DETERMINACIÓN DE COLESTEROL TOTAL Y LDL

MARCO TEÓRICO
El contenido aproximado de colesterol en cada familia de  lipoproteínas es (en % por unidad de
peso): 1% en los quilomicrones, 18% en las VLDL, 50% en las LDL y 23% en las HDL. Dado
que cada familia posee distinta actividad biológica, el significado clínico de un aumento de
colesterol depende de la o las lipoproteínas que se encuentran en exceso.

Por otra parte, los mecanismos reguladores de los niveles plasmáticos de lipoproteínas son
muy complejos y pueden ser afectados por múltiples factores (genéticos, ambientales,
fisiológicos o patológicos), siendo posible encontrar valores de colesterol total cercanos al
rango normal acompañados de alteraciones en las fracciones lipoproteicas.

Las HDL y las LDL han sido las más estudiadas por su importante actividad biológica:
- las LDL, producto del metabolismo de las VLDL en plasma, son las encargadas del transporte
del colesterol exógeno (y en mucho menos proporción, endógeno) hacia el interior de las
células;
- las HDL, sintetizadas en el hígado, remueven el colesterol no utilizado por las células (dentro
de ciertos límites de concentración), transportándolo hacia el hígado para su degradación.

Diversos estudios epidemiológicos han confirmado que el exceso de colesterol de LDL debe
ser considerado como factor de riesgo para el desarrollo de enfermedad cardíaca coronaria,
considerando que el efecto protector de las HDL sólo parece tener relevancia dentro de cierto
rango de concentraciones de colesterol circulante. Tales hallazgos permiten deducir que los
valores aislados de colesterol de HDL o de LDL no pueden tomarse como índices predictivos
de riesgo, sino que es necesario conformar un perfil lipídico con los valores de colesterol total,
colesterol de HDL y colesterol de LDL. 

METODOS PARA DETERMINAR EL COLESTEROL

Las lipoproteínas de baja densidad (LDL o β-lipoproteínas) se separan del suero

precipitándolas selectivamente mediante el agregado de polímeros de alto peso molecular.
Luego de centrifugar, en el sobrenadante quedan las demás lipoproteínas (HDL y VLDL); el
colesterol ligado a las mismas se determina empleando el sistema enzimático Colesterol
oxidasa/Peroxidasa con colorimetría según Trinder (Fenol/4-AF).
Por diferencia entre el colesterol total y el determinado en el sobrenadante, se obtiene el
colesterol unido a las LDL

MATERIALES
• Muestra de sangre
• Tubo de tapa lila
• Reactivos
• Cubetas
• Micropipetas
• Centrífuga
• Espectrofotómetro
• Reloj

PROCEDIMIENTO
1. Extraer una muestra de sangre del paciente con el tubo lila. Centrifugarlo por 10 minutos.
2. En tres tubos o cubetas espectrofotométricas marcadas B (Blanco), S (Standard) y D
(Desconocido) colocar:

3. Mezclar y esperar 10 a 15 minutos en temperatura ambiente.

4. Medir la absorbancia de los tres tubos en 500 nm de longitud de onda.
5. Anotar y calcular los resultados.

RESULTADO

Tubo 1: 0.000
Tubo 2: 0.013
Tubo 3: 0.010
F = 200 / 0.013
F = 15384

15384 * 0.010
= 153, 84

Resultado es del Colesterol Total es 153, 84%

CÁLCULOS DE LOS RESULTADOS PARA DETERMINAR LDL

LDL = CT – T/5 – cHDL

Para calcular el LDL, según la fórmula de Friedewald, se necesita las cantidades del Colesterol
Total (CT), menos los Triglicéridos divido para 5 (T/5), menos colesterol de las HDL (cHDL). 
LDL = 153.84 – 88.8/5 – 45
LDL = 153.84 – 17.76 - 45
LDL = 91,08

El resultado de LDL es 91,08%

METODOS ENZIMATICOS.-
Algunos de los primeros métodos para efectuar pruebas de colesterol incluían la obtención de
productos coloreados, haciendo reaccionar el colesterol con sustancias fuertemente ácidas.
Dado que se descubrió que los ésteres de colesterol y el colesterol libre no producen
cantidades equivalentes de color esto dio lugar a la adición de un paso de saponificación para
transformar los ésteres de colesterol en colesterol libre. Actualmente se utilizan métodos más
rápidos y seguros que utilizan enzimas como reactivos para las pruebas de colesterol.
Los métodos enzimáticos para el análisis de colesterol fueron ideados en los años 70 y desde
entonces han reemplazado los métodos químicos casi completamente.
Los métodos enzimáticos se ven menos sujetos a posibles interferencias por sustancias no
esterólicas que los métodos químicos. No obstante, no hay absoluta especificidad para el
colesterol, dado que su oxidasa puede reaccionar también con otros estelores, que se sabe
que están también presentes en el plasma, y con esteroles vegetales, presentes en
concentraciones apreciables en la circulación en pacientes con *-sitosterolemia. El método
atribuido a Flegg lleva a cabo el análisis en tres pasos; el grupo 3-OH del colesterol es
oxidado y el agua oxigenada, que es uno de los productos de la reacción, se determina
enzimáticamente:
 Hidrólisis de los ésteres de colesterol mediante la colesterol esterasa (CE).
Colesterol esterificado CE Colesterol libre + ácido graso
 Oxidación del colesterol mediante la colesterol oxidasa (CO) para producir peróxido de
hidrógeno.
Colesterol libre + O2 CO 4-Colestenona + H2O2
 Oxidación de un cromógeno con el peróxido de hidrógeno en una reacción catalizada por la
peroxidasa para producir un producto coloreado.
H2O2 + fenol +4- aminoantipirina peroxidasa quinoneimina + H2O
Con respecto a las enzimas que actúan en estas reacciones, se puede decir que:
 La colesterol esterasa (CE) se encuentra presente en el jugo pancreático y en el
intestino, transforma los esteres del colesterol en colesterol y acido graso libre, y es
precisamente en esta forma libre como es absorbido el colesterol por el intestino.
 La colesterol oxidasa (CO) se encuentra en la vesícula biliar y el intestino y produce la
oxidación del colesterol libre debido a que el organismo es incapaz de oxidar colesterol
hasta dióxido de carbono por lo que solo puede excretarlo en la bilis donde parte del
colesterol libre se convierte en ácidos biliares.

METODO DE PRECIPITACION
Para observar la existencia de HDL en las muestras; se utiliza el método de precipitación.
Este método consiste en la precipitación de las lipoproteinas VLDL y LDL quedando en el
sobrenadante las HDL. Para ello, se utiliza una solución de acido fosfotugstico que precipita a
las VLDL y a las LDL debido a la presencia de la apoproteina B-100 en ellas mientras que en las
HDL no se encuentran estas apoproteinas pero sí la A-I y A-II.
La apoproteina A-I es la más abundante dentro de las HDL mientras que La A-II es la segunda
más abundante. La primera se sintetiza en el intestino y en el hígado. La intestinal sale a la
circulación asociada a los quilomicrones pero una en la sangre es transferida alas HDL,
mientras que la hepática sale directamente a la circulación unida a las partículas nacientes de
HDL, constituyendo una parte estructural fundamental de estas lipoproteínas.
La apo B es una apoproteina cuya estructura no es bien conocida debido a su gran tamaño, a
su alta insolubilidad en medio acuoso y a que forma agregados y se oxida con facilidad. Existen
en dos formas, La B-100 y la B-48 como la que nos incumbe es la B-100 se ahondara en su
estudio.
La apo B-100 es una proteína de 4536 aminoácidos que se sintetiza en el hígado, y se
encuentra en las VLDL, IDL y LDL. Esta apoproteina constituye el factor de reconocimiento de
las LDL por receptores específicos que se encuentran tanto en el hígado como en tejido extra
hepáticos, y de esta forma desempeña un papel fundamental en la captación del colesterol
transportado en dichas lipoproteínas en los tejidos.
Existen varios tipos más de apoproteinas que son la apo-C, apo-E, apo-D y apo-F.
Para realizar la precipitación se utilizó como reactivo acido fosfotugstico 0,44 mM; MgCl2 20
mM.
 PROTOCOLO
Para realizar la medición de la precipitación se utiliza la técnica de espectrofotometria donde
las muestras en este caso se van a poner en tubos.
Para realizar la precipitación se hicieron los siguientes pasos:
 Se coge de la nevera un eppendorf que contiene control patológico de HDL además
también se coge los tubos con las tres muestras utilizadas en las determinaciones
anteriores (vease colesterol y triglicéridos). El control de HDL se utiliza al igual que el
control patológico de las determinaciones anteriores donde si cae dentro del intervalo
de confianza propio para HDL, la medición puede continuar.
 Se pipetean con micro pipeta en cuatro eppendorf 100 l de las 3 muestras y del control
de HDL (uno por cada sustrato), despues se le añade la solución precipitante (250 l), al
añadir estos volumenes se ha realizado una dilución que a la hora de medir se debe
tener en cuenta es decir se tiene un factor de dilución que sera de 3,5 ya que se parte
de 100 l y se llega a 350 l. Se agita los cuatro eppendorf en vortex durante 10 segundos
y se deja incubar durante 10 minutos.
 Después de los 10 minutos, se dejan otros 10 minutos dentro una centrifugadora
donde al sacar los eppendorf se observara un sobrenadante donde se encuentran las
HDL y una parte sólida en el fondo del eppendorf donde estarán las LDL y VLDL.
 El sobrenadante donde se encuentran las HDL se extrae de los eppendorf 250 l por
cada uno de ellos y se pasan a otros eppendorf.
 Ahora, primero se coge de la nevera el blanco, el calibrador y el control patológico que
va a tener la misma utilidad que en las determinaciones de colesterol y triglicéridos. La
medición se realizara por duplicado al utilizar tubos. Se debe poner por cada tubo un
 sustrato es decir 15 l de blanco, calibrador, control patológico, control de HDL y las tres
muestras además de 1 ml de solución de colesterol que presenta la misma utilidad que
en las determinaciones anteriores.
 Los tubos son llevados al espectrofotometro que da los valores de absorbancia y
concentración que ayudan a hallar la cantidad de colesterol que hay en las muestras,
cuyos datos seran explicados en apartados siguientes.
4. RESULTADOS
Determinación de colesterol total
Para determinar colesterol trabajamos con placa. Obteniéndose los siguientes resultados de
concentración de colesterol:
Colesterol total Colesterol total
mg/dL mg/dL

Control patológico 97,545 101,520

Muestra 1 (21941) 227.680 223,899

Muestra 2 (21963) 187,466 180,511

Muestra 3 (21965) 127,581 124,911

Intervalo de confianza (Colesterol) 101-123 Intervalo admisible (Colesterol) 92-132
En los dos casos podemos validar el ensayo porque el control patológico de colesterol entra
dentro del intervalo admisible. En la primera colorimetría despreciamos los valores de las
muestras 1 y 3 porque difieren mucho entre sí, impidiendo obtener una media aceptable. En
una segunda colorimetría todos los valores obtenidos no son válidos. En la tercera colorimetría
obtuvimos los valores de las muestras 1 y 3. El motivo por el cual tenemos que descartar
algunos valores es debido posiblemente a errores en él pipeteo, que son significativos porque
trabajamos con volúmenes pequeños. Con estos datos hacemos la media de cada muestra
obteniendo la concentración total de colesterol de cada muestra.
 Muestra 1 = 225.7895mg/dL
 Muestra 2 = 183.99mg/dL
 Muestra 3 = 126.246mg/dL

METODO ESPECTROFOMÉTRICO
E un método de análisis que hace uso de la información entre la materia y la energia radiante,
la cual se refiere a como las ondas elctromagnéticas se propagan y transportan sin
transferencia de materia, este método también es usado para la determinación de colesterol
Método directo
Método de Friedswald