplificación puede
medirse la cantidad de DNA sintetizado en
cada momento, ya que la emisión de
fluorescencia producida en la reacción es
proporcional a la cantidad de producto de
PCR formado. Esto permite conocer y
registrar en todo momento la cinética de la
reacción de amplificación. Cabe destacar
que para la técnica de PCR en tiempo real
la temperatura de alineación y extensión es
la misma, por lo que ambos pasos se
unifican. Los sistemas de detección por
fluorescencia empleados en la PCR en
tiempo real pueden ser iniciadores
marcados por fluoróforos, sondas
específicas marcadas con fluorocromos) o
bien agentes intercalaste fluorescentes,
como SyberGreen o SyberSafe.
Retrotranscripción como paso
previo a la PCR
Retrotranscripción se define como una
reacción para la conversión del RNA en
DNAc y en general se lleva a cabo antes de
una PCR, cuando se pretende analizar
secuencias de RNA. La realización
consecutiva de una retrotranscripción y
una PCR se conoce como RT-PCR. Es una
variante de la PCR convencional, su
objetico es el de amplificar el RNA
específico para evaluar su expresión o
presencia. Esta técnica es más sensible y
rápida que otras técnicas de análisis de la
expresión de genes (Northen blot, Dot blot,
Slot blot, ensayos de la nucleasa) y se basa
en el uso de transcriptasa inversa de los
retrovirus cuya función es sintetizar DNA
a partir de RNA. En la reacción
retrotranscripción una cadena de RNA se
transcribe a DNA de secuencia
complementaria al RNA, por lo que se le
denomina DNAc. Para la reacción se
requiere también un inhibidor de RNAsas,
un componente enzimático que impide la
acción de estas enzimas que puedan estar
presentes en la muestra. A diferencia de la
PCR es esta reacción no son necesarios los
ciclos y basta con una hora a la
temperatura óptima en la enzima para
realizar la conversión de RNA a DNAc.
Los pasos de que consta esta reacción son
desnaturalización del RNA a 70°C por 10
minutos para eliminar estructuras
secundarias, alineación de los hexámeros
por 10 min a 25°C y polimerización por la
retrotranscriptasa a 37°C por una hora.
Una vez obtenida la cadena de DNAc, ésta
se emplea como molde para la técnica de
PCR. Esta técnica se utiliza
principalmente para detectar genomas
virales compuestos por RNA, así como
para cuantificar RNAm de cualquier
proteína expresada en un tejido.
Aplicaciones de la PCR
Los productos de PCR pueden utilizarse
para la secuenciación, detección de
patógenos infecciosos, amplificación de
segmentos para su análisis mediante en
medicina forense, detección de mutaciones,
análisis de la expresión génica o
determinación de carga viral, entre otras
muchas aplicaciones.
Diagnóstico como aplicación de
la PCR
Económicamente disponible para la
mayoría de los laboratorios, la PCR se ha
convertido en un método indispensable de
diagnóstico médico en los últimos 20 años.
Se puede usar para amplificar segmentos
que contienen una mutación conocida o
mutaciones desconocidas que se
secuencian e identifican después de la
PCR. Esto fue muy útil para diagnosticar y
correlacionar variaciones genéticas con
enfermedades. En enfermedades
adquiridas, la detección de genomas de
patógenos es la aplicación diagnóstica más
extendida de la PCR. Debido a su alta
sensibilidad, es posible detectar incluso
múltiples copias del genoma, lo que suele
ocurrir en las primeras etapas de la
infección; Por lo tanto, la PCR permite un
diagnóstico precoz.
Articulo
Los polimorfismos de un solo nucleótido
(SNP) y las mutaciones de un solo
nucleótido son causados por una
sustitución de una sola base. Los SNP o las
mutaciones pueden estar asociados con la
susceptibilidad a la enfermedad, la
patogénesis de la enfermedad y la eficacia
de fármacos específicos. La detección de
SNP o mutaciones es clínicamente
relevante. Los métodos de
detección/detección de SNP o mutaciones
deben ser muy específicos y sensibles. En
este sentido, la reacción en cadena de la
polimerasa (PCR) proporciona el
rendimiento analítico necesario para
muchos análisis moleculares. Los métodos
de detección de SNP/mutación basados en
PCR se dividen en general en dos tipos: (1)
análisis polimórfico o alelo mutante
específico que utiliza cebadores
emparejados con nucleótidos sustituidos o
el uso de oligonucleótidos para bloquear o
fijar la orientación sin plantilla, y (2)
derritiéndose análisis de curvas
combinado con métodos de PCR en
tiempo real utilizando sondas de hidrólisis,
sondas de hibridación o colorantes
fluorescentes de unión a ADN de doble
cadena. Los métodos nuevos e
innovadores, así como las mejoras
tecnológicas, han hecho que los métodos
de detección de mutaciones o SNP sean
cada vez más sofisticados. Estos avances
incluyen la preparación de ADN/ARN y
los pasos posteriores de amplificación, así
como la miniaturización de los
instrumentos de PCR para que la prueba se
pueda realizar con relativa facilidad en el
laboratorio clínico o como una prueba de
punto de atención en un entorno clínico.
Secuenciación del DNA y
microarreglos
A pesar del papel tan importante que
realiza la secuencia de DNA en la materia
vida, el desarrollo de los métodos para su
determinación es prácticamente muy
reciente, debió al gran tamaño de las
moléculas de DNA en cada célula. Estos
métodos solo requieren una pequeña
cantidad del DNA, son altamente
confiables y han revolucionada la biología
molecular.
Secuencia
Método química o degradación de
Maxam Y Gilbert
Es un método de secuenciación que
depende de la degradación química
específica del DNA que describieron
Maxam y Gilbert, en 1977. Tiene la
ventaja de que puede emplear DNA de
doble hebra, pero requiere una separación
de hebras o fraccionamiento equivalente
por cada fragmento de restricción
estudiado, lo cual lo hace laborioso. El
método está limitado por el poder de
resolución del gel de poliacrilamida que,
en el contexto histórico de la época,
permitía secuenciar aproximadamente 100
bases a partir del punto de marcaje. La
electroforesis es una técnica para la
separación de moléculas según su
movilidad en un campo eléctrico a través
de una matriz porosa, la cual finalmente
las separa por tamaños moleculares y
carga eléctrica, según la técnica que se use.
La electroforesis en gel en general se
utiliza con propósitos analíticos, pero
puede ser una técnica preparativa para
purificar parcialmente moléculas antes de
aplicar espectrometría de masas, PCR,
clonación o secuenciación de DNA. Antes
del tratamiento químico que genera el
corte, se marca un fragmento de doble
hebra producido por digestión con una
enzima de restricción de una determinada
longitud en sus dos extremos; primero, se
trata con fosfatasa alcalina para eliminar el
fosfato terminal en su extremo 5’, y
después, se añade un fosfato marcado con
32P para producir una hebra marcada de
forma terminal. La fragmentación
selectiva de una cadena de DNA marcada
se consigue con el uso de cuatro
tratamientos químicos independientes,
cada uno de los cuales está diseñado para
producir patrones específicos de rotura y
observación mediante autorradiografía El
procedimiento consiste en “atacar”
químicamente al DNA con reactivos que
primero dañan y después eliminan una
base del nucleótido. La desoxirribosa
expuesta es, entonces, un punto débil en el
esqueleto de la cadena y es susceptible de
roturas. Luego, se llevan a cabo reacciones
químicas para desprender completamente
la desoxirribosa de los enlaces 5’ y 3’ de
sus fosfatos, y la reacción es tan específica
que permite dañar sólo uno de los residuos
a lo largo de pocos pares de bases del DNA.
El reactivo específico para purinas es el
dimetilsulfato, mientras que el reactivo
para pirimidinas es la hidracina. Debido a
que el enlace glucosídico de una purina
metilada es inestable y se rompe
fácilmente, las bases pueden eliminarse
calentando las hebras a pH neutro, dejando
la desoxirribosa libre. El tratamiento que
de preferencia rompe residuos guanílicos
se basa en un álcali suave a 90°C (NaOH
0.1 M), que libera completamente los
restos de desoxirribosa despurinados de
los grupos fosfato adyacentes en sus
enlaces 3’ y 5’, o ácido fórmico para corte
en bases púricas indiferenciado (A + G),
mientras que para los residuos adenílicos
el tratamiento es a 0°C en condiciones
ligeramente ácidas (HCl 0.1 M). Cuando
los fragmentos marcados en su extremo se
resuelven en gel de poliacrilamida, la
autorradiografía contiene un patrón de
bandas oscuras y claras. Las bandas
oscuras se generan del rompimiento de
guaninas, que se metilan cinco veces más
rápido que las adeninas. Este patrón de
guanina/fuerte y adenina/ débil contiene,
al menos, la mitad de la información
necesaria para la secuenciación; sin
embargo, en la interpretación de estos
patrones puede haber ambigüedad, ya que
la evaluación de la intensidad de las
bandas aisladas no es sencilla. Para
determinar las bases de forma diferencial
se compara la información que contiene
esta columna del gel con una en paralelo
en la cual se suprime el rompimiento de
guaninas, lo que permite que las adeninas
se evidencien. La evidencia de corte de
adeninas se basa en que los enlaces
glucosúricos de las adenosinas metiladas
son menos estables que las de las
guanosinas, de manera tal que de
preferencia las adeninas se liberan con un
tratamiento suave con ácido diluido.
Subsecuentemente, el rompimiento con
álcali producirá un patrón de bandas
oscuras correspondiente a las adeninas y
con bandas claras para las guaninas. Para
el caso de detección de pirimidinas, la
reacción con hidracina producirá roturas
en posiciones ocupadas tanto por citosina
como por timina. La reacción se repite en
presencia de NaCl 2 M, la sal suprime la
reacción de la hidracina con la timina, tal
que en la autorradiografía sólo se detectan
fragmentos cortados mediante tratamiento
con piperidina en posiciones ocupadas por
citosinas. Cuando se comparan los
patrones autorradiográficos de C y C + T,
la banda oscura (correspondiente a la
marca del radioisótopo) que aparezca en
ambas radiografías indicará rotura en la C,
mientras que un enlace sólo presente en C
+ T representará la rotura en una T. Para
lograr el corte en citosinas y timinas, la
hidracina reacciona con timina y citosina,
cortando la base y dejando ribosilurea. La
hidracina puede reaccionar para producir
hidrazona. Después de una lisis de
hidracina parcial en solución acuosa de
hidracina 15 a 18 M a 20°C, el DNA se
corta con piperidina 0.5 M. La amina
cíclica secundaria, así como la base libre,
desplaza todo el producto de la reacción
con hidracina de la desoxirribosa y cataliza
la eliminación de β-fosfatos. El patrón
final contiene bandas de intensidad similar
para los cortes en citosinas y timinas.
Cuando se analiza el patrón
autorradiográfico de un gel de
secuenciación obtenido de los cuatro
tratamientos químicos, si se considera una
secuencia de carriles con A, G, C y C + T,
una banda fuerte en la primera columna
con una banda débil en la segunda genera
una A; una banda fuerte en la segunda
columna con una banda débil en la primera
columna es una G; una banda que aparezca
en la tercera y cuarta columnas es una C, y
una banda solamente en la cuarta columna
es una T. Para obtener la secuencia de una
hebra sencilla se comienza en la parte baja
izquierda y se lee hacia arriba; así, la
secuencia que se lee de abajo hacia arriba
es la correspondiente a 5’ → 3’ de la hebra
original de DNA analizada. La sencillez de
este método radica en que sólo se necesitan
cuatro radiografías para establecer la
secuencia de DNA. La secuenciación
química tiene ventajas específicas. En
primer lugar, los tratamientos químicos
son sencillos de controlar; el ataque
químico ideal, una base eliminada por
hebra, produce una buena distribución de
materiales marcados a través de la
secuencia. En segundo lugar, cada base es
atacada, tal que en un corrimiento se
desplegará cada base individual. La
distinción química entre cada base es clara
y la secuencia de ambas hebras permite un
chequeo más adecuado. Estas reacciones
específicas fueron elegidas para proveer
información más que suficiente para la
secuenciación. En principio, podría
secuenciarse DNA con tres reacciones
químicas específicas para cada base,
utilizando la ausencia de banda para
identificar la posición de la cuarta base; sin
embargo, las aproximaciones tienden a
error o a malinterpretarse por otra base,
por esa razón se describen las reacciones
para diferenciar que son redundantes. El
método de Maxam y Gilbert es óptimo
para DNA que no puede secuenciarse de
forma adecuada mediante otros métodos
(por ejemplo, oligonucleótidos pequeños y
secuencias de DNA que producen
terminación prematura debida
estructuras secundarias fuertes). Además,
la secuenciación de Maxam y Gilbert
puede usarse para mapear modificaciones
de DNA, como alquilaciones y roturas
producidas por carcinógenos,
antineoplásicos y otros agentes que tienen
como blanco el DNA. En ensayos de
huella digital química o enzimática, la
técnica permite la identificación precisa de
secuencias específicas de DNA que se
unen a moléculas pequeñas y proteínas.
Por ello, las mejoras al método son
benéficas para gran variedad de
aplicaciones en biología molecular y
bioquímica.
El método de “didesoxi” de
Sanger
Sanger también desarrolló otro método, el
cual emplea análogos de dNTP específicos
de terminación de cadena. Los análogos
más utilizados son los didesoxinucleótidos
trifosfatados (ddNTP), iguales que los
dNTP pero sin el grupo hidroxilo en el
carbono 3’ de la desoxirribosa. Estos
pueden incorporarse a una cadena de DNA
en crecimiento por medio de la DNA
polimerasa, pero actúan como
terminadores porque, una vez
incorporados a la cadena, y al no contar
con el OH en el extremo 3’, no permiten
que se una otro nucleótido. Este método es
más rápido y acertado que el método
químico de Maxam y Gilbert, por lo que es
el utilizado en la actualidad de manera
rutinaria en los laboratorios. El proceso
consiste en encontrar diferentes cadenas,
tantas como número de bases tenga el
fragmento que son copias de la cadena de
DNA que se va a secuenciar, cada uno de
un tamaño diferente y terminado con la
incorporación de un 2’ 3’
a didesoxinucleótido. El principio del
método “didesoxi” es el siguiente: se aísla
y se clona el DNA que se desea secuenciar;
este DNA se desnaturaliza y se emplea una
sola hebra en la secuenciación. En la
secuenciación se utiliza un iniciador o
primer marcado radiactivamente, el cual
usualmente es un fragmento de restricción,
que suministra el extremo 3’ OH que
necesita la DNA polimerasa para continuar
la adición de nucleótidos. El iniciador y el
molde de DNA se alinean para formar un
complejo iniciador-molde y la mezcla
resultante se divide en cuatro partes. Con
estas mezclas se preparan cuatro tubos de
reacción, cada uno con el DNA molde de
hebra sencilla que se desea secuenciar, la
DNA polimerasa, el iniciador marcado
radiactivamente y los cuatro dNTP. A cada
tubo se le añade uno de los ddNTP en
exceso, es decir, en mayor proporción
respecto a su dNTP convencional (10:1).
En cada uno de estos tubos se producirán
cadenas de DNA de distintas longitudes,
terminando todas en el lugar en el que se
incorporó el “didesoxi” correspondiente
(ddATP, ddTTP, ddGTP, ddCTP) añadido
al tubo. Por ejemplo, una muestra de DNA
se incuba con DNA polimerasa en
presencia de una mezcla de ddTTP
(didesoxitimidina fosfato) y con bajas
concentraciones de TTP junto con
concentraciones normales de los otros tres
dNTP (uno de los cuales puede marcarse
con 32P, 35S o con marcadores
quimioluminiscentes o fluorocromos).
Conforme la cadena de DNA se forma en
el extremo 3’ del iniciador, la posición de
T se estará agregando en algunos casos con
el sustrato normal y, por ende, la cadena
seguirá extendiéndose. En ocasiones se
agregará un ddTTP, lo que hará que acabe
la síntesis, tal que al término de la
incubación seguirá habiendo una mezcla
de cadenas de longitud variable con
terminación T en su extremo 3’, pero todas
con el mismo extremo 5’ (el extremo 5’
original del iniciador). Incubaciones
similares se llevan a cabo en presencia de
cada uno de los otros 3 ddNTP, lo que da
mezclas de terminación en la posición de
cada uno de los nucleótidos restantes C, A
o G, respectivamente. Las cuatro mezclas
son separadas en paralelo (cada mezcla de
reacción en un carril) por electroforesis
vertical en gel de poliacrilamida-urea en
condiciones desnaturalizantes (acrilamida
12% con urea 8 M), con resolución de un
solo nucleótido. Este sistema separa las
cadenas de DNA de acuerdo con su
longitud; así, las más pequeñas migrarán
más rápido y las más grandes, más lento.
En teoría, cada una de las fracciones de las
mezclas tendrá suficientes fragmentos
terminados en cada una de las posiciones
del nucleótido y podrán visualizarse
mediante autorradiografía cuando se
utiliza marcaje radiactivo, ya sea en el
iniciador o en alguno de los dNTP. El
tiempo de exposición de la placa de rayos
X sobre el gel varía de 20 a 30 horas y se
expone a temperatura ambiente. En la
actualidad, se emplean marcas
quimioluminiscentes (fluorescentes) para
evitar el manejo de radiactividad. En este
caso el marcaje es con fluorocromos en el
extremo 5’ del iniciador y la identificación
se hace separando los diferentes
fragmentos por medio de electroforesis en
gel de poliacrilamida, para que, de esta
manera, la secuencia pueda leerse
directamente sobre el gel, de acuerdo con
el patrón de bandas. En general,
secuencias de entre 15 a 200 nucleótidos
desde el sitio del iniciador pueden
determinarse con precisión mediante un
solo iniciador e inclusive es posible leer
hasta 300 nucleótidos. El problema más
grave es el apilamiento de bandas, causado
por las asas de apareamiento de bases que
se forman en el DNA en las condiciones de
la electroforesis del gel de acrilamida y
que se observan como un número de
bandas en la misma posición o
inusualmente muy cercanas unas a otras en
la electroforesis.
Método automatizado
Uno de los mayores avances en la
tecnología de secuenciación del ADN fue
el desarrollo de la secuenciación
automatizada, ya que, aunque los
procedimientos propuestos tanto por
Sanger como por Maxam y Gilbert son
relativamente sencillos y su interpretación
es fácil, su capacidad de resolución de los
procedimientos utilizados es limitada. El
método de Maxam y Gilbert fue muy
popular en sus inicios; sin embargo, con la
descripción del método enzimático
didesoxi, o de terminación de cadena, esta
técnica quedó en desuso, ya que involucra
el uso de sustancias químicas peligrosas y
cantidades elevadas de ADN marcado
radiactivamente, además de ser
técnicamente más complejo. Por ello, en la
actualidad los procedimientos de
secuenciación automatizada están basados
en el método enzimático de Sanger, que
suple el marcaje radiactivo con métodos
quimioluminiscentes con el uso de
fluorocromos. De esta manera, para la
lectura de la secuencia se utilizan sistemas
ópticos que detectan los diversos
fluorocromos empleados, con lo que se
logra un método más directo, fácil, rápido
y seguro. Esta variante es conocida como
dye-primer sequencing (secuenciación
mediante colorantes acoplados al
iniciador). Para evitar el error debido a lo
repetitivo y a los pasos de pipeteo, en la
actualidad un robot industrial puede
automatizar las reacciones de
secuenciación del método didesoxi. Este
sistema utiliza microreacciones a
temperatura controlada; en un ciclo de
reacción (alrededor de 50 minutos) se
procesan arriba de 48 moldes. Con este
robot se resuelven más de 450 bases en
secuenciación automática de ADN,
protocolo que es aplicable tanto a marcaje
radiactivo como fluorescente. En estos
sistemas automatizados el fragmento de
ADN fluorescente pasa por el punto de
tensión del secuenciador automático, y
estas señales se envían a una computadora
con un programa especial. Así, un golpe de
láser excita la tinción fluorescente, la señal
de fluorescencia emitida se digitaliza y es
captada por detectores que una
computadora analiza y descifra, y pueden
observarse los resultados obtenidos en
tiempo real. En minutos, este programa
procesa la imagen del gel capilar. Para
cada muestra secuenciada se crean curvas
de cuatro colores, uno por cada nucleótido,
y debajo de cada pico de la secuencia se
identifica la secuencia de nucleótidos
correspondientes al fragmento analizado.
Puede analizarse la secuencia de 10
muestras simultáneamente o bien estudiar
40 fragmentos de ADN. La secuenciación
por terminación fluorescente es un método
para el análisis de la secuencia del ADN
mediante automatización parcial. Es una
variante modificada en la cual el marcaje
se realiza con un fluoróforo unido de
forma covalente en el oligonucleótido
iniciador utilizado. En esta opción se
utiliza un color diferente para cada
fluoróforo de cada reacción específica para
nucleótidos A, C, G o T, marcándolos
como terminadores reversibles mediante la
unión del fluoróforo a la base en el grupo
3’-OH, de tal forma que la ADN
polimerasa aún la puede reconocer como
sustrato. Después, las mezclas de reacción
se combinan en una coelectroforesis en un
mismo gel, y la información de la
secuencia se lee directamente mediante
una computadora. Cuando el fluoróforo se
agrega en la terminación de la cadena, se
tiene la ventaja de que este último método
puede llevarse a cabo en una sola reacción
en lugar de en cuatro, como en el método
en que se marca el iniciador. En esta
reacción los ddNTP se marcan con
fluorocromos de diferente color para cada
base, con lo cual la terminación de cada
cadena determinará el color y, por ende, el
NTP respectivo. Esto hará que al
fluorescer a diferentes longitudes de onda,
el sistema óptico del equipo identifique
directamente en un gráfico las señales de
fluorescencia de cada una de las bases. El
gráfico generado es acorde con el color del
fluorocromo, en el cual se representa cada
base con picos de intensidad de luz. Las
investigaciones siguen progresando de tal
forma que se ha planteado la utilización de
la tecnología de espectrofotometría de
masas para secuenciar ADN. Otras
propuestas adaptan la técnica de Maxam y
Gilbert en una tecnología innovadora
denominada secuenciación multiplex, que
permite aumentar la velocidad de
secuenciación y faculta al investigador
para analizar un gran grupo de fragmentos
de ADN como una mezcla a través de los
pasos de secuenciación de ADN, lo cual
incrementa la eficiencia de los
procedimientos estándares por un factor de
10.
Secuencia de alto rendimiento
Desde el Proyecto Genoma Humano en
2008 se secuenció un genoma humano
completo en cinco meses con1.5 millones
de dólares; Las plataformas actuales
comparten características tecnológicas
comunes, como secuenciación masiva en
paralelo de moléculas únicas de ADN
separadas en un flujo de células o clonadas
in vitro, para lograr muchas copias de la
molécula original y después ser
amplificadas, con ciclos repetidos de
extensión de nucleótidos mediados por
polimerasas o por ligación de
oligonucleótidos. Como se trata de un
proceso masivo en paralelo, estos sistemas
pueden generar centenares de mega bases
(Mb) y giga bases (Gb) de secuencias
nucleotídicas en un solo corrimiento de un
aparato. El método para secuenciar con
este tipo de tecnología requiere preparar
una genoteca de ADN molde mediante
fragmentación por nebulización o
sonicación, los fragmentos se reparan en
sus extremos y ligados a oligonucleótidos;
después, la genoteca de ADN se diluye
hasta la concentración de molécula única;
luego se desnaturaliza e hibridada a una
microesfera que contiene oligonucleótidos
adaptadores consecuencias
complementarias, con las cuales se lleva a
cabo la PCR de emulsión; posteriormente,
se liberan los fragmentos y se someten a
enzimas e secuenciación mediante un flujo
sucesivo de los 4 dNTP Una ventaja
reconocida de la tecnología 454es la
amplia longitud de lectura de secuencias,
ya que puede leer fragmentos de más de
400 bases de longitud mediante el
principio depiro secuenciación y en el
tiempo de una sola corrida (10 horas) se
pueden secuenciar 500 Mb.
Microarreglos
La bioinformática es el campo de la
ciencia en la cual las tecnologías de la
información, las ciencias de la
computación y la biología se unen para
formar una sola disciplina. Este campo ha
sido indispensable para la interpretación
de la secuenciación de los genomas, ya que,
por la cantidad de nucleótidos, el gran
número de reacciones, el análisis del
sobrelapamiento y la coordinación de las
secuencias sólo pueden evaluarse de forma
adecuada gracias a los programas y a las
bases de datos que guardan toda la
información que se produce día a día. El
uso de la bioinformática desembocó en la
implementación de una nueva herramienta
de la biología molecular y la genómica
denominada microarreglos (microarrays).
Los microarreglos constituyen una
distribución ordenada de más de 10 mil
genes por cm2 en una pequeña superficie,
del tamaño de un portaobjetos, en el cual
pueden estudiarse simultáneamente
mediante hibridación y puede obtenerse
una interpretación instantánea de la
expresión de múltiples genes
(distinguibles unos de otros) en un solo
análisis. Para ello, es necesario contar con
un soporte o matriz sólida (membranas o
vidrio) donde se inmovilicen las sondas de
unos cuantos pares de bases de longitud,
para su exposición a la muestra que se
pretende analizar. El fundamento de la
técnica de microarreglos se basa en la
hibridación de ácidos nucleicos y su
detección por fluorescencia mediante
análisis de imagen, de tal manera que,
como en otras técnicas, sólo se obtendrá
señal fluorescente en los puntos (genes)
donde haya habido hibridación; la
intensidad de fluorescencia será
directamente proporcional al nivel de
expresión del gen. El uso de esta
tecnología para comprender enfermedades
complejas y personalizar la medicina ha
revolucionado la región. En la actualidad,
la aplicación se ha ampliado para incluir
áreas como la biología básica, la
investigación del cáncer, el diagnóstico de
enfermedades, las pautas de tratamiento y
la investigación de nuevos medicamentos.
Cuanto más perfecta sea esta tecnología,
más precisa, fiable y útil puede ser la
información para prevenir o predecir la
enfermedad o su progresión y para
combinar diagnóstico y tratamiento con
fármacos o tratamiento personalizado.
También se puede usar para encontrar
formas de vida en ambientes extremos o
más allá de la Tierra.
Articulo
En octubre de 2015 se llevó a cabo la
primera Conferencia ISSTE sobre
Medicina Genómica: Avances y
Perspectivas, donde se anunció la
adquisición de una nueva plataforma de
última generación para análisis de
genotipado y expresión génica para
estudios clínicos de genómica. Esta
revisión describe las características y usos
del dispositivo para que sea conocido en
toda la red del ISSSTE y pueda ser
utilizado de la mejor manera posible para
los pacientes.
CONCLUSIÓN
Para concluir con este manual, fue posible
visualizar las técnicas de biología
molecular que han sido desarrolladas con
el paso del tiempo de una manera más a
fondo, así como su uso y aplicaciones en
el área de la ciencia y la salud. Asimismo
su análisis permite profundizar en el
conocimiento de los mecanismos normales
y las alteraciones de los procesos celulares
que participan en el desarrollo de una
enfermedad.
Finalmente me gustaría expresar mi pensar,
al decir, es impresionante todos los
avances que se han realizado en estas
técnicas, que de cierto modo nos hacen la
vida mucho más sencilla, sin nosotros
percatarnos de ello.
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Tecnología de microarreglos

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