Universidad de Pamplona; Facultad de Ciencias Bsicas; Departamento de Microbiologa Aseguramiento de la Calidad
1. MARCO TERICO
La validacin de un mtodo microbiolgico es un proceso importante para la implementacin de una tcnica analtica microbiolgica, ya que por medio de la validacin de dicho mtodo se logra establecer de forma experimental que las caractersticas del mtodo cumplen con los requisitos para la aplicacin prevista.
Los aerobios mesfilos o tambin denominados viables totales. Este indicador microbiolgico se emplea con el objetivo de estimar el nivel de microorganismos de un producto alimenticio y determinar su estado higinico general. Se trata de microorganismos que crecen en presencia de oxgeno y cuya temperatura ptima de crecimiento est entre 15-35C. Dentro de los aerobios mesfilos se incluyen tanto bacterias como hongos y levaduras. (1)
El concepto de validacin se puede definir como: proceso de evaluacin de las caractersticas de un procedimiento de medida, y comprobacin de que dichas caractersticas cumplen una serie de requisitos preestablecidos para el uso especfico previsto, es decir, el objetivo de la validacin es confirmar que el mtodo analtico o de medida empleado es adecuado para el uso previsto que se le va a dar. La validacin, incluye la especificacin de los requisitos que han de cumplir el mtodo a validar, la determinacin de las caractersticas del mtodo y la declaracin sobre la validez del mtodo, llevando en todo momento un registro de validacin que recoja los pasos seguidos y los resultados obtenidos. Para demostrar la validez de un mtodo existen una serie de parmetros cuyo cumplimiento es preciso determinar durante el proceso de validacin; dichos parmetros dependern del tipo de mtodo que se valida, siendo los establecidos en el caso de mtodos microbiolgicos los siguientes:
Exactitud: se entiende por tal al grado de concordancia entre el resultado de la medicin y el valor de referencia aceptado. En microbiologa, teniendo en cuenta la dificultad para obtener el valor de referencia, se emplea el trmino de exactitud relativa: grado de correspondencia entre la respuesta obtenida por el mtodo de referencia y la respuesta obtenida por un mtodo alternativo en muestras similares.
Precisin: se trata del grado de concordancia entre los resultados obtenidos al aplicar el procedimiento experimental repetidas veces bajo las condiciones establecidas. Dentro de este parmetro se engloban la repetibilidad y reproducibilidad. La repetibilidad es el grado de concordancia entre los resultados de sucesivas mediciones del mismo mensurado realizadas en las mismas condiciones de medicin (mismo mtodo, mismo analista, mismo instrumento de medida); la reproducibilidad es el grado de concordancia entre los resultados de mediciones del mismo mensurado realizadas bajo diferentes condiciones de medicin (diferentes analistas, diferentes das, bajo diferentes condiciones, etc). (2)
Incertidumbre: es la estimacin que caracteriza el intervalo de valores en el que se sita, generalmente con una alta probabilidad, el valor verdadero de la magnitud medida. La incertidumbre de la medida incluye, en general, varias componentes. Algunas pueden estimarse a partir de la distribucin estadstica de los resultados de series de medicin y pueden caracterizarse por la deviacin tpica muestral, las estimaciones de los otros componentes solamente pueden basarse en la experiencia o en otras informaciones. El clculo de la incertidumbre se obtiene como resultado del propio proceso de validacin.
2. PROCEDIMIENTO
Control de ambientes
se colocaron abiertas 2 cajas de petri con agar SPC (Standar Plate Count) en las incubadoras de 30 C y 37C durante un periodo de 15 minutos , transcurrido este tiempo se incubaron las cajas invertidas a 37 C/48 hrs. este procedimiento se realizo antes de la realizacion de cada protocolo con el fin de hacer un recuento de aerobios mesofilos que se encontraban en el ambiente. Estandarizacin del inoculo
Estandarizacin de la matriz
Se tom una colonia aislada de cada microorganismo (Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa). Se sembr en 99 ml de caldo BHI (cada cepa por separado), se agit y se llevara a incubacin a 37C por 24 horas, sin agitacin. Se adicion 1 ml del microorganismo en un tubo de ensayo con 9 ml de agua peptonada al 0,1 % para obtener la dilucin inicial. (esto se realizo para los tres microorganismos) Con ayuda de un vortex se homogeniz el inculo. Se tom 1 ml de la suspensin microbiana inicial y se transfiri a un tubo con 9 ml de agua peptona al 0,1 %, se homogeniz y se repiti este procedimiento hasta la dilucin 10 -10 . (esto se realizo para los tres microorganismos) Se sembr en cajas de Petri por siembra en profundidad 1 ml de cada dilucin por duplicado y se agregaron aproximadamente 15-20 ml de agar SPC. (esto se realizo para los tres microorganismos) Se incubaron las cajas a 37C por 48 horas. Se realizaron las lecturas despus de los respectivos tiempos de incubacin y se registraran los datos. (esto se realizo para los tres microorganismos) Se pesaron 10 gr de Skim Milk (leche desnatada o descremada). Se adiciono 100 mL de agua destilada y se esteriliz durante 10 minutos a 121C a 15 psi. Este procedimiento se realiz tres veces para obtener tres muestras. Se tom 1 ml del pool microbiano y se trasfiri a 100 ml de Skim Milk para obtener la dilucin inicial. (este procedimiento se realizara por triplicado para obtener tres muestras del mismo inoculo) Anlisis repetitivo del inoculo en la matriz de Skim Milk
3. RESULTADOS Tabla 1. Correlacin en trminos de recuento en placa y espectrofotometra de la estandarizacin del inoculo para Klebsiella spp. DILUCIN INVERSO RECUENTO 1 PROMEDIO RESULTADO ABS UFC/ML 1 1 ct1 ct2 0,0994 0 0,1 10 1600 1600 1600 16000 0,154 4,20411998 0,01 100 1600 1600 1600 160000 0,078 5,20411998 0,001 1000 1600 1600 1600 1600000 0,068 6,20411998 0,0001 10000 1936 1936 1936 19360000 0,065 7,28690535 0,00001 100000 536 624 580 58000000 0,060 7,76342799 0,000001 1000000 163 172 167,5 167500000 0,060 8,22401481 0,0000001 10000000 66 59 62,5 625000000 0,058 8,79588002 0,00000001 100000000 32 33 32,5 3250000000 0,033 9,51188336 1E-09 1000000000 7 12 9,5 9500000000 0,030 9,97772361 1E-10 1E+10 0 5 2,5 2,5E+10 0,005 10,39794 Tabla 2. Correlacin en trminos de recuento en placa y espectrofotometra de la estandarizacin del inoculo para Escherichia coli DILUCIN INVERSO RECUENTO 2 PROMEDIO RESULTADO ABS UFC/ML 1 1 ct1 ct2 1,478 0 0,1 10 1600 1600 1600 16000 0,323 4,20411998 0,01 100 1600 1600 1600 160000 0,06 7,20411998 0,001 1000 1600 1600 1600 1600000 0,059 5,20411998 0,0001 10000 1600 1600 1600 16000000 0,05 8,20411998 0,00001 100000 1600 1600 1600 160000000 0,049 9,20411998 0,000001 1000000 1600 1600 1600 1600000000 0,045 10,20412 0,0000001 10000000 1600 1600 1600 1,6E+10 0,043 6,20411998 0,00000001 100000000 1600 1600 1600 1,6E+11 0,043 11,20412 1E-09 1000000000 388 428 408 4,08E+11 0,040 11,6106602 1E-10 1E+10 388 212 300 3E+12 0,038 12,4771213 Se inoculo 1 ml de la dilucin inicial en un tubo conteniendo 9 ml de agua peptona 0,1 % para obtener la segunda dilucin (10 -1 ). Se homogeniz y se repiti el procedimiento hasta la dilucin 10 -10 . Luego se transfiri 1 mL de cada una de las diluciones preparadas en cajas de Petri, por duplicado para cada dilucin (para cada una de las temperaturas evaluadas). Se adiciono 15-20 mL de agar SPC a una temperatura, en cada caja de Petri. Se mezcl cuidadosamente el inoculo con el medio y se dej solidificar. Despus se invirtieron las cajas y se incubaron a 30C y 35C durante 48-72 respectivamente. Transcurrido el tiempo especificado de incubacin se contaron las colonias caractersticas en cada caja que contena entre 15-300 colonias. Estos anlisis se realizaron por duplicado para cada una de las temperaturas analizadas (30C y 37C).
Tabla 3. Correlacin en trminos de recuento en placa y espectrofotometra de la estandarizacin del inoculo para Pseudomonas spp. DILUCIN INVERSO RECUENTO 3 PROMEDIO RESULTADO ABS UFC/ML 1 1 ct1 ct2 x x 0,1 10 1600 1600 1600 16000 0,186 4,20411998 0,01 100 1600 1600 1600 160000 0,078 5,20411998 0,001 1000 800 800 800 800000 0,062 5,90308999 0,0001 10000 600 600 600 6000000 0,059 6,77815125 0,00001 100000 58 110 84 8400000 0,054 6,92427929 0,000001 1000000 80 47 63,5 63500000 0,050 7,80277373 0,0000001 10000000 32 21 26,5 265000000 0,046 8,42324587 0,00000001 100000000 4 19 11,5 1150000000 0,032 9,06069784 1E-09 1000000000 2 3 2,5 2500000000 0,039 9,39794001 1E-10 1E+10 1 1 1 1E+10 0,032 10 Grafica 1. Curva patrn para la estandarizacin del inoculo de Klebsiella spp en trminos de ufc/ml y ABS.
Grafica 2. Curva patrn para la estandarizacin del inoculo de Escherichia coli en trminos de ufc/ml y ABS.
y = 4.0613ln(x) + 0.5898 R = 0.9873 0 2 4 6 8 10 12 0 5 10 15 U f c / m l
abs Estandarizacion del inoculo I1 Crecimiento de Klebsiella Log. (Crecimiento de Klebsiella) y = 0.7897x + 4.2286 R = 0.7096 0 5 10 15 0 2 4 6 8 10 12 U f c / m l
ABS Estandarizacion del inoculo I2 Crecimiento "E.coli" Linear (Crecimiento "E.coli") Grafica 3. Curva patrn para la estandarizacin del inoculo de Pseudomonas spp en trminos de ufc/ml y ABS.
Tabla 4. Resumen Estadstico sobre la comparacin de muestras (I1, I2, I3) segn su promedio, Desviacin Estndar y Coeficiente de Variacin.
Grafica 4. Comparacin de los (3) recuentos (I1, I2, I3) y = -0.0191x 2 + 0.8353x + 3.5118 R = 0.9944 0 2 4 6 8 10 12 0 2 4 6 8 10 12 u f c / m l
ABS Estandarizacion del inoculo I3 Crecimiento de Pseudomonas Poly. (Crecimiento de Pseudomonas) R1 R2 R3 Grfico Caja y Bigotes 4,2 6,2 8,2 10,2 12,2 14,2 respuesta Tabla 5. Recuento de Aerobios mesofilos en (3) pulls a 30C en Caldo Skim Milk
Tabla 6. Recuento de Aerobios mesofilos en (3) pulls a 37C en Caldo Skim Milk DILUCIN INVERSO RECUENTO 1 RECUENTO 2 RECUENTO 3 37C PROMEDIO RESULTADO LOG 37C RESULTADO LOG ABS
4. DISCUSIN Para la estandarizacin del inoculo fue necesario emplear valores de ufc/ml y Absorbancia (Abs) con procesos de recuento en placa y espectrofotometra donde permiti la elaboracin de cuervas patrones para los inculos I1, I2, I3. Es por ello que las grficas con mayor coeficiente de correlacin fueron la I1 y I3 donde sus datos se ajustan a 1. Por lo que se puede determinar que la inoculacin de ufc/ml fue consecuentemente buena con respecto a las diluciones practicadas. Por otra parte la (Grafica 2) no es concluyente sus concentraciones bacterianas por lo que se puede decir que su estandarizacin no fue optima ya que su R2 fue de 0.7096 ms bajo que en las (Grafica1 = 0.98 y Grafica 2 =0.99) Tambin se hizo referencia a las relaciones entre el tamao de las medias y la variabilidad de las variables, por esto se utiliza el coeficiente de variacin como medida para determinar si un conjunto de datos son estrechamente concluyentes o dispersos entre s y es la cual nos permite medir el grado de repetitividad ; donde la (Tabla 4.) nos permite inducir que las variables I1, I2y I3 son demasiadas bajas por lo que sus valores son heterogneos esto es debido a que deben estar cercanos a 100%. Pero cabe rescatar que I2 es un poco ms alta. Esto se puede ver tambin en la (Grafica 4.) donde el diagrama de cajas y bigotes es ms dispersa entre el plano del diagrama. Consecuentemente se us la desviacin estndar la cual presentan una incertidumbre alta para I2 donde se sobrepasa de 1 con respecto a I1 y I3 las cuales estn dentro de este parmetro estadstico. Por eso si la desviacin estndar es mayor es porque esta se aleja de la media aritmtica. Por lo que se se puede concluir que la estandarizacin del inoculo fue buena para R1 y R3 debido a su Desviacin Estndar ya que la medida de CV% no permiti marcar un ndice de referencia para este anlisis. Por lo que se esperara trabajar con estos dos inculos en la matriz o pull. Tal no fue el caso, y se emplearon los tres inculos para elaborar la matriz de 30C y la 37C. Esto se hizo por triplicado (Recuento1, Recuento2, Recuento3) donde a 30C R1 y R2 fueron buenas debido a sus Desviaciones Estndar. Con lo que se compara con los pulls a 37 C y tambin marcan igual resultado, con desviaciones de 1. Los CV% siguen siendo bajos para los pulls a las dos temperaturas, por lo que esta medida estadstica no es confiable tomar para determinar o identificar un buen crecimiento exponencial de las matrices. Sin embargo es preciso decir que las variables R1 y R2 tuvieron mejor crecimiento en cuanto a unas dcimas ms despus del 1; con respecto a la influencia de la temperatura en los pull con 30C. Por lo que la validacin realizada puede ser un poco acertada debido a que si hubo presencia de aerobios mesofilos pero se esperara haber obtenido alto desarrollo de carga microbiana en las dos temperaturas por igual ya que son los rangos permitidos por este grupo de microorganismos. Estos errores pudieron ser debido a que las matrices se realizaron con los 3 inculos de los cuales uno no estaba en buen estado de estandarizacin y que en la preparacin de ellas no se conoca previamente la estandarizacin de estos.
5. CONCLUSIONES La validacin de esta tcnica para aerobios mesofilo no fue la mejor debido a que las dos variables de confirmacin la reproductividad, la cual se media con la desviacin estndar y la repetitividad con el coeficiente de variacin no fueron definidas de buena manera ya que la repetitividad fue muy baja con respecto a su medida estadstica, impidiendo un anlisis ms profundo y confiable para la validacin. Debido a que solo se tom en cuanta el anlisis de la Desviacin estndar es decir la reproductividad se da por entendido que la validacin debe ser de nuevo hecha para obtener valores ms confiables e idneos. La eficiencia de este mtodo recae es en la buena elaboracin de la estandarizacin de los inculos por lo que se esperara retomar el protocolo y repetir este paso para que no afectara la matriz que se desea validar. De todas las matrices elaboradas dos de ellas (R1 y R2) fueron las de mejor estndar estadstico y a su vez correlacionaban con las temperaturas a las que se encontraba pero con ms significancia en la de 30C.
BIBLIOGRAFIA 1. Larry Maturin and James T. Peeler (2001). Bacteriological Analytical Manual, Chapter 3: Aerobic Plate Count. Disponible en web: www.fda.gov. 2. Gabinete de servicios para la calidad (GSC). Documentacin del curso sobre validacin y clculo de incertidumbres en ensayos microbiolgicos.
PROTOCOLO e INFORME ARMONIZADO PARA LA EVLUACIÓN DEL DESEMPEÑO DEL MÉTODO DE REFERENCIA PARA LA ESTIMACIÓN DE LA CUENTA DE S. Aureus. APÉNDICE NORMATIVO B, NOM-210-SSA1-2014