Tema-2.

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blancairanzu

BIOLOGÍA (MÉTODOS EN BIOLOGÍA MOLECULAR)

2º Grado en Biología

Facultad de Ciencias

Reservados todos los derechos.

No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad.
 Tema 2. Electroforesis

Principio de la electroforesis

La electroforesis es una técnica que permite separar y analizar moléculas cargadas (con
grupos ionizables) mediante su desplazamiento diferencial en un campo eléctrico. Si tenemos
una muestra con moléculas cargadas, al aplicar un campo eléctrico, los cationes se
desplazaran al electrodo del signo opuesto (cátodo) mientras que los aniones se desplazaran
al polo positivo (ánodo). Si las partículas no tuvieran carga, se mantendrán en el mismo punto,

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no se desplazaran hacia ninguno de los electrodos.

Movilidad electroforética

Cuando un ion es sometido a un campo eléctrico, existen dos fuerzas que van a actuar en un
ion:

a) Fuerza del campo eléctrico: Fuerza que va desplazar el ion al electrodo

correspondiente. Depende de dos factores: la carga del ion y de la fuerza o intensidad
del campo eléctrico.

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b) Fuerza de rozamiento. Se opone a la fuerza del campo eléctrico y depende del
coeficiente de fricción (viene determinado por el tamaño de la molécula y su simetría)
y la velocidad a la que se desplaza el ion.

Rápidamente se van a igualar ambas fuerzas y se alcanzará una velocidad constante. En las
ecuaciones podemos despejar la velocidad y concluimos que la velocidad tiene una relación
directa con la carga y la intensidad del campo eléctrico pero es inversamente proporcional al
coeficiente de fricción. Por lo tanto, también podremos diferenciar moléculas que no solo
difieran en carga sino también en tamaño y forma. La movilidad electroforética () es la
velocidad para una unidad de campo eléctrico.

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 Soportes: tipos y preparación

Electroforesis libre

Las primeras técnicas electroforéticas descritas en 1937 y empleadas por Arne Tiselius para la
separación y análisis de proteínas. Se conoce como electroforesis libre o de frente móvil.
Utilizo un tubo de vidrio con forma de U que relleno con la disolución tampón que llevaba a
cada uno de los extremos uno de los dos electrodos. La muestra se adicionaba directamente
al tampón de manera que inicialmente estarían disueltas en el tampón. Al aplicar el campo

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eléctrico, se seguía el avance del frente que quedaría entre los iones y el disolvente con una
serie de sistemas ópticos (cambios en la concentración...).

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Esta técnica no tiene gran poder de resolución porque tanto el campo eléctrico como la
muestra se aplican directamente a la disolución, por lo que al pasar la corriente eléctrica se
genera calor que puede provocar corrientes de convección (tienden a mezclar la muestra) y
mayor difusión. A partir de los años 40 y 50 se introdujeron diferentes tipos de soporte para
evitar las corrientes de convección y difusión. Podemos clasificar los soportes en dos
categorías:

Aquellas técnicas donde la muestra se aplica directamente a un soporte se agrupan bajo el

grupo de electroforesis zonal, se aplica en una zona específica del soporte y se separaran en
zonas muy discretas. Tenemos soporte en papel y una variante en acetato de celulosa; y por
otro lado técnicas en gel.

a) Soporte en papel y acetato de celulosa. En este caso, la fuerza de rozamiento será

muy baja porque son medios de muy baja fricción. Se utilizan cubetas horizontales
que llevan en ambos extremos un compartimento del cátodo y ánodo que están
unidos por un puente. La tira (de papel o acetato de celulosa) está completamente

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 saturada e impregnada de la disolución tampón y se coloca sobre el puente con los
extremos en contacto con los electrodos. La muestra se aplica en el centro de la tira y
al aplicar el campo eléctrico se desplazaran los iones por la superficie. Presentan muy
bajo coeficiente de fricción, por lo que con ambos tipos de soporte, la separación se
basara en diferencias en la carga.

Esta técnica con papel no se emplea actualmente para la separación de moléculas

grandes porque las fibras de celulosa tienen capacidad de adsorber (fijar moléculas en
la superficie), por lo que las moléculas dejarían un rastro. Por el contrario, esto no

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supone un problema en caso de usar acetato de celulosa porque no tienen grupos
hidroxilo libres y se emplea principalmente en análisis clínicos para analizar proteínas
plasmáticas como las inmunoglobulinas.

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b) Soporte en gel. Los geles son matrices porosas que van a ejercer el papel de un tamiz
molecular, es decir, las moléculas de la muestra se depositaran en sus cavidades. Al
aplicar el campo eléctrico, las moléculas se desplazaran a través de esta matriz, por lo
que el coeficiente de fricción es mayor. El tamaño y la forma tienen por consiguiente
gran importancia en este tipo de técnica.

Se pueden emplear tres tipos de matrices:

 De almidón. Utilizada originalmente para separar proteínas. Fueron sustituidos
por geles de poliacrilamida.

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  Geles de poliacrilamida. Utilizada para separar proteínas y ácidos nucléicos
pequeños (<200 pares de bases).
 Geles de agarosa. Utilizada para ácidos nucléicos de mayor tamaño.

PREPARACIÓN de GEL de Poliacrilamida

El gel de poliacrilamida se produce con una reacción de polimerización catalizada por

radicales libres. Los reactivos necesarios son Tris- HCl (proporciona un pH determinado),
acrilamida (monómeros de bajo PM), N,N’-metileno-bis(acrilamida), persulfato amónico (sal)
y TEMED.

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Los monómeros de acrilamida se unen mediante sus radicales libres para formar largas
cadenas lineales. La función del N,N’-metileno-bis(acrilamida) es entrecruzar las cadenas de
acrilamida, obteniendo una matriz con poros entre los cuales se desplazaran las moléculas.
Para que tenga lugar esta reacción:
- al disolverse el persulfato amónico se descompone de forma espontanea para crear
el radical sulfato. La acrilamida se combinara con el radical sulfato, y será inestable
porque tendrá un electrón desapareado. Para estabilizarse, se unirá con otra
acrilamida o N, N’-metileno-bis(acrilamida).
- el TEMED cataliza la formación de radicales libres a partir del persulfato amónico.

A mayor concentración de acrilamida y N,N’-metileno-bis(acrilamida), menor tamaño de poro.

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Los moldes más usados son rectangulares y constan de dos placas de cristal separadas por
espaciadores (determinara el grosor del gel). Los cristales se sujetan con unas pinzas en un
formador de geles donde añadimos el gel. El peine crea los pocillos (cavidades donde se
deposita la muestra). Una vez terminada la polimerización del gel, se retira el peine y se
transpasa el gel y las placas a una cubeta de electroforesis (vertical) que tiene un
compartimento del cátodo en la parte superior, y el ánodo en la parte inferior.

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Otro tipo de molde es el tubular, que se emplean en electroisoelectroenfoque y utiliza como
molde unos tubos estrechos de manera que cada gel solo permite separar una sola muestra a
diferencia que en los geles rectangulares.

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Electroforesis en Gel: proteínas

El gel de Poliacrilamida se utiliza en tres técnicas: SDS-PAGE, isoelectroenfoque y electroforesis

bidimensional (combinación de las dos anteriores).

1. SDS-PAGE

Traducido al castellano SDS-PAGE se conoce como “Electroforesis en Gel de PoliAcrilamida en

presencia de SDS”. El SDS es un detergente con carga negativa que corresponde a dodecil
sulfato sódico y está presente en gel, tampón y muestra de proteínas.

La proteína en presencia de un detergente se desnaturaliza y se mantiene únicamente la

estructura primaria. En otras palabras, el SDS se emplea para desnaturalizar las proteínas. Por
otro lado, al presentar carga negativa se une en una proporción concreta 1 SDS: 2
aminoácidos, por lo que la cadena polipeptidica estará recubierta de cargas negativas. Como
consecuencia, las proteínas se desplazarán en la misma dirección (tienen carga predominante
negativa). Se establece entonces una relación constante entre la masa de la cadena y su carga,
en otras palabras se diferenciaran en su desplazamiento en la longitud de la cadena (menor
longitud, menor peso molecular, menor resistencia, mayor desplazamiento). La longitud es por
lo tanto, inversa a la velocidad. La forma no tiene importancia ya que todas tendrán una forma
esencialmente lineal.

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El tampón de carga contendrá :

- SDS. Desnaturaliza y proporciona carga,

- β-mercaptoetanol. Rompe los puentes de disulfuro y separa la muestra en
subunidades individuales,

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- Glicerol. Hace la muestra más densa de modo que esta tenga una densidad distinta al
tampón, porque si no se perdería la muestra,
- azul de bromofenol. Marcador del frente. Este compuesto de carga negativa y de
color azul tiene mayor movilidad que cualquier proteína por lo que avanzará siemrpe
por delante de las proteínas.
- y tris-HCl. Proporciona un pH determinado.

Esta electroforesis es discontinua porque presenta dos geles: concentrador y separador. En el

gel separador las proteínas se separan en función de su masa y en la parte superior
colocamos el gel concentrador que tiene los pocillos y concentra la muestra en una banda
compacta en la interfase. De esta manera, todos los iones entrarán a la vez en el gel
separador. El efecto concentrador es porque tiene un porcentaje de acrilamida muy bajo por
lo que los poros son muy grandes, es decir, la muestra no se separa según el tamaño. Por otro
lado, el gel separador tiene mayor porcentaje de acrilamida y menor diámetro de poro.
Además, presentan distinto pH (gel separador: pH de 8,8 y gel concentrador: pH de 6,8) La
diferencia en pH ayuda también a concentrar la muestra.

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 Este método se puede utilizar para calcular el peso molecular, midiendo la movilidad relativa
(se explicó en el tema anterior); la estructura cuaternaria; y la pureza.

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2. Isoelectroenfoque

La base química de la separación de las proteínas es la diferencia en sus puntos isoeléctricos.

Para ello, debemos preparar los siguientes geles con las siguientes características:

 Son geles tubulares o también horizontales.

 No contienen SDS debido a que el SDS enmascaría la carga de las diferentes
moléculas y no dejaría ver diferencias en el punto isoeléctrico.
 Tienen un porcentaje de acrilamida muy bajo (<4%) ya que si tuviera un
porcentaje elevado de acrilamida, el gel tendría los poros más pequeños y no

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todas las moléculas se separarían igual (el tamaño también influiría en la
separación). De esta manera, los poros son grandes y no influyen en la
separación.
 Tienen en su estructura un gradiente de pH, que dependerá de las proteínas que
queremos separar (podemos preparar un gradiente muy amplio o estrecho). Para
ello se añade a la mezcla unos compuestos sintéticos (anfolitos) que tienen
distintas proporciones de radicales ácidos y básicos.

En esta mezcla, algunos anfolitos adquirirán una carga positiva y otros negativa. Antes de
aplicar la muestra, debemos aplicar un campo eléctrico y los anfolitos se dispongan en orden
según su pI. Los que tenga un pI alto estarán más cerca del cátodo y en la zona cercana al
ánodo habrá un pH más alto. Tras desconectar el campo eléctrico, depositamos la muestra de
proteínas. Aplicamos otra vez el campo eléctrico para que las proteínas se desplacen por el
gel. Cuando las proteínas lleguen a la región del gel donde el pH es igual a su punto eléctrico,
se detendrán porque no tienen carga (carga 0) y por lo tanto no se desplaza. Una vez hecha la
separación, se tiñen las proteínas con azul de Comassie.

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Este método tiene un poder de resolución muy alto por lo que es ideal para separar
isoenzimas. Otro método utilizado para la separación de isoenzimas se puede realizar también
mediante la electroforesis en acetato de celulosa. El isoelectroenfoque también se puede
utilizar para método analítico.

3. Electroforesis bidimensional

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Este método consiste en combinar las dos técnicas electroforéticas que separan en base a
diferentes propiedades fisioquimicas. Es decir, los resultados de la primera electroforesis
serán sometidos a una separación por otra técnica de electroforesis. Normalmente, la primera
técnica suele ser el isoelectroenfoque y la segunda técnica (o dimensión), el SDS-PAGE.
Combinando estos métodos podremos separar proteínas con el mismo pI pero distinto peso
molecular, proteínas con distintos pI pero mismo tamaño; y todas que tienen distinto pH y
distinto peso molecular. Las únicas proteínas que no podríamos separar serían las que tengan
el mismo pI y tamaño. Se utiliza nitrato de plata para teñir las proteínas (tienen mayor
sensibilidad).

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La principal aplicación es en el campo de la proteomica, es decir, el campo que estudia el

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proteoma (conjunto de todas las proteínas expresadas por un organismo). Podemos
comparar diferentes proteomas para poder detectar cambios en la expresión de algunas
proteínas como resultado de una enfermedad, tratamiento, exposición a una toxina... En la
siguiente imagen observamos una electroforesis bidimensional de un proteoma de una celula
hepática sana (abajo) y una enferma (arriba). Si analizamos las bases moleculares de un cáncer
de hígado, la proteína que aparece en la electroforesis de la enferma puede ser utilizada como
marcador de la enfermedad.

Electroforesis en Gel: ácidos nucléicos

En este caso, se van a separar con geles de agarosa en vez de poliacrilamida. Son muy sencillos
de preparar porque no se requiere ninguna reacción química de polimeración porque la
agarosa ya es un polímero formado por galactosa (se extrae de las algas). Preparamos los
geles a una concentración determinada y de manera espontanea las moléculas de agarosa se
entrelazaran entre si haciendo puentes de hidrógenos haciendo una matriz porosa.
Normalmente se utilizan geles que van desde 0.3 a 2% de agarosa, según los tamaños que
queramos separar.

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Si aumentamos la concentración de agarosa más de un 2%, el gel será tan denso que no se
podrán ver los fragmentos de DNA. Para separar fragmentos pequeños de DNA se utilizaran
los geles de poliacrilamida. Por otro lado, si reducimos el porcentaje de 0.3% los geles se
romperán por lo que se utiliza una técnica especial denominada electroforesis en campo
pulsado, en esta se usarán cambios constantes en la dirección del campo eléctrico.

Recordamos que la movilidad depende de la carga y del coeficiente de fricción, que a su vez
depende del tamaño y forma. En general, se fragmenta el DNA para utilizar trozos de
secuencias de ácidos nucléicos, que tienen un tamaño mucho mayor que las proteínas.

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Debido a que la forma de los acidos nucleicos es igual (es lineal) se elimina el factor forma en
la base de la separación. Por otro lado, ya que la carga es para todas negativas, tampoco se
utilizará ese parámetro. La relación carga tamaño va a ser también constante, cuando mayor
sea la molécula más negativa será. La movilidad por lo tanto, es inversamente proporcional al
tamaño.

Una molécula de RNA es monocatenaria por lo que se pueden aparear con regiones
complementarias para formar estructuras como horquillas. En este caso, la forma de estas
estructuras terciarias podría afectar a la separación de los ácidos nucléicos por lo que se tiene
que tratar con desnaturalizadores fuertes para romper estas estructuras y para que solo se
separen por su tamaño y carga.

Para preparar el gel, pesamos la cantidad determinada que queramos de agarosa y se

disuelve en el propio tampón electroforético. Ya que a temperatura ambiente no es soluble,
se calienta a 100º y una vez disuelta, se añade a un molde (bandeja cerrada por los cuatro
costados). Introducimos también un peine para crear los pocillos. Al irse enfriando, se ira
solidificando y formara el gel.

Una vez formado el gel se pasa a la cubeta de electroforesis. Se emplean cubetas horizontales
con un compartimento del cátodo, otro del ánodo y entre medias una plataforma donde
colocaremos el gel. Rellenamos los compartimentos con tampón y dejamos al gel sumergido

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 en el tampón para evitar que se pueda secar (electroforesis submarina). Añadimos un tampón
de muestra o ruptura, que no contiene SDS ni β-mercaptoetanol pero si glicerol (aumenta la
densidad de la muestra).

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Llevara un colorante de localización para ver el avance de las moléculas (azul de bromofenol o
xileno cianol). A diferencia de las proteínas, tendremos en la muestra y tampón de
electroforesis EDTA (quelante de cationes divalentes, por lo que retira cationes como calcio o
magnesio para que evite la acción de las enzimas). Incluimos también tampón Tris, que a un
pH alcalino mantiene la carga negativa del DNA.

Una vez que haya terminado la electroforesis para observar los fragmentos de DNA se utiliza
una molécula fluorescente que se intercala entre las bases del DNA (bromuro de etidio) de
manera que bajo luz UV observaremos bandas naranjas.

Esta técnica se puede utilizar para determinar el tamaño, observar las interacciones DNA-

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proteína, realizar mapas de restricción o sintetizar productos de RCR/insertos, etc.

En el caso de las bacterias, ya que el genoma es circular y adopta diferentes formas, se puede
separar en cuanto a la forma (relajada, enrollada o muy enrollada). La molécula
superenrrollada es mucho más compacta que la molécula relajada, por lo que avanzará mucho
más, seguida de la molécula enrollada y por último, la relajada.

Electroforesis en Campo Pulsante (PFGE)

Cuando las moléculas son mayores de 40-50 Kb no se separaran en cuanto al tamaño porque
tienen la misma movilidad, por lo que se utiliza una cubeta que presenta más de un par de
electrodos con el fin de ir aplicando el campo eléctrico en diferentes direcciones
periódicamente. Como las moléculas son tan largas, para que se puedan ir desplazando a
través del gel se tienen que alinear en la dirección del campo eléctrico. Con cambios
frecuentes en la dirección del campo eléctrico conseguiremos que las moléculas más grandes
se vayan quedando atrás ya que tardan más en realinearse.

En la imagen observamos dos pares de electrodos, de manera que aplicando varias

direcciones, las moléculas mas grandes necesitaran mas tiempo en alinearse en la dirección
correcta de la electroforesis y se desplazaran menos.

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