UNIVERSIDAD POLITÉCNICA SALESIANA

SEDE GIRÓN

CARRERA DE BIOTECNOLOGÍA

DESARROLLO DE UN SISTEMA DE APROVECHAMIENTO DE LA

SANGRE DE DRAGO Croton lechleri Müll. Arg. (fam. Euphorbiaceae) Y

FORMULACIÓN DE UN PRODUCTO COMERCIAL.

Tema caso práctico previo a la obtención del título de:

INGENIERO EN BIOTECNOLOGÍA DE LOS RRNN

AUTOR: LLULLUMA ANCHATUÑA LUIS ANDRES

TUTOR: MARCO FERNANDO CERNA CEVALLOS

Quito – Ecuador

1
 Contenido
Título:...............................................................................................................................................5
1 Problema:................................................................................................................................5
2 Justificación............................................................................................................................6
3 Objetivos..................................................................................................................................8
3.1 Objetivo General..............................................................................................................8
3.2 Objetivos Específicos.......................................................................................................8
4 MARCO TEÓRICO...............................................................................................................8
4.1 Descripción de Croton Lechleri.......................................................................................8
4.1.1 Taxonomía................................................................................................................8
4.1.2 Descripción botánica................................................................................................9
4.2 Nombres comunes............................................................................................................9
4.3 Distribución, nivel de conservación UICN....................................................................10
4.4 Fitoquímica.....................................................................................................................10
4.5 Usos Tradicionales.........................................................................................................14
4.6 Bioactividad de resina sangre de drago..........................................................................14
4.6.1 Actividad cicatrizante y anti ulcerosa....................................................................14
4.6.2 Actividad antimicrobiana.......................................................................................15
4.6.3 Actividad inmunomoduladora................................................................................15
4.6.4 Actividad antiinflamatoria......................................................................................16
5 Metodología...........................................................................................................................17
5.1 Identificación molecular.................................................................................................17
5.1.1 Recolección de la muestra......................................................................................17
5.1.2 Extracción de ADN................................................................................................18
5.1.3 Amplificación.........................................................................................................19
5.1.4 Secuenciación.........................................................................................................19
5.1.5 Obtención y selección de datos..............................................................................20
5.2 Microprogación in vitro de Croton lechleri................................................................20
5.2.1 Medios de cultivo...................................................................................................20
5.2.2 Selección de explante.............................................................................................20
5.2.3 Desinfección del explante......................................................................................20
5.2.4 Siembra de material vegetal...................................................................................21
5.3 Extracción y almacenamiento de resina de sangre de drago....................................22
5.3.1 Método convencional.............................................................................................22
5.3.2 Método de siringuero..............................................................................................22
5.4 Formulación de capsulas blandas...............................................................................23
5.4.1 Control de calidad..................................................................................................25

2
 6 Posibles resultados................................................................................................................26
6.1 Identificación molecular.................................................................................................26
6.2 Microprogación in vitro de Croton Lechleri..................................................................26
6.2.1 Desinfección de explante........................................................................................26
6.2.2 Introducción al medio de cultivo............................................................................26
6.2.3 Enraizamiento.........................................................................................................27
6.2.4 Aclimatación..........................................................................................................27
6.3 Diseño del Producto.......................................................................................................28
7 Presupuesto...........................................................................................................................29
7.1 Recolección de resina.....................................................................................................29
7.2 Materia prima.................................................................................................................29
7.3 Elaboración de capsulas blandas....................................................................................30
8 Cronograma de actividades.................................................................................................31
9 Bibliografía............................................................................................................................32

Índice de figuras

Figura 1. Esquema del procedimiento de Upjohn para capsulas blandas.....................................23

Figura 2. Etiqueta de producto......................................................................................................27

Índice de tablas

Tabla 1. Taxonomía Croton lechleri...............................................................................................8

Tabla 2. Compuestos principales presentes en resina de sangre de drago.....................................11
Tabla 3. Catequinas y proantocianidinas oligomericas identificadas en la sangre de drago de C.
lechleri...............................................................................................................................................12
Tabla 4. Primers utilizados en amplificación y secuenciación de la región ITS............................18
Tabla 5. Formula unitaria de capsulas blandas...............................................................................24
Tabla 6. Costos de extracción y recolección..................................................................................28
Tabla 7. Costo materia prima.........................................................................................................28
Tabla 8. Costos elaboración de capsula blanda..............................................................................29

3
 Título: Establecimiento de un protocolo de micro propagación in vitro de Croton

lechleri Mull. Arg para la obtención de resina a nivel industrial para uso en formulación

de una capsula blanda frente a afecciones del tubo digestivo

1 Problema:

En el ecuador un país con alta biodiversidad que a lo largo del tiempo se han logrado

descubrir nuevas alternativas tanto el área medicinal e industrial, mediante la

investigación como tan de la flora del país, lo menciona (Bordino, 2022), “El Ecuador es

considerada, según sus altos índices de biodiversidad un país mega diverso, lo que en su

territorio representa puntos calientes con altas concentraciones de biodiversidad siendo

estas la región biogeográfica Chocó y los Andes Tropicales; la riqueza de biodiversidad

que representa Ecuador, lo ha llevado a ser clasificado según el foro mundial para la

naturaleza como el octavo país a nivel mundial en cuanto a diversidad de especies, esto

debido a la pluralidad de ecosistemas que el país posee”. Destacando una especie de

angiosperma en particular como lo es Croton lechleri nativa de América del Sur, famosa

por su resina conocida como sangre de grado la cual ha sido objeto de investigación a lo

largo del tiempo y en la actualidad, “por las propiedades medicinales atribuidas al látex

en la cicatrización de heridas y en el tratamiento de afecciones estomacales como

ulceras” (Castillo & Dominguez , 2010).

La producción actual del resina procede de árboles de regeneración natural existentes

en los bosques secundarios de la amazonia y escasamente de árboles plantados, la mayor

producción de resina esta en relación directa al diámetro del árbol, sin embargo que a

mayor diámetro mayor tiempo de espera para la cosecha y recuperación de la inversión,

para lograr arboles con diámetros mayores a 40 o 50 cm, se requieren de periodos

4
 mayores a 20 años, por tal motivo muchos agricultores no se interesan en manejar la

especie (Castillo & Dominguez , 2010).

Debido a esta situación se ha implementado como una alternativa tecnológica la micro

propagación in vitro la cual es una herramienta de gran ayuda para la producción rápida

de plantas de interés económico para el hombre, las condiciones medio ambientales in

vitro como luz, temperatura, nutrientes, fitohormonas, favorecen en su desarrollo porque

son controlables y facilitan por ello el aprendizaje de los procesos biológicos

involucrados en el desarrollo de las plantas, actualmente ya existe evidencia científica de

micro propagación in vitro de Croton Lechleri

2 Justificación

A lo largo del tiempo se evidencia una preocupación por las especies vegetales de uso

medicinal y su conservación como tal de los recursos naturales. El uso terapéutico de

plantas medicinales como sustitutos de las medicinas farmacéuticas se aplica desde la

antigüedad para curar o aliviar las enfermedades, manteniendo esta alternativa

poblaciones de comunidades amazónicas como primer tratamiento con plantas

medicinales y que en la actualidad se ha visto que poblaciones urbanas también hacen el

uso de las mismas y sus subproductos, dada la demanda como tal y el crecimiento

poblacional se han establecido nuevas tecnologías aplicables para obtener productos en

menor tiempo, menor costo y mayor producción, una de ellas es el uso de la

biotecnología vegetal, la cual nos permite obtener especies vegetales a gran escala en

laboratorio y conseguir como tal la materia prima de las mismas; obtener la resina de

sangre de drago de manera tradicional demanda un gran periodo de tiempo y costo, por

lo tanto “dado el creciente interés del uso medicinal de diversas especies vegetales entre

5
 ellas Croton lechleri, su supervivencia se encuentra amenazada por lo que es imperativo

establecer metodologías de micro propagación in vitro que incrementen su número y

enfrente la creciente demanda del mercado, evitando el deterioro de su ecosistema

natural” (Jimenez, Mora, Rosete, & Cabrera, 2021).

De la especie de interés se han reportado constituyentes químicos como alcaloides,

fenoles, di terpenos y esteroides, a su vez reportes científicos indican que se han

realizado diversos ensayos biológicos para evaluar su actividad antimicrobiana,

antioxidante, antimutagénica, citotóxica, antiinflamatoria, inmunomoduladora y

cicatrizante (Lock & Rojas, 2004).

Para lo cual en la presente revisión bibliográfica se establecerá un protocolo de micro

propagación in vitro para Croton lechleri permitiendo obtener una resina a gran escala

para posterior formulación de capsulas blandas con fines terapéuticos

3 Objetivos

3.1 Objetivo General

Establecer un protocolo de micro propagación in vitro de Croton lechleri Mull. Arg

para la obtención de resina a nivel para uso en formulación de capsulas blandas

coadyuvantes frente a afecciones al tubo digestivo

3.2 Objetivos Específicos

1. Describir la especie vegetal de estudio, taxonomía, nombres comunes,

distribución, nivel de conservación, fitoquímica, usos tradicionales, e

identificación molecular

6
 2. Establecer un protocolo de micro propagación para la especie de interés

3. Formular capsulas blandas coadyuvantes frente a afecciones ocasionadas en el

tubo digestivo

4 MARCO TEÓRICO

4.1 Descripción de Croton Lechleri

4.1.1 Taxonomía

Tabla 1. Taxonomía Croton lechleri

Reino Plantae

Clase Equisetopsida C. Agardh

Subclase Magnoliidae Novák ex Takht.

Superorden Rosanae Takht.

Orden Malpighiales Juss. ex Bercht. y J.

Presl

Familia Euphorbiáceas Juss.

Género Croton L.

Fuente: (Trópicos, 2023)

4.1.2 Descripción botánica

Es una especie de angiosperma perteneciente a la familia de las Euphorbiaceae, es un

árbol de copa amplia que alcanza los 10 a 20 metros de altura, su raíz es en forma

cilíndrica cónica, axomorfa, la corteza externa del tallo posee abundantes lenticelas y la

resina que presenta es de colo rojo oscuro, en cuanto a sus hojas son simples con dos

glándulas en la base, alternas, a veces opuestas de 12 a 20 cm de largo por 5 a 14 cm de

ancho, las hojas más tiernas tienen un color blanco rojizo y con abundante indumento,

7
 inflorescencia terminal en racimos laxos, fruto capsular globoso de 3 mm de largo por

4,5 mm de ancho, sus semillas son lisas con caruncula y endosperma oleaginoso

4.2 Nombres comunes

En América del sur, en Colombia y Ecuador se le conoce como sangre de drago. En

Ecuador se le conoce también como balsa macho. Mientras que en Perú es conocido
(Díaz Andrés, 2014)
como palo de drago y topa roja .

Sangre de Drago, Sangre de drago, Sangre de grado, Palo sangriento, Sangre del árbol,

Zangrado, entre otros nombres utilizados están en quechua, se le conoce como "yawar

huayo" o "sangre de árbol”; en guaraní, se le conoce como "sangre de palo" o "sangre de

drago. En Aymara, se le conoce como "yawar q'asa" o "sangre de roca". En tupi-guaraní,

se le conoce como "yawar'y" o "sangre de mujer" (Altamirano, 2015).

4.3 Distribución, nivel de conservación UICN

Las especies vegetales de sangre de drago se encuentran distribuidas en las zonas

tropicales y subtropicales desde el sur de México hasta América del Sur, Croton lechleri

es nativo de Bolivia, Colombia, Ecuador, Perú y Brasil; dentro de la distribución

geográfica en el Ecuador es conocido en los flancos de las cordilleras oriental y en la

amazonia (Altamirano, 2015).

De acuerdo a la revisión en la plataforma no se han encontrado antecedentes en la base

de datos de la lista roja de especies amenazadas de la UICN, por lo tanto, actualmente

no se encuentra en ningún peligro de extinción (IUCN Red List of Threatened Species,

2005).

8
4.4 Fitoquímica

La sangre de drago comúnmente como se le conoce en el Ecuador y varios lugares

adicionales, perneciente al genere Croton de la familia Euphorbiaceae, denominado así

con ese nombre por la presencia de una resina de color rojo vino que se obtiene de su

corteza; mencionando a Croton Lechleri Muell, Arg., como una de las especies más

estudiadas a nivel científico debido a su composición fitoquímica los cuales ya se

encuentran reportados en varias bases científicas como lo menciona (Lock & Rojas,

2004), “los constituyentes químicos reportados para C. Lechleri se encuentran

principalmente los alcaloides, compuestos fenólicos dentro de ellos lignanos y taninos,

diterpenos, esteroides y otros fenólicos simples”.

Uno de los componentes con mayor porcentaje aislados de la sangre de drago

representando más del 90% del peso seco de acuerdo a varios autores son las

proantocinidinas dentro de las que se incluyen tanto catequinas como oligomeros

proantocinidinicos. Uno de los primeros alcaloides aislados de la resina de C. Lechleri

fue la taspina la cual estuvo relacionada por su actividad farmacológica, el contenido de

este alcaloide en la resina varia ampliamente en un rango de 1,3% al 20,4% respecto al

peso seco; a diferencia de la resina las hojas de esta especie contienen otros alcaloides

adicionales de los cuales se ha definido tres quimiotipos diferentes (Risco, Vila,

Henriques, & Cañigueral, 2005).

Proantocianidinas

Dentro de este grupo se encuentran las proantocianidinas de las cuales incluyen tanto

catequinas como oligómeros proantocinidinicos de hasta 20 unidades, entre las

catequinas destacan: catequina, epicatequina, galocatequina, epigalocatequina, y en lo

9
respecta a proantocianidinas oligomericas se ha identificado oligómeros de varios

tamaños: dímeros como como las procianidinas B-1 (epicatequina-(4β-8)-epicatequina)

y B-4 (catequina-(4α-8)-epicatequina), catequina(4α-8)-epigalocatequina,

galocatequina(4α-8)-epicatequina, galocatequina(4α-6)-epigalocatequina; trímeros como

catequina(4α-8)-galocatequina-(4α-8)-galocatequina y galocatequina-(4α-8)-

galocatequina-(4α-8)-epigalocatequina, otros oligómeros con más unidades destaca el

SP-303 un oligómero proantocianidínico heterogéneo constituido por 5 a 11 unidades de

catequina, galocatequina, epicatequina y galoepicatequina, predominando la

galocatequina y epigalocatequina (Risco, Vila, Henriques, & Cañigueral, 2005).

Lignanos y componentes minoritarios

“Dentro de su corteza se encuentran diterpenos tipo clerodano: ácido hardwickiico,

bicantrol, crolechicol y ácido crolechinico, korberin A y korberin B” (Lock & Rojas,

2004). “Ademas se encuentran presentes β-sitosterol y β-sitosterol-3-O-β-D-

glucopiranosido,1,3,5-trimetoxibenceno, 2,4,6-trimetroxifenol, 3,4-dimetoxifenol,

alcohol 3,4-dimetoxibenzilico y alcohol 4-hidroxifenetilico como compuestos

minoritarios” (Risco, Vila, Henriques, & Cañigueral, 2005).

10
Tabla 2. Compuestos principales presentes en resina de sangre de drago
Alcaloides Lignanos
Taspina 3, 4-O-Dimetilcedrusina

Diterpenos
ácido hardwickiico Bincatriol Crolequinol

ácido crolequinico Korberina A Korberina B

Fuente: (Risco, Vila, Henriques, & Cañigueral, 2005)

Elaborado por: Llulluma Andrés

11
Tabla 3. Catequinas y proantocianidinas oligomericas identificadas en la sangre de
drago de C. lechleri.
Catequinas (flavan-3-oles-monoméricos)

Dimeros proantocianidínicos

Trimeros y otros oligómeros proantocianidínicos

Fuente: (Risco, Vila, Henriques, & Cañigueral, 2005)

Elaborado por: Llulluma Andrés

12
4.5 Usos Tradicionales

La resina tiene usos en la medicina popular para el tratamiento de las heridas como

cicatrizante, antidiarreico, a su vez en el tratamiento de las ulceras gastrointestinales,

cólicos uterinos, retención de orina y como anticancerígeno, a su vez es un producto de

exportación para uso industrial ya sea en la fabricación de pastillas, en cuanto al tronco,

es maderable usado para trabajos de encofrado, mondadientes, cajones para transporte

de frutos, la resina utilizada como colorante para barnices y mármoles, así como en la

preparación de lacas para oro (Ramirez, 2003).

4.6 Bioactividad de resina sangre de drago

4.6.1 Actividad cicatrizante y anti ulcerosa

Es una de las actividades con mayor aplicación y conocimiento de estudio de la sangre

de drago dentro de la cual están involucrados más de un principio activo, la resina de

sangre de drago estimula la contracción de la herida, favorece la formación de la cicatriz

y regenera rápidamente la piel ayudando a la producción de colágeno, y regeneración

del epitelio, esto se da por la acción de la taspina, 3´-4-O-dimetilcedrusina y los

polifenoles como la catequina y proantocinidinas (Bruneton, 2003).

La sangre de drago mezclada con óxido de zinc puede ser utilizada en el tratamiento

de la alveolitis seca puesto que induce la formación del tejido de granulación y elimina

el dolor y mal olor después de 1 a 4 días de tratamiento; también se menciona que la

resina facilita la curación de ulceras gástricas, reduciendo la actividad mieloperoxidasa y

el tamaño de la ulcera previniendo a su vez la sobreinfección, se han realizado estudios

13
 del efecto de la taspina en cuanto al tratamiento de la ulcera gástrica aguda inducida por

indometacina en rata, comprobando que reduce los índices de ulceración y aumenta la

consistencia de la capa de mucus gástrico (Risco, Vila, Henriques, & Cañigueral, 2005)

4.6.2 Actividad antimicrobiana

Varias investigaciones sustentan la acción antiviral y antibacteriana de la sangre de

drago la resina posee actividad antimicrobiana debido a la presencia de polifenoles,

poliacetilenos, flavonoles, terpenoides, esteroides, alcaloides, propóleos cloquinico, las

korberinas A y B potentes frente a Bacillus subtilis, a su vez presenta actividad frente a

bacterias Gram positivas como S. aureus ATCC 6538 (Carrion, 2010).

En otro estudio reportan la actividad antimicrobiana y antiviral de la sangre de drago

principalmente de la SP-303 una proantocianidina que haya sido ensayada tanto en

modelos antivirales in vitro e in vivo en varios animales como ratas, cobayas, monos

infectados, demostrando que inhibe varios virus de ADN y ARN en los cuales se incluye

al virus del herpes de tipo 1 y 2, virus de la hepatitis A y B, virus de la influenza A y el

virus sincital respiratorio, el efecto se basa en que impide la penetración del virus en la

célula; la sangre de drago es poco activa frente Escherichia coli (Risco, Vila,

Henriques, & Cañigueral, 2005).

4.6.3 Actividad inmunomoduladora

Se ha demostrado que presenta actividad inmunomoduladora en modelos

experimentales in vitro debido a su actividad inhibidora del sistema del complemento, su

actividad dual sobre la producción de especies reactivas de oxigeno ROS y sobre la

fagocitosis y sobre la proliferación linfocitaria. Actividad sobre el sistema del

complemento, forma parte de la primera línea de defensa y posee un alto grado de

14
 sofisticación que le confiere capacidad de interactuar eficientemente con otros sistemas

efectores de la inmunidad humoral y celular asi como de la inflamación, debido a que la

activación del sistema del complemento desempeña un papel importante en la

patogénesis de numerosas enfermedades humanas y enfermedades neurológicas, es

interesante desarrollar inhibidores del complemento que interfieran en el proceso de

dichas enfermedades, como tal la sangre de drago liofilizada ha mostrado una potente

actividad inhibidora de las vías clásica y alternativa del sistema del complemento dicha

actividad de la resina sobre el sistema de complemento podría ser debido a la presencia

de monómeros de flavan-3-oles, proantocianidinas dimericas y trimericas, parte también

de la actividad de la sangre de drago se estaría relacionado con la reducción de los

niveles de calcio y magnesio necesarios para la actividad del sistema del complemento

puesto que la resina precipita ambos cationes

4.6.4 Actividad antiinflamatoria

Uno de los compuestos activos más estudiados ha sido la taspina por ende se la

evidencia en tres modelos farmacológicos

En el modelo del edema inducido por carragenina en la región subplantar de la rata

produciendo inhibición dosis-dependiente con una DE 50 de 58 mg/kg a las tres horas,

siendo 3 a 4 veces más potente que la fenilbutazona

En el modelo del granuloma inducido por torunda de algodón, la taspina inhibió la

formación de granulomas de forma estadísticamente significativas durante una semana

15
 En modelo de artritis inducida por un coadyuvante en rata la taspina se observó que

inhibió la inflamación de forma estadísticamente significativa a 20 mg/kg/día (Risco,

Vila, Henriques, & Cañigueral, 2005).

5 Metodología

5.1 Identificación molecular

5.1.1 Recolección de la muestra

Se debe identificar geográficamente la ubicación de la especie a analizar, de acuerdo a

lista de Trópicos, Croton Lechleri en el Ecuador se encuentra distribuido por la

Amazonia en las provincias de: Orellana, Napo, Pastaza, Sucumbíos, Zamora Chinchipe,

Morona Santiago; En cuanto a la identificación del árbol este deberá tener la siguiente

descripción morfológica: “árbol de copa amplia de altura de 10-20 metros, corteza

externa del tallo con abundantes lenticelas, hojas simples con dos glándulas en la base,

alternas, a veces opuestas de tamaño de 12 a 20 cm de largo por 5 a 14 cm de ancho,

hojas tiernas de coloración blanco rojizo y con abundante indumento, inflorescencia

terminal en racimos laxos, fruto capsular globoso de 3 mm de largo” (Ramirez, Sangre

de drago (Croton lechleri Muell. Arg), 2003).

Para la toma de muestra del material vegetal lo primordial es visualizar que el material

tenga las mejores características morfológicas es decir sin ningún tipo de daño o

enfermedad al tejido o estructura a evaluar para lo consiguiente se recolectaran

porciones completas de la planta de no menos de 20cm por triplicado, las cuales se

envolverán en papel absorbente sin humedecer y empacándolas dentro de bolsas ziploc

limpias o nuevas, a cada una de ellas se las rotulara con todos sus datos de recolección

para su posterior envió o traslado a un laboratorio encargado de su análisis

16
5.1.2 Extracción de ADN

De acuerdo con la revisión de (Sanchez, Mora, & Barrantes, 2021), destaca el método

CTAB modificado por Doyle y Doyle

Para la extracción de ADN se procede de la siguiente forma a cada tipo de muestra

realizado por triplicado, se toma 100mg de tejido joven macerado en nitrógeno líquido y

liofilizado, se agrega 600 uL de buffer de extracción el cual está compuesto de 20 mM

EDTA, pH 8, 100 mM Tris pH 8, 2% PVP, 2% CTAB, 1.4 M NaCl y 0.2 % v/v β-

mercaptoetanol, luego se incuba a 65°C por 20 minutos para posterior agregar 600 uL de

una solución de cloroformo-fenol (24:1) y a cada tubo se homogeneizaron por inversión,

los tubos se centrifugan a 13000 rpm durante 5 minutos a temperatura ambiente,

posterior se transfieren 400 uL del sobrenadante a un nuevo tubo Eppendorf de 1,5 mL y

a cada tubo se les agrega 400 uL de isopropanol frio, se homogeniza por inversión y se

reposa por 10 minutos a -20°C, luego se centrifugo a 13000 rpm por 15 minutos a -4°C

y descartando el sobrenadante, el pellet obtenido se lavó con 600 uL de etanol 70% y se

centrifuga por 2 minutos a 13 000 rpm, se descarta el sobrenadante y se procede a lavar

por último se deja secar el pellet a 42°C por 20 minutos y se resuspende en 100 uL de

agua libre de nucleasas junto con 1 uL de ARNasa y se incuba a 37°C por 30 minutos

La calidad del ADN y pureza se determinó a través de las relaciones A260/280 nm y

A260/230 nm obtenidas en el espectrofotómetro NanoDrop One y la integridad del

ADN se verifica en un gel de agarosa al 0,8% corrido en TBE 1X (45 min/ 100V), los

datos de cantidad de ADN genómico medido se analizan mediante varianza y prueba de

comparación de medias (Tukey) para determinar el mayor rendimiento del tratamiento

17
5.1.3 Amplificación

Se realiza una PCR para un volumen total de 25 uL utilizando el marcador ITS 1 con

ITS2 y luego ITS 3 con ITS 4 estandarizando la reacción con la polimeraza DreamTaq

Green DNA polymerase, para lo cual se sigue el siguiente protocolo:

1. Se coloca en tubos eppendorf 2.5 uL de tampón 10X + MgCl2 25 mM

2. Colocar 2 uL de DMSO

3. Colocar 0.7 uL de cada primer

4. Colocar 1 uL de dNTPs 2.5 uM

5. Colocar 1 uL de la polimerasa 2.5 mM

6. Colocar 1 uL de 25 ug/uL de ADN

El programa descrito para la amplificación describe que la temperatura inicial es de

94°C por 5 minutos y 36 ciclos de desnaturalización a 94°C por 1 minuto, alineamiento

a 45°C por 1 minutos, extensión a 72°C por 1 minuto, y al final a 72°C por 10 minutos

(Sanchez, Mora, & Barrantes, 2021).

5.1.4 Secuenciación

Tabla 4. Primers utilizados en amplificación y secuenciación de la región ITS

Nombr
e Secuencia del cebador Referencia
Urbatsch et al.
ITS1 5′ GTCCACTGAACCTTATCATTTAG 3′ 2000
ITS4 5′ TCCTCCGCTTATTGATATGC 3′ White et al. 1990

Fuente: (Sanchez, Mora, & Barrantes, 2021)

Elaborado por: Llulluma Andrés

18
5.1.5 Obtención y selección de datos

Las secuencias obtenidas se editan utilizando el software CodonCode aligner, las bases

se codificaran mediante el código IUPAC, las secuencias editadas se exportan para

posterior alineamiento mediante el programa Clustal X en el software Mesquite, por

último, los alineamientos se editan de manera manual en el programa MEGA (Sanchez,

Mora, & Barrantes, 2021).

5.2 Microprogación in vitro de Croton lechleri

De acuerdo con la propuesta de (Vela Vasquez, 2011), establecen el siguiente

protocolo de microprogación:

5.2.1 Medios de cultivo

Los medios de cultivo para el ensayo fueron Murashige & Skoog MS, Gambor Miller

y Ojima B5, Mc Cown Lloyd WPM, adicionando 20 g/L de azúcar y 2 g/L de phytagel

como agente gelificante en un Erlenmeyer de 500 mL, la mezcla se afora al volumen

final con agua destilada y posterior se mide el pH de los medios de 5.7±01.

5.2.2 Selección de explante

Recomiendan el uso de semillas maduras de plantas con un estimado de tiempo de 7 a

8 años y yemas de plantas cultivadas en vivero y de plántulas in vitro de Croton lechleri

Muell Arg. certificadas

5.2.3 Desinfección del explante

En cámara de flujo laminar bajo condiciones estériles se colocan semillas y yemas

apicales en un vaso de precipitación de 500 mL por separado junto con jabón líquido

durante 5 minutos, lavar 3 veces con agua destilada y posterior adicionar hipoclorito de

19
 sodio al 2%, 4%, 6%, y 8% durante 15 minutos y enjuagar 3 veces con agua destilada.

Se realizó otra desinfección con benlate (fungicida) 2g/L por espacio de 10 minutos y

luego se lavar 3 veces con agua destilada

5.2.4 Siembra de material vegetal

En cámara de flujo laminar y con mechero encendido, las yemas apicales y semillas

desinfectadas se colocan sobre papel bulki estéril y se realizan cortes en las yemas

apicales de 1.5 cm de longitud, para la siembra en tubos de ensayo de 25x150 mm con

medio de cultivo se procede a colocar los explantes y se los sella con plástico para evitar

así algún tipo de contaminación o perdida de agua del medio de cultivo, se esterilizo en

autoclave durante 15 minutos a 121°C y 1 atm, se deja enfriar los tubos y se colocan en

gradillas plásticas para posterior ser colocados en cámara de incubación con las

siguientes condiciones: temperatura 25 ± 1°C, humedad 70%, fotoperiodo 16 horas luz y

8 horas de oscuridad

20
5.3 Extracción y almacenamiento de resina de sangre de drago

5.3.1 Método convencional

El método tradicional de extracción del látex con fines comerciales es, tumbar el árbol

y "sangrar" el fuste totalmente; esta operación implica hacer cortes en anillos en el fuste,

lo cual permite que el látex fluya libremente por gravedad. El rendimiento está en

función del tamaño del árbol, a mayor diámetro, mayor rendimiento, considerando un

diámetro mínimo de aprovechamiento de 20 cm

5.3.2 Método de siringuero

La extracción del látex puede llevarse a cabo sin derribar el árbol, utilizando el método

shiringuero y realizando cortes en forma de espiral o en V en la corteza del tronco a la

altura del pecho. Para obtener un mayor rendimiento de látex, se practica el corte en

espiral en dirección de izquierda a derecha. Variables como la radiación solar, el

diámetro del árbol, la cantidad de follaje, el ángulo de corte, la precipitación y la fase

lunar afectan la cantidad de látex obtenida. Se ha observado que el mejor momento para

realizar la extracción es entre el cuarto creciente y la luna llena (Midagri, 2010).

21
5.4 Formulación de capsulas blandas

Para la elaboración de las capsulas blandas se obtiene la resina proveniente del árbol

de Croton lechleri y se almacena de manera aséptica en frascos ámbar, evitando así

cualquier tipo de contaminación o partícula extraña, la resina se obtendrá mediante las

técnicas ya mencionadas anteriormente conservando así la especie de sangre de drago

Una vez obtenida la resina esta se congela a -80°C por 48h para su posterior

liofilización en el equipo VirTis Sp., el producto liofilizado se coloca en envases de

papel y conservados en ambiente seco, en un mortero se procede a pulverizar el material

hasta obtener un tamaño de partícula deseado con volumen aproximado de 500 mg de

liofilizado

La gelatina a usarse debe ser de primera calidad y ajustarse a las normativas

correspondientes de la farmacopea en referencia al contenido microbiano, poder

gelificante o consistencia, viscosidad, pH, cenizas, ausencia de arsénico y contenido de

metales pesados <15 ppm (Vila Jato, 2001)., “los excipientes a usarse y utilizando como

referencia el producto comercial de Farbiopharma, se tiene en su composición: Carbosil,

Metilparabeno, Propilparabeno, tween 80, Hidroxibutiltolueno, Butilhidroxianisol,

Polietilenglicol 400, glicerina, sorbitol, colorante” (FARBIOPHARMA, 2022).

Para la elaboración de capsulas blandas se procede como primer paso a la obtención de

la masa de la cubierta a partir de los materiales ya mencionados, la gelatina en forma de

láminas se macera en agua desmineralizada durante 12 horas y a continuación se

sumerge en una disolución acuosa del agente plastificante, se caliente a baño maria hasta

que se disuelva en su totalidad la gelatina, en este punto se añaden el reste de

coadyuvantes y se concentra la disolución hasta obtener la viscosidad deseada, posterior

22
se procede a filtrar a través de un matiz de pequeña abertura de malla y la gelatina queda

lista para su utilización (Vila Jato, 2001).

La preparación de las capsulas blandas se logra mediante varios procedimientos entre

ellos: Método de placas atribuido a Colton y Upjohn y el de matrices giratorias usado a

nivel industrial

1. Método de placas: consiste en la deposición de una lámina caliente del material de

la cubierta sobre una placa moldeada la cual estará adaptada a presión o por

succión mediante vacío aplicado sobre el fondo de los moldes, la dosificación del

material de relleno se realiza por vertido desde una torbera de llenado en la cual se

coloca una segunda lamina de gelatina que cubrirá toda la superficie todo este

conjunto es sometido a presión produciendo el termo sellado de las capsulas, las

capsulas se las extraen en caliente y se las lavan con un solvente a menor

temperatura y obteniendo así su forma definitiva

Figura 1. Esquema del procedimiento de Upjohn para capsulas blandas

Fuente: (Vila Jato, 2001).

23
 Tabla 5. Formula unitaria de capsulas blandas

Formula de composición
Cada capsula de 1 mL contiene:

Sangre de drago (Croton Lechleri) liofilizado

1,650 mg

Excipientes
Carbosil
Metilparabeno, propilparabeno
Tween 80
Hidroxibutiltolueno, Butilhidroxianisol
Polietilenglicol 400
Gelatina, Glicerina, Sorbitol
Colorante
Agua purificada

Elaborado por: Llulluma Andrés

Fuente: (FARBIOPHARMA, 2022)

5.4.1 Control de calidad

Para su control de calidad se recomienda tomar en cuenta los siguientes aspectos:

1. Caracteres organolépticos

2. Identificación del principio activo

3. Valoración del contenido

4. Uniformidad de contenido (F.E. 2.9.6)

5. Ensayo de impurezas y sustancias relacionadas

6. Uniformidad de peso (F.E. 2.9.5)

7. Disgregacion (F.E. 2.9.1)

24
 8. Disolución (F.E. 2.9.3)

9. Humedad (F.E. 2.2.32)

10. Control microbiológico (F.E. 5.1.4)

6 Posibles resultados

6.1 Identificación molecular

La longitud de las secuencias alineadas del ITS espaciador transcrito interno del ADN

ribosomal nuclear (ITS-5.8S-ITS2) fue de 643 pb para 96 secuencias, en las cuales 298

caracteres fueron variables y 190 informativos

En cuanto al análisis preliminar de la longitud de secuencias alineadas de la región

cloroplastidial trnL-F fue de 1189 pb, con 443 caracteres variable y 105 informativos

para 61 individuos

6.2 Microprogación in vitro de Croton Lechleri

6.2.1 Desinfección de explante

La contaminación de los explantes sometidos a los diferentes tratamientos y a

diferentes concentraciones de hipoclorito de sodio, se observó que a una concentración

del 2% resulto ser más eficiente por permitir obtener menor porcentaje de

contaminación en los propágulos, la adición de benlate en el proceso de desinfección

resulta útil para las yemas asegurando así que no exista contaminación de

microorganismos en los explantes (Vela Vasquez, 2011).

6.2.2 Introducción al medio de cultivo

El uso de yemas apicales mantiene un buen rendimiento y poseen gran capacidad de

generar una vitroplanta con un tamaño adecuado y a menor tiempo con un estimado de

25
 15 días, los medios adecuados para el crecimiento y desarrollo óptimo fueron Murashige

& Skoog y Gambor a diferentes concentraciones de ácido giberelico 0,0 -0,25 – 0.50

ppm (GA3), en la fase de multiplicación y proliferación los medios ya mencionados

resultaron optimos a diferentes concentraciones de Bencilamino purina 0,0 – 0,25 – 0,50

ppm (BAP) (Vela Vasquez, 2011).

6.2.3 Enraizamiento

Con el protocolo de enraizamiento se esperan raíces gruesas y con buena longitud

estableciendo que los medios líquidos en esta fase son una buena opción si se quiere

obtener un enraizamiento de entre 1.2 a 2.5 cm, las interacciones a diferentes

concentraciones de ácido 3 – indolbutirico y carbón activado, con el medio de cultivo de

Murashige & Skoog y Gambor son esenciales puesto que a una concentración mayor

esto sería perjudicial para la vitroplanta y sus raíces a su vez el uso de antioxidantes

favorece el porcentaje de sobrevivencia y enraizamiento en los propagulos (Vela

Vasquez, 2011)

6.2.4 Aclimatación

Se estima que las raíces continúen su desarrollo dentro de un microambiente

controlado similar a un vivero y con un sustrato adecuado, se deben realizar

evaluaciones a los 30 y 60 días en la cual el protocolo fija una tasa de supervivencia

(Santillana, 2015)
entre el 80 y 90% .

26
6.3 Diseño del Producto

Figura 2. Etiqueta de producto

Elaborado por: Llulluma Andrés

27
7 Presupuesto

7.1 Recolección de resina

Tabla 6. Costos de extracción y recolección

Equipos Valor ($) Cantidad (u)

cuchillos, machetes 10 2
recipientes 1L 8 2
EPP 25 1
transporte 40 1
contenedores 30 1
TOTAL 113$

Elaborado por: Llulluma Andrés

7.2 Materia prima

Tabla 7. Costo materia prima

Materiales Costo unitario ($) Cantidad

Sangre de drago 113 2L
agua purificada 5,50 10 L
gelatina 6 1 kg
conservantes 9 500 g
agentes humectantes 9,50 1 kg
antioxidantes 12 500 g
agente plastificante 3 15 mL
vehículo 17 500 mL
TOTAL 160$

Elaborado por: Llulluma Andrés

28
7.3 Elaboración de capsulas blandas

Tabla 8. Costos elaboración de capsula blanda

Proceso Valor

Recolección de resina 113$

Materia Prima 160$

identificación molecular 211$

micro propagación in vitro 905$

TOTAL 1389$

Elaborado por: Llulluma Andrés

29
8 Cronograma de actividades

Actividades Mes 1 Mes 2 Mes 3 Mes 4 Mes 5 Mes 6 Mes 7

Identificación de la especie
Recolección de muestra
Traslado de materia prima
Almacenamiento
Identificación de especie en
herbarios
Extracción de ADN
Amplificación
Secuenciación
Análisis bioinformática
Establecimiento de cultivo in
vitro
Preparación de medios de
cultivo
Desinfección de explantes
Introducción al medio de cultivo
Multiplicación
Enraizamiento
Aclimatación
Formulación de capsulas
blandas
Control de calidad
Envasado
Elaborado por: Llulluma André

30
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