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-Diagnóstico,
g , pprevención y tratamiento de
múltiples y variadas enfermedades.
-Desarrollo de microorganismos
g capaces
p de
producir diversas sustancias de interés
industrial, alimentario o clínico y la eliminación de
contaminantes y sustancias xenobióticas tóxicas
presentes en el medio ambiente.
p
Características de los marcadores utilizados en el
seguimiento de microorganismos
1. Ser específicos.
6 L
6. Los marcadores
d elegidos
l d deberían
d b í tener un seguimiento sencillo
ll en un amplio
l
rango de materias.
L técnica se basa en la p
La propiedad
p que tiene este f
qu fluorocromo
u m de u
unirse de fforma
m
inespecífica a los residuos b-1,3 presentes en polisacáridos como la celulosa y la
quitina de la pared celular de los hongos y de algunos protozoos. La tinción es
inespecífica y cualquier hongo filamentoso puede exhibir este tipo de
fl
fluorescencia,
s i por lo
l que dicha
di h técnica
té i debe
d b interpretarse
i t t s de
d forma
f presuntiva
s ti y
siempre confirmarse la identificación mediante cultivo.
La fotografía muestra
a Arthrobotrys
oligospora antes (parte
superior) y después
(parte inferior) de la
contracción de sus
anillos. La barra
corresponde a un
t
tamañoñ de
d 10 μm.
Esporas
p de Paenibacillus larvae
teñidas con DAPI
Ventajas de la GFP:
La GFP es extremadamente estable,
resistente a las proteasas,
fá il
fácilmente
t detectable
d t t bl y no requiere i
un substrato exógeno que permita
monitorizar una célula sola, incluso a
tiempo
p real. Además la GFP es
continuamente sintetizada por lo que
Microscopia con laser confocal mostrando células de
no emite background en las
Pseudomonas putida marcada con GFP. poblaciones nativas.
Desventajas de la GFP:
Existe interferencia con partículas
del suelo, la expresión de la GFP varía
en diferentes especies, existe una
imposibilidad de trabajar en
Variantes de proteínas condiciones anaeróbicas. Además el
Aequorea victoria fluorescentes desarrolladas por
Roger Tsien, premio nobel de química
plásmido
lá id que lleva
ll l GFP es inestable
la i t bl
en 2008 por el descubrimiento y y hay riesgo de que se transfiera a
desarrollo de la GFP (compartido otras bacterias.
con Shimomura y Chalfie).
Proceso de colonización del
órgano luminoso del
Euprymna scolopes por cepas
de Vibrio fisheri marcadas
con GFP.
Glofish
MARCADORES LUMINISCENTES
Los más utilizados son los genes luxAB y genes luc. Los genes luxAb han sido clonados a
partir de las bacterias bioluminiscentes Vibrio fisheri y Vibrio harveyi mientras que los
genes luc fueron clonados de la luciérnaga Photinus pyralis.
1. Expresión del
gen lux.
2
2. Bi l i i
Bioluminiscencia
i
en Escherichia
coli expresando
los genes lux de
Vib i fisheri
Vibrio fi h i.
La técnica utiliza una mezcla de urea y formamida que desnaturaliza el DNA. Podemos
discriminar 2 cadenas dobles de DNa con diferencias en la secuencia si la energía de
desnaturalización es diferente.