TEMA 7

Técnicas de análisis molecular

Principales
p campos
p de la Biotecnología
g Molecular:

-Diagnóstico,
g , pprevención y tratamiento de
múltiples y variadas enfermedades.

-Incremento de los rendimientos y la

productividad de los cultivos y g
p granjas
j animales.

-Desarrollo de microorganismos
g capaces
p de
producir diversas sustancias de interés
industrial, alimentario o clínico y la eliminación de
contaminantes y sustancias xenobióticas tóxicas
presentes en el medio ambiente.
p
 Características de los marcadores utilizados en el
seguimiento de microorganismos

1. Ser específicos.

2. Esta especificidad debe poder comprobarse en el ambiente en el cual el

microorganismo ha sido introducido.
introducido

3. Los marcadores deben ser estables en el suelo y durante el tiempo que

sobreviva el microorganismo.

4. También se requiere una relativa estabilidad en el marcador para evitar que

se pierda o se transfiera a otra bacteria.

5. Los marcadores deben afectar lo menos posible el comportamiento de los

microorganismos.

6 L
6. Los marcadores
d elegidos
l d deberían
d b í tener un seguimiento sencillo
ll en un amplio
l
rango de materias.

7 Deben considerarse las condiciones ambientales (pO2,

7. (pO2 pH) más favorables
para la expresión de los marcadores.
 Técnicas para el análisis de las comunidades microbianas

Tinción con blanco de calcofluor

L técnica se basa en la p
La propiedad
p que tiene este f
qu fluorocromo
u m de u
unirse de fforma
m
inespecífica a los residuos b-1,3 presentes en polisacáridos como la celulosa y la
quitina de la pared celular de los hongos y de algunos protozoos. La tinción es
inespecífica y cualquier hongo filamentoso puede exhibir este tipo de
fl
fluorescencia,
s i por lo
l que dicha
di h técnica
té i debe
d b interpretarse
i t t s de
d forma
f presuntiva
s ti y
siempre confirmarse la identificación mediante cultivo.

La fotografía muestra
a Arthrobotrys
oligospora antes (parte
superior) y después
(parte inferior) de la
contracción de sus
anillos. La barra
corresponde a un
t
tamañoñ de
d 10 μm.

Candida Penicillium marneffei Arthrobotrys oligospora

 Ciclo vital de Ustilago
g maydis
y

a, Developmental stages in the U.

a U maydis life
cycle. b, Tumour formation on maize. c,
Scanning electron microscopy (SEM) image of
haploid sporidia. d, SEM image of mated
sporidia on plant epidermis; arrow denotes
dik
dikaryotic
ti fil
filament.
t e, SEM imagei of
f
appressorium; arrow marks entry point. f, Top,
differential interference contrast image of
appressorium; bottom, epifluorescence image
of fungal
g cell wall stained with calcofluor
(blue) and endocytotic vesicles stained with
FM4-64 (red). The bright ring indicates active
secretion and endocytosis at the fungus–plant
interface; arrows indicate the penetration
point g,
point. g Black teliospores visible in tumour
section. h, SEM image of sporogenous hyphae
and early stages of spore development. i, SEM
image of ornamented teliospores. Scale bars,
5 m.
Tinción con DAPI

Tiñe ácidos nucleicos. Empleada frecuentemente para recuento de

microorganismos totales.
Fotomicrografías
g de Trypanosoma
yp
cruzi en el estadio de epimastigote,
y de Tetrahymena thermophila. A:
Campo claro. B: Contraste de Fases.
C-D: Fluorescencia (Tinción de
membrana con FM4FM4-64
64 y de ADN
con DAPI, respectivamente). T:
Tetrahymena thermophila. E:
epimastigote. Ma: macronúcleo, mi:
micronúcleo.

Esporas
p de Paenibacillus larvae
teñidas con DAPI

La fotografía muestra una

Ventajas: No es específica.
comunidad de microorganismos
teñidos con DAPI (en azul) sobre
paja seca. La materia orgánica
Inconvenientes:
I i t N diferencia
No dif i células
él l vivas
i d
de
muestra autofluorescencia verde. muertas. No permite el rastreo de
microorganismos específicos.
 Tinción de viables
Tinción con colorantes fluorescentes que diferencia entre células vivas y muertas.
muertas Da
información sobre la viabilidad de la muestra.

Tinción de viables. En Penicillium marneffei

verde las células vivas
y en rojo las células
muertas.

Verde: penetra en todas las células,

viables
a s o no. E El naranja de acr
acridina
na sse un
une
a los ácidos nucleicos y da fluorescencia
verde si el organismo está vivo.
LIVE/DEAD staining of Clostridium diphtheriae wild-
yp and mutant strains. Green fluorescent bacteria
type
Rojo:
R j contiene
ti yoduro
d d
de propidio,
idi have a functional cytoplasmic membrane and are stained
penetra sólo en las células cuya green, red propidium iodide staining indicates non-viable
cells. A: ISS3319, B-C: Lilo1, D: ISS4060, E-F: Lilo2, C
membrana ya no se encuentra intacta. and F: cells subjected to 5 min of vigorous vortexing.
Anticuerpos fluorescentes
Muy específica.
específica Útil para rastrear un microorganismo concreto en un hábitat
complejo.
Bacterias teñidas de azul
con un anticuerpo anti-O157.
Renibacterium salmoninarum es el agente productor de la
que se conoce como enfermedad bacteriana del riñón o BKD
(Bacterial Kidney Disease). Afecta fundamentalmente a
salmónidos y presenta la particularidad de ser un
microorganismo de desarrollo intracelular (principalmente
en macrófagos),
óf ) lo
l que dificulta
difi lt en gran manera la l
consecución de una respuesta inmune eficaz, así como su
tratamiento.
En general la especificidad de los anticuerpos, en especial
los policlonales, debería ser evaluada para examinar la
disminución ante posibles reacciones cruzadas. Por
ejemplo en el género Pseudomonas donde algunas especies
actuan como PGPR, se consigue una elevada especificidad
con anticuerpos policlonales de proteína de membrana.
 Proteína fluorescente verde para etiquetado celular
Se inserta en el genoma de las bacterias un gen que codifica una GFP (green fluorescent
protein). Las células etiquetadas con GFP se pueden introducir en un medio como la raíz
de plantas por ejemplo para estudiar in situ la cepa.

Ventajas de la GFP:
La GFP es extremadamente estable,
resistente a las proteasas,
fá il
fácilmente
t detectable
d t t bl y no requiere i
un substrato exógeno que permita
monitorizar una célula sola, incluso a
tiempo
p real. Además la GFP es
continuamente sintetizada por lo que
Microscopia con laser confocal mostrando células de
no emite background en las
Pseudomonas putida marcada con GFP. poblaciones nativas.

Desventajas de la GFP:
Existe interferencia con partículas
del suelo, la expresión de la GFP varía
en diferentes especies, existe una
imposibilidad de trabajar en
Variantes de proteínas condiciones anaeróbicas. Además el
Aequorea victoria fluorescentes desarrolladas por
Roger Tsien, premio nobel de química
plásmido
lá id que lleva
ll l GFP es inestable
la i t bl
en 2008 por el descubrimiento y y hay riesgo de que se transfiera a
desarrollo de la GFP (compartido otras bacterias.
con Shimomura y Chalfie).
 Proceso de colonización del
órgano luminoso del
Euprymna scolopes por cepas
de Vibrio fisheri marcadas
con GFP.

Glofish
MARCADORES LUMINISCENTES
Los más utilizados son los genes luxAB y genes luc. Los genes luxAb han sido clonados a
partir de las bacterias bioluminiscentes Vibrio fisheri y Vibrio harveyi mientras que los
genes luc fueron clonados de la luciérnaga Photinus pyralis.

1. Expresión del
gen lux.
2
2. Bi l i i
Bioluminiscencia
i
en Escherichia
coli expresando
los genes lux de
Vib i fisheri
Vibrio fi h i.

El requerimiento de O2 limita el uso y la

interpretación de este tipo de sistema pero si
el oxígeno está presente, puede resultar muy
útil para informar sobre la actividad
bacteriana y su distribución en diferentes
ambientes como por ejemplo la rizosfera. Los
Fluorescencia Planta con luciferasa Photinus pyralis genes luc presentan más especificidad y
de Vibrio de Photinus pyralis ausencia
ausenc a de background con las poblac
poblaciones
ones
fisheri. nativas que los genes luxAB. La estabilidad del
producto de los genes se mide normalmente en
minutos u horas.
 Tinciones genéticas
Utilizamos sondas de ácidos nucleicos.
nucleicos
Hibridación fluorescente in situ (FISH)
Utilizamos oligonucleótidos fluorescentes complementarios en la secuencia
firma del rRNA 16S o 18S. El grado de especificidad se puede controlar
mediante la secuencia. Permite identificar o rastrear o organismo particular.

También es posible Órgano de luz de

Colonización de raíces realizar sondas Euprymna scolopes con
por Azospirillum filogenéticas múltiples por
Vibrio fisheri. FISH
c m na a
combinada con
c n
brasilense. F H
FISH. E
En f
fotografía
fí microscopia confocal es
vemos poblaciones de muy popular en ecología
bacterias en lodos microbiana para
activados. estudiar muestras en
profundidad.
Tinción de cromosomas y transcripción inversa in situ

Son técnicas de FISH. La primera emplea genes específicos mientras que la

segunda se dirige a un mRNA específico es decir,
decir a genes expresados.
expresados

Tinción de cromosomas IRST

REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)

1) Una sonda de ácido nucleico hibrida una secuencia

complementaria en un gen diana.
2) La DNA polimerasa copia en gen diana.
3) Se consiguen múltiples copias del gen mediante
ciclos sucesivos.
Electroforesis en gel desnaturalizante en gradiente (DGGE)

La técnica utiliza una mezcla de urea y formamida que desnaturaliza el DNA. Podemos
discriminar 2 cadenas dobles de DNa con diferencias en la secuencia si la energía de
desnaturalización es diferente.