La

biología molecular como vínculo entre el patrimonio micocultural y el aprovechamiento de hongos

Rodolfo Enrique Ángeles-Argáiz1, Roberto Garibay-Orijel1*

1
Laboratorio de Sistemática, Ecología y Aprovechamiento de Hongos Ectomicorrízicos, Instituto de
Biología, Universidad Nacional Autónoma de México. Tercer circuito, sin número, Ciudad Universitaria,
Coyoacán, Ciudad de México, México. C. P. 04510

*rgaribay@ib.unam.mx

Palabras clave

Biología molecular, código de barras de la vida, identificación de especies, hongos comestibles, hongos
útiles, secuencias de DNA, sistemática, variación genética, especies nuevas.

Resumen

Los hongos comestibles silvestres (HCS) forman parte del patrimonio biocultural y tienen impacto desde
la autosuficiencia alimentaria hasta millonarios mercados internacionales. Dependiendo de la región, se
pueden encontrar especies de hongos diferentes, con distintas cualidades organolépticas y
requerimientos ecológicos; sin embargo muchas son muy similares en la morfología de sus esporomas.
Por lo tanto, la identificación de las especies es complicada pero fundamental para el reconocimiento,
valorización y aprovechamiento de estos recursos. La biología molecular es una herramienta que ha
permitido la identificación de especies, la discriminación entre especies afines, el diseño de estrategias
de monitoreo y propagación, así como la trazabilidad en el mercado. Este documento se divide en cinco
secciones. En la primera se discute cómo la biología molecular ha resuelto la diversidad y taxonomía de
importantes grupos de HCS de gran valor biocultural como Boletus sección Appendiculati, Butyriboletus
(boletos de mantequilla), Boletus clado porcini, Cantharellus sección Cibarius, Lactarius sección Deliciosi,
el género Morchella, Amanita sección Caesareae, Amanita muscaria, y las Amanitas tóxicas de la sección
Phalloideae. En la segunda sección se discuten los marcadores moleculares usados para separar especies
y resolver preguntas filogenéticas en hongos comestibles. También se discute el concepto de código de
barras de la vida y cómo este concepto se ha usado para entender la taxonomía, nomenclatura y
distribución del matsutaque americano (Tricholoma magnivelare, T. murrillianum y T. mesoamericanum);
para facilitar la trazabilidad alimentaria y la calidad de productos a base de hongos silvestres; así como,

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para evaluar la veracidad en el comercio de las trufas. La tercer sección discute el flujo de trabajo que se
sigue para obtener secuencias de ADN de HCS. Aquí se detallan los aspectos relacionados con las
preguntas de investigación que permiten abordar los datos moleculares, los materiales biológicos de los
que se pueden obtener estos datos; así como, las diferentes técnicas de laboratorio involucradas, desde
la extracción de ADN hasta la bioinformática y los análisis filogenéticos. En la cuarta sección se abordan
otras técnicas de biología molecular que se pueden usar para estudiar el aprovechamiento de los HCS
como la secuenciación de nueva generación, PCR en tiempo real y los microarreglos. Finalmente, en la
quinta sección se comparten los protocolos de extracción de ADN, electroforesis, PCR y limpieza de PCR
que hemos empleado en nuestro laboratorio por diez años para producir secuencias de ADN de HCS.

Palabras clave: Biología molecular, códigos de barras de la vida, identificación de especies, hongos
comestibles, hongos útiles, secuencias de DNA, sistemática, variación genética, especies nuevas.

Abstract

Wild edible mushrooms (WEM) are part of the biocultural heritage and have an impact from food self-
sufficiency to millionaire international markets. Depending on the region, you can find different
mushroom species, with different organoleptic qualities and ecological requirements; however, many of
them have very similar morphology. Therefore, the identification of the species is complicated but
fundamental for the recognition, valorization and use of these resources. Molecular biology is a tool that
has allowed the identification of species, discrimination between related species, the design of
monitoring and propagation strategies, as well as market traceability. This document is divided into five
sections. The first discusses how molecular biology has solved the diversity and taxonomy of important
WEM groups of great biocultural value such as Boletus section Appendiculati, Butyriboletus (butter
boletes), Boletus clade porcini, Cantharellus section Cibarius, Lactarius section Deliciosi, the genus
Morchella, Amanita section Caesareae, Amanita muscaria, and the toxic Amanitas of the Phalloideae
section. The second section examines the molecular markers used to separate species and solve
phylogenetic questions in edible fungi. It also discusses the concept of bar code of life and how it has
been used to understand the taxonomy, nomenclature and distribution of the American matsutaque
(Tricholoma magnivelare, T. murrillianum and T. mesoamericanum); to facilitate food traceability and the
quality of products based on wild mushrooms; as well as, to evaluate the veracity in the truffle trade.
The third section discusses the workflow that is followed to obtain edible mushroom DNA sequences.
Here we detail the research questions that can be addressed by molecular data, the biological materials

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from which these data can be obtained; as well as, the different laboratory techniques involved, from
DNA extraction to bioinformatics and phylogenetic analyzes. The fourth section deals with other
molecular biology techniques that can be used to study the use of HCS, such as new generation
sequencing, real-time PCR and microarrays. Finally, in the fifth section we share the protocols of DNA
extraction, electrophoresis, PCR and PCR cleaning that we have used in our laboratory for ten years to
produce mushroom DNA sequences.

Key words: Molecular biology, barcodes of life, species identification, edible mushrooms, useful
mushrooms, DNA sequences, systematics, genetic variation, new species.

Introducción

El patrimonio micocultural y el aprovechamiento sustentable de hongos comestibles silvestres (HCS)

ofrecen amplias expectativas en cuanto a la diversificación de las actividades económicas y a la
autonomía alimentaria. No obstante, al incrementar el uso y comercio de HCS también se incrementa el
riesgo de la substitución de especies, ya sea de manera intencional o accidental. Esto trae consigo
distintos riesgos que oscilan desde el comercio de productos apócrifos o de menor calidad, la
explotación de especies amenazadas, hasta a los casos extremos de intoxicaciones leves o incluso letales.
Para resolver o prevenir estos problemas la identificación precisa de las especies es fundamental. Una
herramienta para la tipificación, discriminación e identificación aun de muestras fragmentadas o
parciales es la biología molecular.

La biología molecular (BM) puede ser entendida como la rama de la biología que estudia la naturaleza de
los fenómenos a nivel molecular, centrando su atención en tres moléculas; DNA, RNA y proteínas. Esta
disciplina utiliza técnicas de separación, manipulación, síntesis y análisis. Dichas técnicas usan estrategias
de naturaleza bioquímica fundamentadas en principios básicos de la biología de la célula, así como
análisis computacionales. Una de las técnicas más ampliamente utilizadas es la PCR (reacción en cadena
de la polimerasa) la cual, de manera general, permite obtener altas concentraciones de un fragmento de
DNA deseado (amplicones).

La secuenciación capilar (de amplicones individuales en plataforma Sanger, o secuenciación

dideoxiterminal por electroforesis capilar) permite conocer qué ácidos nucléicos (unidades básicas del
DNA) y en qué orden se disponen en dichos fragmentos, lo cual suele ser característico para distintas
especies, poblaciones o individuos. Con estos conceptos básicos, se puede entender a grandes rasgos, el

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fundamento de la secuenciación de primera generación (secuenciación capilar), con la cual se han
logrado los aportes que revisaremos a continuación.

Al elegir una región del DNA para ser secuenciada y usada como marcador de variabilidad genética, se
debe tener en cuenta que atendiendo a la naturaleza biológica de cada región, esta puede ser muy
variable o muy conservada. Las regiones conservadas son casi iguales entre diferentes especies, géneros
familias e incluso jerarquías superiores; mientras que las regiones variables pueden presentar cambios
entre especies, poblaciones e incluso a nivel individual. La selección de los marcadores adecuados
permite reconstruir la relación ancestría/descendencia a diferentes niveles. Para distinguir entre
especies se suele usar la región ITS. Con esta información se pueden abordar preguntas sobre la
identidad de los HCS y su relación con hongos conocidos.

Otras técnicas de BM como RFLP (polimorfismo en los fragmentos de restricción), RAPD (polimorfismos
en amplificación aleatoria) o SSCP (polimorfismo conformacional monocatenario) fueron populares por
su fácil aplicación, posibilidad de analizar muestras compuestas e independencia de la necesidad del
conocimiento previo sobre el DNA de la muestra (Rasmussen y Morrissey, 2008). Sin embargo, la
secuenciación capilar presenta un mayor poder de resolución y menor probabilidad de error, ya que
ofrece una cantidad mucho mayor de información y con mayor versatilidad para su análisis. Para resolver
preguntas relacionadas con la caracterización de las comunidades fúngicas, el manejo ecológico o la
cuantificación in situ, se han empleado técnicas de BM como la qPCR (PCR cuantitativa; =PCR en tiempo
real), rtPCR (PCR retrotranscrita), microarreglos y secuenciación masiva (NGS; =de siguiente generación;
que incluyen pirosecuenciación, secuenciación por síntesis en paralelo, entre otras), las cuales
trataremos someramente. Para profundizar en el entendimiento de los fundamentos biológicos de las
técnicas, su desarrollo histórico y su impacto, se recomienda acudir a recursos especializados (ej: Mullis
et al., 1994; Alberts et al., 2008; Green y Sambrook, 2012; Krebs et al., 2014; Xu, 2014).

Los aportes que se han realizado usando herramientas de BM en lo relativo al aprovechamiento de HCS
podrían agruparse en: el reconocimiento de la identidad específica de los HCS; el reconocimiento de su
distribución; el descubrimiento y descripción de especies nuevas o variedades; la discriminación entre
especies aprovechables y sus afines de menor calidad o peligrosas; la discriminación entre especies con
propiedades culinarias distintivas; y la trazabilidad alimentaria. No obstante, existen otra serie de
aportes en el aprovechamiento de hongos silvestres, como la cuantificación y predicción de la
productividad de hongos de un paraje, el reconocimiento de las especies responsables de intoxicaciones,
y el reconocimiento del potencial de cultivo o propagación de algunas especies.

La biología molecular en la identificación y descripción de especies de hongos comestibles silvestres

Reconocer y nombrar los recursos micológicos locales es una capacidad ampliamente desarrollada por
los conocedores tradicionales en sus localidades (Guzmán, 1997; Moreno-Fuentes, 2014). Sin embargo,
la ciencia occidental se ha encontrado con algunos obstáculos al tratar de equiparar los saberes locales
con la nomenclatura científica de las especies. Uno de los objetivos de los sistemas de clasificación
modernos es la homogeneización de los nombres asignados a los taxa, indistintamente de la región en la
que se encuentren (Linneo, 1735-1778; Herbert y Gregory, 2005). Inicialmente los conceptos de especie
en macromicetos estuvieron basados en la morfología (macro- y microscópica) de las estructuras
reproductivas. Como un efecto indeseado, se ha incurrido en el error de utilizar un mismo nombre,
generalmente europeo, para distintos taxa, lo cual es particularmente notorio para los hongos
neotropicales. Sin embargo, actualmente se usan conceptos filogenéticos que se basan en las relaciones
de ancestría/descendencia de los organismos, por lo que estos conceptos son más restrictivos. Por lo
tanto los conceptos de las especies son más estrechos y típicamente las especies morfológicas pueden
contener varias especies filogenéticas.

Si ignoras el nombre de las cosas, desaparece también lo que sabes de ellas…

(Linneo, 1735).

En América se distribuyen una gran variedad de especies de HCS; algunas muy similares a sus relativas
europeas, como por ejemplo las especies del género Boletus y afines (en México conocidas como
panzas, en EEUU como boletus, y en Europa como porcini), las especies del complejo Cantharellus
cibarius (duraznillos, chantarelles o rebozuelos), las especies del complejo Amanita caesarea (yemas,
Caesar's mushroom u oronjas) y las especies del género Morchella (morillas, morels o colmenilla)
mismas que son susceptibles de aprovechamiento y tienen importantes valores culinarios (Boa, 2004).
Utilizando herramientas de BM se han logrado identificar especies nuevas, definir algunas de mayor
potencial de aprovechamiento, y también, identificar especies de distribución transcontinental. Esto ha
permitido aprovechar especies consumidas tradicionalmente, tanto de manera local, cómo en el
mercado internacional, nombrarlas y proponer estrategias de manejo sostenible basadas en la biología
particular de dichas especies (e. g. Nuytinck et al., 2007; Arora, 2008a; Arora y Dunham, 2009).

La gran mayoría de los HCS son hongos ectomicorrízicos (HEM) y no son cultivables debido a su
necesidad de un simbionte vegetal. Las plantas usan a los HEM como adaptaciones para la explotación

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del suelo en regiones templadas y boreales (Martin et al., 2016), por lo que solemos encontrar este tipo
de hongos principalmente en los bosques. Dada su naturaleza simbiótica, los procesos de diversificación
de los HEM ocurrieron de la mano a la diversificación de sus plantas hospederas, principalmente en los
periodos Eoceno y Cretácico tardío (Ryberg y Matheny, 2011). En esos momentos geológicos la
disposición de las grandes masas continentales era adyacente. La posterior separación de las placas
propició que los linajes supraespecíficos de HEM se distribuyan en varios continentes actuales, no
obstante, los taxa infragénericos suelen tener distribuciones continentalmente endémicas, lo que ha sido
documentada para varios géneros de HCS (e. g. Richard et al., 2015; Sánchez-Ramírez et al., 2015) por lo
tanto es imprescindible describir y nombrar las especies endémicas de HEM, principalmente para las
regiones tropicales, ya que están menos estudiadas que el hemisferio norte.

Se pueden mencionar varios ejemplos en donde se usaron secuencias de DNA de una o varias regiones
para esclarecer la identidad de hongos que habían sido nombrados como a sus parientes europeos, o en
el mejor de los casos, considerados como integrantes de un complejo de especies no resuelto.

Un claro ejemplo del aporte de la BM a la taxonomía de HCS, es el realizado por Arora y Frank (2014),
quienes reinterpretaron varias especies anteriormente situadas en el género Boletus sección
Appendiculati, y además, describieron otras seis especies nuevas para construir todo un nuevo género
integrado por los hongos conocidos como boletus de mantequilla. El nuevo género Butyriboletus ahora
está constituido por 14 especies, las cuales fructifican en bosques de Abies, Pinus, Pseudotsuga y
Quercus, con distribuciones en países africanos, asiáticos, europeos, así como en Estados Unidos y
México. Algunas de estas especies, como Butyriboletus roseoflavus, representan un apreciado recurso
culinario, en China son recolectados a escalas masivas, y tienen mercado internacional (Arora y Frank,
2014). Para la designación del nuevo género se utilizó taxonomía integrativa (datos macro- y
microscópicos en integración con datos moleculares), con dos regiones (ITS y LSU).

En los bosques de California abundan HCS, inicialmente reportados como B. aereus, B. mottii y B. edulis.
Posteriormente se puso en evidencia que en realidad se trata de seis taxa, tres de ellos nuevos para la
ciencia (ver adelante), pero no para los pobladores locales, micofílos por su ascendencia italiana o
asiática, quienes conocían y aprovechaban estos recursos fúngicos (Arora, 2008a). Se encontró también
que a lo que se le llamó originalmente B. aereus, realmente son dos especies aparentemente similares,
pero con características ecológicas y organolépticas contratantes. Una de ellas es B. regineus (propuesta
y descrita en dicho estudio) y la otra B. barrowsii, emparentadas entre ellas y cuyos relativos más
cercanos son especies mexicanas y de la costa oeste norteamericana. Boletus barrowsii, con su hábito

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termófilo, presenta un aroma y sabor más destacado que otras especies mesófilas como B. edulis o B.
pinophilus. Sin embargo presenta fructificaciones esporádica o raras. Estas características lo han
convertido en uno de los HCS más apreciadas de la zona y con altos precios en el mercado. Mientras que
B. regineus fresco, presenta sabor muy suave, y un ligero aroma al secarlo. Dentro de lo reportado como
B. mottii, efectivamente hay representantes de esta especie, pero también otros que pertenecen a B.
fibrillosus. Por otra parte, dentro de lo reportado como B. edulis, o posteriormente B. pinophilus,
encontraron tres taxa, uno de ellos fue B. mottii, el segundo, la especie nueva B. rex-vires. Ésta última, es
la especie más apreciada en el oeste de Norteamérica, ya que, posee un aroma y sabor suaves, produce
grandes y muy abundantes esporomas; además, tolera considerablemente mejor el maltrato producido
por el transporte, la refrigeración y la congelación, lo que le otorga una gran ventaja para su
comercialización y distribución. Los autores también proponen B. edulis var. grandedulis, poniendo en
evidencia que dentro del amplio concepto ecológico y morfológico de B. edulis se incluyen los ejemplares
de distribución californiana y mexicana. Aunque estos se distinguen por la coloración café-canela de los
poros al madurar, esporomas generalmente más grandes y robustos, y una superficie del píleo pálida a la
sombra y café-rojiza o café-amarillenta obscura en sitios de dosel abierto (Arora, 2008a).

Posteriormente se propuso el origen Indo-Malayo de lo que se reconoce como el clado porcini s.l., en el
que se incluyen cinco clados; “Inferiboletus”, “Alloboletus”, “Obtextiporus”, el clado porcini s.s. y un
clado de especies asiáticas provisionalmente nombrado “Orientiboletus” (Feng et al., 2012). El clado
porcini s.s. está compuesto por 19 filoespecies (Fang et al., 2012), incluye las cuatro especies que
tradicionalmente integraron el complejo B. edulis (B. edulis, B. pinophilus, B. aereus y B. reticulatus syn.
B. aestivalis) (Singer, 1986); B. varipes con dos filoespecies; B. quercophilus restringido a Centroamérica y
al menos 12 filoespecies nuevas. Así mismo, se puso en evidencia que B. edulis s.s. es una especie de
distribución transcontinental, aunque restringida al hemisferio norte (Fang et al., 2012).

De manera similar, es común encontrar el nombre Cantharellus cibarius asignado a cualquier

Cantharellus amarillo por todo el mundo, incluso se presume que éste es el nombre más comúnmente
mal aplicado fuera de Europa (Eyssartier y Buyck, 2001). Cantharellus cibarius fue descrito originalmente
de bosques de coníferas en Francia y otras regiones de Europa. Sin embargo, la presencia en América de
esta especie no se ha podido corroborar con herramientas de BM (Dunham et al., 2003; Arora y
Dunham, 2009; Buyck y Hofstetter, 2011). Usando patrones de RFLP, además de secuencias de ITS y LSU,
y datos macro- y micromorfológicos, se ha evidenciado la errónea aplicación del nombre C. cibarius a un
grupo simpátrico de especies habitantes de bosques de coníferas californianos, integrado por C.

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formosus, C. subalbidus y C. cascadensis (Dunham et al. 2003). Para los bosques de encinos, usando
taxonomía integrativa, se describió Cantharellus californicus, la especie comestible amarilla/anaranjada
más grande que se conoce, produciendo esporomas que suelen alcanzar 1 kg de peso fresco (Arora y
Dunham, 2009). Esta especie se puede distinguir por su himenio evidentemente poroso al alcanzar la
madurez, aunque ésta suele tardar de 3 a 8 semanas en llegar; no se mancha de color ocre o anaranjado
al tacto (como C. cibarius var. reseocanus); tampoco presenta esa capa fibrosa grisácea (propia de C.
fumosus, otra especie con la cual se le suele confundir). Es un hongo que se ha considerado menos
apreciado que C. cibarius por algunos comensales europeos, debido a que prefieren esporomas
pequeños, fáciles de limpiar y de colores más llamativos. No obstante, se reporta una comercialización
en regiones de California cercanas a los bosques de encino, de hasta 23000 kg de C. californicus al año,
con precios que oscilan entre 9 y 22 $USD/kg (directo al recolector) (Arora y Dunham, 2009). Usando el
marcador tef-1, se describieron C. lewisii, C. altipes y C. tenuithrix, de Norteamérica, usualmente mal
nombrados como C. amethysteus, C. cibarius var. longipes y C. cibarius s.s. respectivamente (Buyck y
Hofstetter, 2011). Posteriormente, con análisis filogenéticos usando cuatro regiones de DNA y más de 80
taxa terminales procedentes de varios continentes, quedó claro que el género presenta su mayor
diversificación en los trópicos; que la sección Cibarius es propia del hemisferio norte; y que C. cibarius
s.s. se restringe a Europa (Buyk et al., 2014). Es decir, aunque ese estudio no incluye materiales
neotropicales, es posible afirmar que no hay Cantharellus cibarius en el Neotrópico.

No es difícil reconocer a un representante la sección Deliciosi del género Lactarius. Sin embargo, dadas
las sutiles diferencias morfológicas entre especies, y la influencia que factores ambientales ejercen sobre
algunos de sus plásticos caracteres, como el color y cambio de color del látex y el pileo, o las zonaciones
del mismo, su asignación específica es verdaderamente complicada (Nuytinck et al., 2006; 2007). Lo que
se ha traducido en el mal uso de nombres europeos como Lactarius deliciosus, L. salmonicolor y L.
deterrimus en distintas regiones del mundo. Mediante análisis filogenéticos con dos regiones de DNA,
Nuytinck et al. (2007) investigaron las relaciones de los taxa de varios continentes y su distribución,
también evaluaron la concordancia de las especies definidas por morfología con las especies
filogenéticas. Confirmaron la presencia en América de L. barrowsii, L. indigo, L. miniatosporus, L.
paradoxus, L. pseudodeliciosus, L. rubrilacteus, L. rubriviridis, L. salmoneus, L. subpurpureus y L. thyinos.
También, identificaron que las variedades americanas de “L. deliciosus”, L. deliciosus var. areolatus, L.
deliciosus var. deterrimus y L. deliciosus var. olivaceosordidus no forman un clado monofilético con L.
deliciosus s.s. (Nuytinck et al., 2007). Como ocurre con otros hongos ectomicorrízicos, se presenta un
endemismo a escala continental. Lactarius deliciosus y L. salmonicolor ocurren únicamente en Europa y

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Asia, y los reportes de L. indigo en Asia, fueron confirmados como L. subindigo, ambos casos confirmados
con datos morfológicos (Nuytinck et al., 2007).

La hipótesis de que las especies del género Morchella, son pocas especies y de distribución cosmopolita
fue descartada al detectar su origen cretácico y distribución holárctica (O’Donnell et al., 2011), y
posteriormente evidenciar el endemismo de sus especies a nivel continental (Richard et al., 2015).
Actualmente, se reconoce que el género Morchella está compuesto por 65 filoespecies, de las cuales
únicamente 30 tienen nombre. Morchella esculenta se encontró restringida a Europa, mientras que las
especies exclusivamente americanas son M. angusticeps, M. brunnea, M. diminutiva, M. populiphila, M.
punctipes, M. sceptriformis, M. septentrionalis, M. sextelata, M. snydery, M. tomentosa, M. ulmaria y al
menos otros tres taxa sin nombre. Sin embargo se reporta a M. rufobrunnea, M. americana, M. exima,
M. exuberans, M. importuna y M. tridentina como de distribución transcontinental (Richard et al., 2015).

El complejo de especies Amanita caesarea es por algunos considerado como el hongo más sabroso del
mundo. Este linaje tuvo su origen entre el Paleoceno y el Eoceno en las regiones tropicales del viejo
mundo, con eventos de dispersión a climas templados y fríos de varios continentes durante el Mioceno
tardío y el Plioceno, llegando a América vía El Estrecho de Bering (Sánchez-Ramírez et al., 2015), donde
seguramente alimentó a los ancestros nómadas de las poblaciones humanas americanas originales. Este
complejo de especies es muy diverso en México (Guzmán y Ramírez Guillen, 2001) y presenta una mayor
diversificación en el continente americano que en el viejo mundo, con cerca de 27 especies desde
Canadá hasta Costa Rica, algunas de las cuales aún esperan por ser descritas (Sánchez-Ramírez et al.,
2015). En México se puede encontrar a A. basii, A. cochiseana, A. belizeana, A. tlaxcandela, así como taxa
afines a A. jacksonii, A. hayalyuy y al menos un taxón sin nombre. Mientras que A. calyptroderma, A.
calyptratoides y A. jacksonii, son especies norteamericanas y A. caesarea s.s. es estrictamente europea
(Sanchez-Ramirez et al., 2015).

Rodeado de leyendas, magia y tradición, el hongo de mosca, es probablemente el hongo no comestible

con mayor valor cultural en México (Ramírez-Terrazo et al., 2014) y en el mundo (Michelot y Melendez-
Howell, 2003). El complejo A. muscaria, se compone de tres linajes principales y con distribuciones
disjuntas; el euroasiático, el euroasiático-alpino y el americano (Oda et al., 2004). Estos linajes presentan
diferencias morfológicas y en coloración, así como en cuanto a sus propiedades psicoactivas. Se postula
que el origen del linaje fue Alaska, donde representantes de los tres grupos se distribuyen de manera
simpátrica (Geml et al., 2006). Actualmente presentan una muy marcada estructura geográfica y niveles
de endemismo asociados a climas y hospederos restringidos (Geml et al., 2008).

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Dentro del género Amanita, hay representantes tanto simbióticos como saprobios, también los hay
comestibles, enteógenos, de toxicidad leve e incluso letales (Michelot y Melendez-Howell, 2003; Hess y
Pringle, 2014). En la sección Phalloideae del género Amanita se concentran varias especies blancas
conocidas por su toxicidad mortal, y por las muertes que producen alrededor del mundo (Graeme,
2014). Usando análisis filogenéticos y datación molecular con cinco marcadores de DNA, se detectó que
dentro de la sección Phalloideae existe un linaje al cual los autores se refieren como “las amanitas
letales”. Este linaje se compone por 28 especies con toxicidad letal (Cai et al., 2014). Dicha toxicidad está
dada por la presencia de amatoxinas y phalloidina (péptidos cíclicos), como sinapomorfía para este
clado. Ahí, se insertan especies de píleo blanco, aunque también, algunas de coloraciones grisáceas
como A. fuliginea o amarillentas como A. subjunquillea, y con 4 o 2 esporas por basidio. También, se
excluyeron algunas amanitas blancas que habían sido consideradas tóxicas por su similitud morfológica,
pero que no se integran en el clado ni presentan las toxinas como A. virgineoides (Cai et al., 2014). Es
decir, cualquier ejemplar, aunque sea desconocido, de insertarse en el clado de las “amanitas letales”
tras un análisis filogenético, será considerado potencialmente mortal, ya que por su relación de ancestría
debe presentar amatoxinas y phalloidina.

Con estos ejemplos sobre algunos de los HCS más emblemáticos, hemos visto cómo las herramientas de
BM han permitido partir del conocimiento tradicional sobre especies aprovechables de manera regional,
hacer distinciones con prácticas similares de otras regiones del mundo, y así identificar las especies de
mayor potencial para su comercialización, equiparar estrategias de propagación, reconocer especies que
deberán ser evitadas atendiendo a su toxicidad potencial, o simplemente no esperar las mismas
propiedades químicas u organolépticas de los linajes europeos en los americanos.

Los marcadores moleculares y los hongos de mayor importancia económica

Para realizar los aportes al estudio de los HCS que hemos mencionado, fue necesaria la integración de
varios campos del conocimiento: el conocimiento tradicional y local, la importancia comercial, la
taxonomía morfoanatómica, y en algunos casos la caracterización química. Pero en concordancia con el
objetivo de este capítulo, haremos énfasis en los datos de biología molecular.

De manera general se utilizan secuencias de DNA de un marcador seleccionado por su poder de

resolución para discriminar entre especies, para macromicetos, el marcador más utilizado es la región de
los interespaciadores transcritos ribosomales (ITS). El ITS es una región repetitiva de DNA, situada en el

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genoma nuclear, que codifica para una pequeña sección del ribosoma (nrDNA). El ITS fue seleccionado
como código de barras de la vida para los hongos (Schoch et al. 2012). Este se suele amplificar usando el
par de primers ITS1F-ITS4 (Gardes y Bruns, 1993), generando amplicones de alrededor de 700 pb, que
abarcan una pequeña parte del LSU (subunidad grande ribosomal), las regiones ITS1, 5.8S e ITS2
completas, y una pequeña sección del SSU (subunidad pequeña ribosomal). Tanto la región ITS1 como
ITS2 no codifican para proteínas, su función biológica es la de separar las subunidades ribosomales y
participar en la maduración de los transcritos aunque no forman parte del ribosoma. En contraste, la
región 5.8S sí forma parte del RNA ribosomal en estado maduro. Estas características propician que las
regiones ITS1 e ITS2 soporten muchas mutaciones puntuales sin que su función biológica se altere,
mientras que la región 5.8S debe mantenerse sin grandes cambios para conservar su función (Nilson et
al., 2008; Peay et al., 2008). Esto convierte al marcador ITS en una región que soporta un buen número
de cambios, pero que se puede alinear con una región central que actúa como anclaje, además de estar
presente en todos los hongos (Schoch et al., 2012). El ITS está flanqueado por regiones conservadas (las
subunidades grande y pequeña del ribosoma), lo que permite diseñar primers universales para amplificar
representantes de varios fila. Otra ventaja del ITS es el gran número de copias por cada núcleo, lo que lo
hace más fácil de amplificar por PCR (Peay et al., 2008).

Los códigos de barras de la vida se componen de una secuencia de DNA (para hongos la región ITS)
respaldada por un ejemplar voucher bien identificado y depositado en una colección biológica
reconocida; fotografías taxonómicas y datos de recolecta. Los datos que se toman in situ son:
hospedero/vegetación, fotos de campo, fotos taxonómicas, coordenadas y elevación.

Para secuenciar la totalidad del ITS, se utilizan dos secuencias para la misma región, una de ellas, la
frontal, va desde el inicio y se extiende en el mismo sentido del marcador cerca de tres cuartas partes de
su longitud, mientras que la segunda, la reversa, inicia al final del ITS y se extiende en antisentido por la
misma longitud. Al ensamblar estas dos secuencias se logra una mayor cobertura del marcador, además
de permitir la edición de los sitios dudosos o de menor calidad para cada secuencia. El resultado es una
secuencia consenso, y es lo que se encuentra más comúnmente en las bases de datos.

Además del ITS, se suelen usar en filogenia de hongos otros marcadores como: LSU (=28S, subunidad
grande del ribosoma), SSU (=18S, subunidad pequeña del ribosoma), ef1-α (=tef1, factor alfa de
traducción elongación), rpb1 (subunidad grande de la RNA polimerasa 2), rpb2 (subunidad 2 de la RNA
polimerasa 2) y β-tubulina (gen β-tubulina) (Schoch et al., 2012; Cai et al., 2014; Sánchez-Ramírez et al.,
2015). Se pueden usar para este fin los códigos de barras de la vida aunque estos no tienen la intención

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principal de reconstruir la historia evolutiva de los linajes (filogenia); sino más bien son una herramienta
diseñada para reconocer o discriminar entre especies (Herbert et al., 2003; Ratnasingham y Herbert,
2007; Schoch et al., 2012). Por estos motivos, se han hecho importantes esfuerzos por diseñar primers y
códigos de barras de la vida de HCS, lo cual es notorio principalmente en Asia (e.g. Mello et al., 2006; Cai
et al., 2012; Li et al., 2013; Khaund y Joshi, 2014; Su et al., 2016), dado el agrado por estos productos
comestibles de difícil reconocimiento pero amplia comercialización. Por ejemplo, con códigos de barras
de la vida Lim et al. (2003) compararon las especies de hongo blanco de pino que crecen en América con
las que crecen en Japón y Corea del sur. Con estos datos reafirmaron que el hongo blanco de pino
(Tricholoma magnivelare) no es el matsutake japonés (T. matsutake). Posteriormente Trudell et al.
(2017) determinaron que en Norteamérica este complejo en está formado por tres especies: T.
murrillianum en la costa oeste de Canadá y Estados Unidos, T. magnivelare en la costa este de Canadá y
Estados Unidos y T. mesoamericanum en el centro y sureste de México. Por lo tanto, al tener distintos
nichos ecológicos, las estrategias de manejo y conservación deben ser específicas para cada una de estas
especies. La comercialización de este grupo de hongos, en particular T. matsutake, generó en Yunnan,
China, el desarrollo en la economía local, ya que sus exportaciones hacia Japón generaron más recursos
que cualquier otro producto agrícola o forestal, permitiendo a los pobladores locales construir grandes y
bonitas casas con la tradicional arquitectura local, así como comprar vehículos y equipamiento para los
negocios de prácticamente todas las familias del pueblo (Arora, 2008b).

Además de permitir conocer la distribución geográfica o afinar la delimitación de especies, los códigos de
barras son una herramienta práctica para evitar o detectar el comercio de productos apócrifos. La
trazabilidad de alimentos ha sido ampliamente desarrollada para los productos alimenticios marinos,
mismos que pierden sus características morfoanatómicas al ser procesados o empacados. Se ha
detectado una substitución de especies del 37% para el pescado y el 13% para otros productos marinos
en el comercio internacional (Rasmussen et al., 2011). Algunos ejemplos de sustitución son el salmón de
granja remplazando el salmón silvestre, aletas de mantarraya por escalopes o abadejo de Alaska por
bacalao (Rasmussen et al., 2011). Estas prácticas pueden ocurrir en cualquier etapa de la cadena de
comercialización, y tener efectos ecológicos sobre poblaciones protegidas o amenazadas, la perdida de la
denominación de origen, sobre el estado de salubridad de los productos, o sobre la confianza y
salubridad de los consumidores.

La industria de los suplementos alimenticios también se encuentra retada por problemas similares,
principalmente debido a que los productos se comercian pulverizados y sin características morfológicas

12
útiles para su identificación, lo que ha sido documentado para productos herbolarios (Cowan y Fay,
2012; Ivanova et al., 2016). Suplementos alimenticios fabricados a partir de hongos son consumidos
principalmente por sus atribuciones antioxidantes, anticancerígenas y inmunopotenciadoras (Wasser et
al., 2000). Para combatir la sustitución de especies en este tipo de productos Raja et al. (2017) usaron
códigos de barras de la vida en suplementos alimenticios y medicinales de origen fúngico. Encontraron
que sólo el 30% de los productos contienen la especie indicada en su etiqueta, identificando
sustituciones de B. edulis por B. shiyong; Cordyceps sinensis por Inonotus sanghuanh o Tolypocladium
inflatum; Ganoderma ludicum por G. sichuanense o G. resinaceium; Inonotus obliquus por Cladosporium
sp. y Phellinus linteus por Inonotus sanghuang (Raja et al., 2017).

Los porcinis (Boletus edulis s.l.) son un complejo de especies recolectado y consumido en todo el mundo.
Se ha reportado la presencia de proteínas inductoras de alergia mediada por IgE en B. edulis s.l.
(Helbling, et al., 2002), no obstante para dicho estudio no se incluyó una buena identificación de los
materiales, por lo que sus resultados no se pueden atribuir a un taxón particular o a todo el complejo.
Para identificar a los hongos comerciados bajo la etiqueta de B. edulis s.l. Mello et al. (2006) diseñaron y
probaron primers específicos para B. aereus, B. aestivalis, B. edulis y B. pinophilus, todos pertenecientes
al complejo B. edulis, además también diseñaron un juego de primers específico para B. violaceofuscus,
ya que es común encontrarlo sustituyendo a B. edulis s.l.

Indiscutiblemente, los hongos que han alcanzado precios más elevados y mercados más demandantes
son las trufas (Boa 2004; Zambonelli y Bonito 2012; Zambonelli et al., 2016). Las llamadas “trufas
verdaderas” pertenecen al género Tuber, mismo que tiene representantes prácticamente en cualquier
bosque templado y boreal del hemisferio norte (Bonito et al., 2013). Sin embargo, solo algunas especies
europeas como Tuber magnatum o T. melanosporum, presentan las características organolépticas a las
que se atribuye el aroma y sabor que les ha hecho alcanzar precios de $3000 USD/kg. Además, incluso
entre las trufas más valoradas, hay marcadas diferencias en sus características y precios, lo cual atiende a
la región en la que se coseche, lo que va de la mano con la distribución y nicho de las distintas especies
(Boa 2004; Zambonelli y Bonito 2012; Zambonelli et al., 2016). Dadas las limitadas características
morfoanatómicas que las trufas presentan para su discriminación específica, se propusieron códigos de
barras útiles para el mismo fin. Estos códigos de barras son capaces de discriminar la especie y
procedencia de las trufas utilizando pequeños motivos de 50 pb dentro del ITS y algoritmos sencillos
como alineamientos o BLAST (el Karkouir et al., 2007). Del mismo modo, se ha usado la genotipificación
por encimas de restricción de amplicones del ITS, lo que ha permitido diferenciar a la valorada T.

13
melanosporum, con dos bandas al ser digerido por Rsa 1, contra tres bandas propias de T. indicum, una
de las trufas encontradas más comúnmente en sustitución de la primera (Paolocci et al., 1997).

Flujo de trabajo para la generación de secuencias de DNA de hongos comestibles silvestres y su uso en
identificación, filogenia y ecología

A continuación, presentamos el flujo de trabajo que permite generar secuencias de DNA, para ser usadas
en la identificación específica, el planteamiento de hipótesis filogenéticas, la descripción ecológica y el
manejo/aprovechamiento sustentable de HCS (Figura 1). Estos protocolos los hemos usado con éxito
para generar secuencias de DNA de esporomas, ectomicorrizas, hojas, raíces y suelo, para usarlas en
distintas aproximaciones a la sistemática, la ecología y el aprovechamiento de hongos silvestres
(Garibay-Orijel et al., 2013; Nguyen et al., 2013; Kong et al., 2015; Ángeles-Argáiz et al., 2016; Mata et
al., 2016; Álvarez-Manjarrez et al., 2016; Argüelles-Moyao et al., 2017; Baeza-Guzmán et al., 2017). Las
modificaciones a los protocolos originales propuestos por los proveedores de los distintos kits, permiten
multiplicar el rendimiento de los mismos, reduciendo costos e incrementando la cantidad de información
obtenida. Se sugiere acudir a recursos especializados y a los protocolos originales de las distintas técnicas
(e.g. Green y Sambrook, 2012).

(INSERTAR FIGURA 1)

¿Cómo y para qué usar secuencias de DNA?

Dependiendo de cuál es la pregunta de investigación que se desea responder, o cuales son los objetivos
perseguidos, se deberá escoger una de las rutas de trabajo aquí sugeridas (Figura 1). Si las secuencias de
DNA serán usadas para la identificación de las especies o la discriminación taxonómica, se optará por la
generación de códigos de barras a partir de ejemplares voucher. Se usará secuenciación Sanger por
electroforesis capilar del marcador ITS completo, la secuencia se depositará en GenBank y/o en el BOLD
systems acompañada por los datos ecológicos y taxonómicos requeridos. Los resultados se analizarán
con muy bajos costos computacionales (velocidad de procesamiento y cantidad de datos almacenados)
mediante el algoritmo BLAST, contra las bases de datos públicas disponibles. Si las secuencias serán
usadas para hacer inferencias filogenéticas, se siguen las mismas estrategias de secuenciación y

14
muestreo, aunque es recomendable secuenciar varios marcadores de DNA. Es importante considerar
que los análisis filogenéticos robustos suelen tener costos computacionales más elevados.

Cuando el interés es la descripción ecológica, o el diseño de estrategias de manejo se pueden seguir

varias rutas, todas ellas involucran la secuenciación de un número mayor de muestras. Los materiales
podrán ser ejemplares voucher (hongos secos integrados a una colección científica), o muestras
ambientales (ectomicorrizas, suelo u otros sustratos). En este caso se puede optar por secuenciar
independientemente varias muestras simples, cada una de las cuales representara a una muestra
individual; o usar secuenciación masiva para una muestra compuesta, la cual representa una comunidad
entera. Las muestras pueden ser compuestas desde el momento de su recolecta, como por ejemplo una
muestra de suelo, o puede hacerse una mezcla de varias muestras individuales, por ejemplo todas las
ectomicorrizas disectadas de una parcela, sitio o región. Cuando el número de marcadores y ejemplares
es muy alto, también puede ser conveniente secuenciarlos en paralelo, integrando una muestra
compuesta y etiquetada. La decisión de construir una muestra compuesta se toma siguiendo criterios
económicos y de costo beneficio.

Siguiendo este flujo de trabajo y usando estos protocolos, cada secuencia consenso tiene un costo en un
rango de $250 a $500.00 mx. En la mayoría de los casos es más costeable pagar el servicio de
secuenciación externo. En estos casos cada reacción de PCR limpia y lista para ser secuenciada habrá
costado alrededor de $100.00 mx. En estos cálculos se consideran la extracción de DNA sencilla, PCR,
electroforesis, limpieza, y en el primer caso, la reacción de secuenciación y secuenciación Sanger en dos
sentidos. En esta cuenta, es necesario incluir en los cálculos que sólo entre el 50 y 90 % de los materiales
se logran amplificar adecuadamente (dependiendo del tipo y calidad e la muestra) y que de estas
muestras no se logra obtener secuencias de calidad en todas. Por lo tanto el porcentaje de éxito en la
secuenciación puede variar entre el 50 y 75%. Este porcentaje puede aumentar al ensayar variaciones en
los protocolos de PCR y de extracción, lo que también tiene impacto sobre el costo total del proyecto.

Material biológico

Esporomas

Idealmente los esporomas son recolectados directamente de sus áreas de distribución, sin embargo, en
muchas ocasiones el material es comprado en mercados o traído a nosotros como un encargo especial
por parte un colaborador local. Es necesario seleccionar ejemplares sanos, sin evidencia de micofagia ni

15
descomposición (Cifuentes et al., 1986; Lodge et al., 2004). Los ejemplares agusanados, maltratados o
podridos no sirven para este fin, pues contienen altas concentraciones de DNA contaminante, lo cual se
traduce en múltiple señal en la amplificación por PCR y/o secuencias con bases ambiguas.

Secar correctamente el material permite obtener DNA genómico integro, es decir, de alto peso
molecular y en altas concentraciones. No secar rápidamente el material, propicia que el DNA se degrade
por la acción natural de la maquinaria celular, particularmente de las enzimas DNAsas. Secar el material
por mucho tiempo o a temperaturas muy elevadas degrada el DNA por su propia inestabilidad
molecular. Se debe secar el material lo más pronto posible y a una temperatura que no exceda los 60 °C,
y por un lapso no mayor a 24 hrs. Un termómetro casero tiene la precisión suficiente para este fin.

En algunas ocasiones no es posible transportar los materiales completos, por motivos de espacio,
presupuesto o políticas aduanales. En esos casos se recomienda fijar el DNA en OH 96% o siguiendo el
protocolo Whatman FTA Cards (Sigma-Aldrich).

Ectomicorrizas

Cuando se desea conocer la riqueza total de un sitio, es preferible obtener muchas muestras pequeñas y
separadas que pocas muestras grandes (Izzo et al., 2005). La recolección de ectomicorrizas puede ser
sistemática o dirigida. En el muestreo dirigido, se selecciona una planta y a partir del tronco, con ayuda
de una pala de mano, rastrillo y brocha, se siguen las raíces hasta encontrar las raíces finas, a partir de
las que se desarrollan las ectomicorrizas (Kennedy et al., 2011); no obstante, es importante corroborar la
identidad de la planta mediante secuenciación. También se puede buscar directamente debajo de un
esporoma de un HEM (Álvarez-Manjarrez et al., 2016). En el muestreo sistemático se trazan transectos o
cuadrantes, y se insertan núcleos para tomar la muestra. Los núcleos se toman con un cilindro de PVC
(30 cm de largo y 2.5 cm de ancho) cortado en diagonal de un extremo (para introducirlo en el suelo) y
con un agujero en el otro extremo en donde se introduce un clavo o laso para retirarlo fácilmente). El
núcleo se entierra con la ayuda de un martillo de goma. Se debe retirar el mantillo y la hojarasca antes
de tomar la muestra. Las muestras se guardan por separado en bolsas de cierre hermético para
posteriormente ser almacenadas a 4° C por no más de una semana (Kennedy et al. 2011). Atendiendo a
la pregunta de investigación y a las características del paisaje, se pueden realizar distintos diseños de
muestreo (e.g. Argüelles-Moyao, 2013; Álvarez-Manjarrez, 2014; García-Guzmán, 2014; Baeza-Guzmán,
2015; Leyva-Morales, 2017).

16
Una vez en el laboratorio, se procede a la disección del material. La muestra se coloca sobre un par de
tamices (2 mm y 0.85 mm de apertura de la maya) y se enjuaga con abundante agua destilada fría.
Manualmente y con sutileza se desbaratan los agregados de suelo hasta dejar las raíces limpias. Estas se
observan bajo el estereomicroscopio. Las ectomicorrizas de aspecto turgente con manto y ramificaciones
se seleccionan y almacenan en agua fría. De no hacer la extracción de inmediato se deberán fijar en OH
96% o CTAB (Brundrett et al., 1982; Agerer, 2002).

Suelo

Las muestras de suelo se suelen tomar usando pequeños núcleos de PVC de 5 x 5 cm, retirando el
mantillo y la hojarasca, así como las raíces y rocas (Tedersoo et al., 2014), y siguiendo los mismos
criterios de diseño de muestreo que para las ectomicorrizas. Las muestras de suelo se depositan en
bolsas de cierre hermético y se deben secar inmediatamente sin calor. Esto se hace a temperatura
ambiente con la ayuda de envoltorios de silica gel mismos que se deberán reemplazar una o varias veces
al día hasta retirar la humedad de la muestra. El suelo mal secado permite la proliferación de bacterias y
mohos, lo cual eliminará la representatividad de la comunidad natural en la muestra. Ya que este tipo de
muestra será secuenciado mediante NGS, la contaminación cruzada es el riesgo principal y deberá ser
evitado. En el campo, para evitar la contaminación, las botas y todos los instrumentos deben ser lavados
con cloro y alcohol para eliminar la contaminación del sitio anterior y del camino, se recomienda usar
siempre núcleos nuevos, o en su defecto lavarlos con cloro y alcohol. Al tomar la muestra se deberán
usar guantes de látex o nitrilo nuevos por cada sitio. Los envoltorios de sílica gel se cambiarán en una
campana rústica, hecha con una caja grande de plástico transparente par evitar la contaminación.

Métodos de laboratorio

Extracción de DNA

Existen muchos protocolos de extracción de DNA, todos coinciden en algunos pasos fundamentales,
como la lisis celular, la eliminación de lípidos, carbohidratos y proteínas, y la estabilización y preservación
del DNA. En general existen dos tipos de extracción, una que incluye la purificación del DNA mediante
columnas de afinidad, y la otra es una extracción sencilla sin purificación. La decisión de optar por alguno
de estos dos protocolos se basa en los objetivos de la investigación y en el balance costo beneficio.

El protocolo de extracción sencilla que aquí recomendamos (XNAP Sigma) permite extraer 96 muestras
en 2-3 horas, obteniendo DNA en solución listo para hacer PCR (Protocolos E1 y E2). En contraste, el uso
de columnas se recomienda en muestras de interés especial, muestras viejas, compuestas, o conflictivas.

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El protocolo de columnas que aquí recomendamos permite extraer 18 o 24 muestras (dependiendo de la
capacidad de la centrifuga) en 3-4 horas. Los protocolos de purificación por columnas producen DNA en
solución de alta calidad, pureza y concentración; sin embargo, son más costosos y consumen más
tiempo, además, requieren mayor infraestructura para su desempeño (Protocolos E3 y E4).

La presencia e integridad del DNA en una extracción puede comprobarse mediante una electroforesis en
gel de agarosa 1% (Protocolo G2). Una buena extracción debe mostrar una banda intensa de alto peso
molecular (muy cerca del pozo). No obstante, es frecuente observar un barrido en el gel, lo que significa
degradación del DNA. Este tipo de muestra es útil para la PCR siempre que se muestre parte del barrido
en tamaños mayores al del marcador por amplificar. Las extracciones sencillas suelen no dar señal en el
gel de electroforesis, pero funcionar en la PCR, por lo que no se recomienda hacer gel de extracción
excepto en casos particulares donde la cantidad e integridad del DNA extraído requiera ser comprobada.

PCR

A partir de la amplificación del DNA por PCR se obtienen altas concentraciones de amplicones de una
misma región para su posterior secuenciación Sanger, o para formar parte de una librería para
secuenciación masiva. La PCR involucra la incubación de la reacción a tres temperaturas. La primera
(desnaturalización) separa la doble cadena de DNA y es la misma para cualquier PCR. La segunda
(alineamiento) permite a los primers alinearse a la región complementaria del DNA templado para la que
están diseñados. Esta temperatura es variable, y se define experimentalmente mediante una PCR de
gradiente, en la que el rango va de la temperatura óptima de alineamiento de un primer a la del otro. La
tercer temperatura (extensión) es en la que la enzima polimerasa usada presente su mejor desempeño,
esta temperatura es generalmente señalada por el proveedor. Las enzimas pierden su eficiencia
gradualmente después de un cierto número de ciclos de extensión (o tiempo de almacenamiento), este
número también es señalado por el proveedor, aunque generalmente pueden trabajar hasta 45 ciclos.

Las temperaturas, sitios de unión al DNA y secuencia de los principales primers usados para hongos
pueden ser consultados en: https://unite.ut.ee/primers.php; http://aftol.org/primers.php;
http://www.clarku.edu/faculty/dhibbett/Protocols_Folder/Primers/Primers.pdf;
http://biology.duke.edu/fungi/mycolab/primers.htm;
http://nature.berkeley.edu/brunslab/tour/primers.html.

En cualquier PCR es imprescindible el uso de controles negativo y positivo. El control negativo (C-) es una
reacción de PCR sin DNA (con agua para igualar el volumen). El control positivo (C+) es una PCR en la que

18
se usa DNA conocido y que ha demostrado que amplifica bajo esas condiciones y con esos primers. Se
sugiere hacer el C+ con un champiñón fresco siguiendo el protocolo E1 y diluyendo el DNA con dH2O en
una proporción 1:10 (DNA:H2O). Los controles permiten evaluar el resultado de la PCR. La PCR tiene
éxito si el C- no presenta amplificación y el C+ presenta una sola banda de buena intensidad al ser
observadas en un gel de electroforesis (Protocolo G1). Si el C- amplifica, significa que la mezcla maestra o
que alguno de nuestros reactivos o plásticos están contaminados. La contaminación más común es el
producto de otras PCRs, que suele contaminar las micropipetas. Para evitar esto, es muy recomendable
usar un juego de micropipetas para todo lo relacionado con productos de PCR (geles, limpieza etc.), y
otro distinto para los protocolos previos a la PCR (extracción de DNA y hacer la propia PCR). La
contaminación también puede resultar en múltiples bandas en el mismo carril en el gel de electroforesis.

Si el C+ no amplifica, significa que la mezcla maestra está mal calculada o incompleta, que alguno de los
reactivos no está funcionando o que el programa del termociclador es inapropiado. En la PCR las posibles
fuentes de error suelen ser: la inespecificidad de alguno de los primers utilizados, la presencia de
inhibidores de la PCR (ácidos húmicos, alcohol, EDTA, o metabolitos secundarios) la contaminación por
esporas del aire, errores de pipeteo, etc. Si no hay amplificación, lo más probable es que en la reacción
haya inhibidores de la PCR, para lo que se recomienda diluir la extracción en agua destilada en
proporciones 1:10, 1:100 o 1:1000. De este modo encontraremos menos cantidad de inhibidores,
aunque también de DNA, pero con pocas moléculas de DNA es suficiente para una PCR exitosa.

En ocasiones los primers son los causantes de no encontrar amplificación. Aunque hay programas que
permiten hacer predicciones in silico (virtuales o simuladas por computadora), como ya se ha dicho, la
complementariedad de los primers se comprueba experimentalmente mediante PCR de gradiente.
Descargar de las bases de datos públicas secuencias largas de las regiones deseadas y del mismo taxa,
nos permitirá hacer verificaciones in silico de la complementariedad de nuestro juego de primers.
También se puede cambiar de primers por un juego alternativo para la misma región, ya que algunos
taxa en particular pueden no presentar complementariedad hacia un par de primers dado. Por lo que al
cambiarlos se recomienda usar uno específico y uno generalista. Hay varios grupos de hongos
(Cantharellus, Ramaria, etc.) que no amplifican bien con los primers tradicionales, para los cuales se han
diseñado primers específicos para género o familia (e.g. Tedersoo et al., 2008).

Si el problema es la presencia de varias bandas de amplificación en el gel, sospecharíamos de la

contaminación cruzada o ambiental. No obstante, es común que los materiales voucher estén
colonizados por otros hongos y que las ectomicorrizas estén compuestas por varios hongos, o estén

19
siendo degradadas por hongos saprobios. Generalmente los hongos del aire o de muestras enmohecidas
pertenecen al phyum Ascomycota, por lo que el uso de primers específicos para Basidiomycota (e. g. ITS
4B) puede evitar la doble amplificación (siempre y cuando la muestra de interés sea Basidiomycota).
También, es recomendable trabajar en una campana de flujo laminar y evitar el aire acondicionado en el
laboratorio para prevenir contaminaciones por esporas en el aire.

Las enzimas polimerasas comerciales suelen tener un error de amplificación de hasta el 1%, lo que
significa que por cada evento de amplificación pueden sintetizar con 1 base errónea al azar (tipo de base
y posición) por cada 100. Esto no representa gran problema al considerar en gran número de eventos de
amplificación por ciclo y el incremento exponencial en la concentración de amplicones conforme
aumenta el número de ciclos. Sin embargo, cuando la PCR se hace para preparar librerías para
secuenciación masiva, estos errores pueden adquirir relevancia, para lo que se recomienda usar DNA
polimerazas a prueba de errores (Proofreeding). Existen en el mercado algunas enzimas que se
encuentran inhibidas por un anticuerpo anclado a su sitio activo (Hot Start). Esto bloquea su actividad
hasta que este anticuerpo sea retirado mediante un ciclo inicial de alta temperatura (Protocolo A1).
Estas enzimas generalmente resultan en menor cantidad de “ruido” en la secuencia, y se puede trabajar
con ellas sin hielo o sacar del refrigerador por más tiempo sin riesgo.

En algunas ocasiones, cuando la PCR resulta en amplificaciones débiles (baja cantidad de amplicones) el
programa de la PCR puede ser modificado incrementando el número de ciclos hasta un máximo de 45.
También, se puede optar por hacer una PCR anidada. Ésta consiste en hacer una PCR con un juego de
primers externo y posteriormente usar el producto de esta PCR como templado para una segunda PCR,
pero esta vez con un juego de primers internos. Para esto se recomienda usar DNA polimerasa
proofreeding para evitar propagar errores de la polimerasa en la amplificación.

En algunas ocasiones el DNA se encuentra degradado (moléculas de cadena corta), por lo que no se logra
la amplificación de los fragmentos deseados. Para solventar este problema se pueden hacer PCR con
primers internos, que amplifican segmentos cortos al interior del marcador seleccionado (e.g. ITS1-ITS2 o
ITS5-ITS4). Posteriormente, las secuencias resultantes se ensamblan mediante métodos computacionales
para obtener una secuencia consenso completa.

Electroforesis en gel de agarosa

La electroforesis en gel de agarosa es la manera de visualizar los resultados de una extracción de DNA y
de una PCR. Para esto, tradicionalmente se utiliza bromuro de etidio que marca con fluorescencia el DNA

20
bajo la luz ultravioleta. Debido a que se intercala con el DNA, el bromuro es altamente cancerígeno, por
lo que recomendamos sustituirlo por análogos como el Gel Red (Biotium) o Sybr Green (Thermo Fisher
Scientific). Al revelar los geles de electroforesis en un transiluminador es importante hacerlo siempre con
la misma intensidad de luz UV para poder hacer comparaciones veraces entre geles (Protocolos G1 y G2).

Limpieza de los productos de PCR y secuenciación

Los productos de PCR satisfactorios deberán ser purificados previo a la secuenciación, para lo que es
necesario desactivar la polimerasa y eliminarla de la solución, eliminar los oligonucleótidos remanentes
(primers y fragmentos de amplicones y los nucleótidos simples no usados en la reacción). Todo esto con
la finalidad de que no produzcan múltiple señal en la secuenciación (Protocolo L1). La reacción de
secuenciación y la secuenciación dideoxiterminal por electroforesis capilar típicamente se realiza en un
equipo de secuenciación automática como un servicio por parte de un proveedor de secuenciación.

Bioinformática

Las secuencias de DNA constituyen una intersección entre la biología molecular y la bioinformática. Las
secuencias de DNA son simplemente los datos, mismos que deben ser confiables y de alta calidad para
que al analizarse brindar un resultado biológicamente coherente. La falta de edición de las secuencias,
los errores en la edición (Sanger) y la omisión en la limpieza de los datos crudos (NGS) se traduce en
malas interpretaciones de los resultados, generalmente en la sobreestimación de la riqueza o la
construcción de MOTUS ficticios.

Edición de secuencias

El resultado de la secuenciación Sanger es un archivo de extensión "ab1". Se puede abrir con programas
como BioEdit (Hall, 1999); Sequencher (Codes, 2000) o GENEIOUS (Kearse et al., 2012) y contiene la
asignación de nucleótidos y los valores de calidad de cada base en forma de un cromatograma
(=electroferograma). Un cromatograma es la interpretación gráfica de la señal fluorescente detectada
por el secuenciador, en donde cada pico de color representa la presencia de una base nitrogenada en
particular en un sitio determinado. La altura de cada pico representa la intensidad de la señal
fluorescente, que se interpreta como la concentración del nucleótido en esa posición. Sin embargo,
algunas posiciones pueden tener más de una señal, a lo que se le conoce como ruido en la
secuenciación. En ocasiones una posición presenta dos señales claras y de intensidad similar, lo que
suele representar bases heterócigas.

21
Típicamente las primeras y últimas 20 o 30 posiciones de la secuencia (que corresponden a los primers)
son de mala calidad y se eliminan (“trimming”). Otra tendencia general es que la calidad de cada base es
alta al principio de la secuencia, pero después de dos terceras partes, la calidad va disminuyendo. Para
rescatar la mayor cantidad de información posible y obtener secuencias completas y largas se
recomienda secuenciar en dos sentidos. Esto es, hacer una secuencia a partir del primer frontal y otra
(reversa complementaria) a partir del primer reverso. Estas dos secuencias se ensamblan, y cada una
contribuye con información de calidad en las zonas que su complementario es deficiente. El resultado
del ensamble y la edición de la secuencia frontal, con su reversa complementaria es una secuencia
consenso. La secuencia consenso se guarda en formato "fasta", que únicamente contiene el nombre de
la secuencia y las letras; es decir, no contiene un cromatograma ni información sobre la calidad.

En ocasiones, por motivos económicos, se decide secuenciar cada muestra en un sólo sentido, cuando
este es el caso, para la región ITS se secuencia con el primer reverso, ya que de esta manera se obtiene la
región ITS2 completa, la cual ha demostrado mayor eficiencia para la discriminación a nivel de especie
(Bazzicalupo et al., 2013; Tedersoo et al., 2015)

Construcción de Contigs

Cuando se trabaja con muestras ambientales, las secuencias deberán ser agrupadas por similitud
nucleotídica, y cada grupo de secuencias (“contig”) representa un taxa. A estos contigs se les llama
MOTUS (unidades taxonómicas operacionales moleculares). Un MOTU representa (una aproximación)
una especie. Los MOTUS de secuencias de ITS se agrupan, generalmente, a 97% de similitud nucleotídica;
pues esta región típicamente contiene 3% de variabilidad intraespecífica (Ratnasingham y Herbert, 2007;
Peay et al., 2008; Schoch et al., 2012). Sin embargo, la mejor estrategia es usar un criterio particular por
cada grupo taxonómico, ya que algunos géneros tienen más variación intraespecífica que otros en este
marcador (e.g. Cortinarius: Frøslev et al., 2005; Laccaria: Tedersoo et al., 2008). El umbral usado para
agrupar los contigs es crucial en cualquier estudio ecológico o de diversidad, ya que valores laxos o muy
bajos (e.g. 96%) subestiman la riqueza, mientras que valores altos o estrictos (e.g. 99%) la sobrestiman,
llegando al caso extremo en que se considera como una especie a cada geneto (100%). Por lo que es
recomendable explorar umbrales tradicionales (97%) y estrictos (de 97 a 99 %) hasta encontrar uno en el
que el número de contigs y de secuencias que lo integran se mantenga estable, para así poder plantear
una hipótesis de especies más robusta y cercana a la realidad taxonómica (Kõljalg et al., 2013).

Cada MOTU finalmente, estará representado por una secuencia consenso generada del alineamiento de
todas las secuencias editadas que lo integran. Las secuencias consenso se usan para análisis ecológicos y

22
de diversidad, nunca para filogenia, ya que se trata de secuencias sintéticas, representativas de un
grupo, pero posiblemente artificiales.

BLAST

Los MOTUS o las secuencias editadas (individuales), se pueden usar para su comparación contra las
bases de datos públicas como BOLD (Ratnasingham y Herbert, 2007) y UNITE (Kõljalg et al., 2005) y
GenBank. La base de batos con mayor número de secuencias de hongos es GenBank del NCBI. Está
integrada por las bases de datos “National Center for Biotechnology Information”, “European Nucleotide
Archive” y “DNA Data Bank of Japan” (Benson et al., 2013). La herramienta BLAST (herramienta básica de
búsqueda por alineamiento local) (Altschul et al., 1990), permite obtener todas las secuencias de una
base de datos que se parezcan a la secuencia problema. Los resultados de BLAST permiten el
planteamiento de una hipótesis taxonómica, o al menos pueden restringir la búsqueda.

Análisis filogenéticos

Para refinar la asignación específica se pueden plantear hipótesis filogenéticas mediante análisis
especializados. Los análisis filogenéticos pueden estar fundamentados en distintas aproximaciones
algorítmicas, no obstante, trabajan con un grupo de secuencias organizadas en un alineamiento. Los
alineamientos son simplemente el acomodo de las secuencias empatando las bases homologas para su
análisis filogenético. Editar el alineamiento es crucial e impacta sobre la topología del árbol resultante
del análisis. Para su edición se recortan los extremos a modo que todas las secuencias tengan la misma
longitud. Se procura tener la menor cantidad de gaps (huecos) y de menor tamaño.

Se recomienda hacer análisis filogenéticos con métodos Bayesianos y de Máxima Verosimilitud. Para los
análisis se pueden usar programas como BEAST (Drummond y Rambaut, 2007), Mesquite (Maddison y
Maddison, 2017), MrBayes (Ronquist et al. 2012), RAxML (Stamatakis, 2014), PAUP (Swofford, 2002).
Para seleccionar los modelos evolutivos se utiliza el programa Modeltest (Posada y Crandall, 1998).
GENEIOUS (Kearse et al., 2012) es un programa (comercial y de código abierto) que conjunta las
capacidades de la mayoría de los programas libres, por lo que es muy útil para ordenar información,
editar secuencias y alineamientos, generar contigs, análisis filogenéticos y genómicos.

Análisis de similitud

Los análisis de similitud, a diferencia de los análisis filogenéticos, no plantean relaciones de

ancestría/descendencia, simplemente muestran semejanzas y distancias génicas. El resultado de un

23
análisis de similitud, aunque de aspecto parecido, no es un árbol filogenético, si no un dendrograma, que
indica distancias génicas. También se pueden hacer análisis de similitud con datos ecológicos para
comparar comunidades de hongos u otros atributos.

Otras técnicas de biología molecular y uso en el estudio y aprovechamiento de hongos silvestres

Las herramientas de biología molecular son diversas, numerosas y han permitido abordar temas
relacionados con los hongos y su aprovechamiento desde distintas vertientes. Recientemente, se publicó
el reporte sobre el uso más antiguo de hongos comestibles y medicinales por el género humano.
Mediante secuenciación masiva en paralelo, Weyrich et al. (2017) estudiaron los metagenomas de las
dentaduras de varios ejemplares de Homo neandertalensis procedentes de distintas regiones europeas.
Obtuvieron secuencias, tanto de la comunidad bacteriana oral, como el DNA procedente del alimento,
fijado en la placa dental. Ellos compararon la microbiota oral de los neandertales con la de humanos
modernos y otros primates, ensamblaron el genoma completo más antiguo a la fecha
(Methanobrevibacter oralis, 10.2X, 48 000 años de antigüedad) y otros ocho genomas en versión
preliminar. También, identificaron que las dietas variaron atendiendo al ecosistema habitado, oscilando
entre carnívoros depredadores de rinocerontes lanudos, mamuts, caballos y muflónes (de estepas);
hasta dietas estrictamente herbívoras compuestas por musgos y semillas (de bosques). No obstante, los
representantes de ambas regiones fueron catalogados como fuertes consumidores de hongos
comestibles, particularmente Coprinopsis cinerea y Schizophyllum commune. Además, encontraron
secuencias identificadas como Zymoseptoria tritici, Phaeosphaeria nodorum, Penicillium rubens, y
Myceliophthora thermophila, lo que pone en evidencia el consumo regular de material vegetal
enmohecido por parte de los neandertales, sugiriendo automedicación (Weyrich et al., 2017).

El aprovechamiento de HCS, particularmente ectomicorrízicos, se puede tecnificar mediante la

implementación de estrategias de propagación intencional (Zambonelli y Bonito 2012; Zambonelly et al.
2016), sin embargo en la mayoría de los casos, su disponibilidad está dirigida por la fructificación natural.
Ésta a su vez, se ha asumido dependiente de las características del hábitat y de las condiciones
climáticas, sin embargo, tanto para ambientes naturales como para plantaciones no es fácil predecir o
modelar la producción de esporomas. Es por esto que identificar la localización, cantidad y actividad del
micelio en el suelo es clave para el manejo de HCS.

24
Se han utilizado estrategias bioquímicas, otras basadas en marcadores de DNA, y muchas
observacionales (in vitro y en suelo) para la detección y cuantificación de micelio ectomicorrízico
extraradical (Leake et al., 2004); sin embargo el uso de qPCR (=PCR en tiempo real, =PCR cuantitativa) ha
demostrado dar resultados confiables y replicables. La qPCR se basa en la cuantificación de una señal
luminosa emitida por el DNA marcado. Esta señal crece exponencialmente mientras se desarrolla la
reacción de PCR dentro del termociclador (equipado con fluorómetros). De este modo, se puede conocer
la cantidad de DNA templado presente en una muestra mientras se amplifica (Green y Sambrook, 2012).

Aunque se ha reportado que 109 copias de ITS corresponden a 0.79 mg secos de micelio de Piloderma
croceum (Raidl et al., 2005), el número de copias del ITS en el genoma varía entre especies de hongos,
por lo que utilizar un gen marcador con un número de copias conocido es más confiable para fines de
cuantificación (Landeweert et al. 2003).

Mediante qPCR se cuantificó el micelio de T. melanosporum en el suelo y se encontró que los árboles no
productores de trufas presentan una mayor cantidad de micelio extraradical que los productivos,
posiblemente debido a que algunos genetos favorecen la asignación de los recursos proveídos por la
planta al crecimiento miceliar y la reproducción vegetativa, sobre la producción de ascomas (Suz et al.,
2008). En contraste para T. magnatum presentó mayor cantidad de DNA en las parcelas productivas que
en las que no lo son (Iotti et al., 2012). También se ha detectado mayor cantidad de micelio de T.
melanosporum en bosques naturales que en huertos truferos (Parladé et al., 2013). Usando estas
técnicas también se ha estudiado la competencia entre especies de HEM en invernadero (Parladé et al.,
2007) y en bosque templado (Kennedy et al., 2007), lo que impacta en la productividad de esporomas de
especies comestibles propagadas.

Mediante qPCR y otras técnicas, en sitios conocidos por su producción de Boletus edulis, se encontró que
no hubo correlación entre la cantidad de micelio o ectomicorrizas con la productividad de esporomas (De
la Varga et al., 2012), hallazgo similar al reportado para Hydnellum peckii y Phellodon tomentosus usando
la misma técnica (van der Linde et al., 2009). Recientemente se reportó que prácticas de manejo forestal
como los aclareos, la poda y tala de árboles afectan significativamente la cantidad de micelio de B. edulis
en el suelo del bosque, mientras que la recolección de esporomas no lo hace. Así mismo, se identificó
que las lluvias de otoño (y no a las de otro momento del año) son las causantes del incremento en la
cantidad de micelio, lo que se relaciona con la productividad de esporomas (Parladé et al., 2017). Las
esporas del aire en bosque, capturadas mediante trampas de papel filtro, identificadas y cuantificadas

25
por qPCR y secuenciación masiva, han sido recientemente propuestas como otra estrategia para evaluar
la productividad de esporomas epigeos (Castaño et al., 2017).

Los microarreglos son una herramienta que permite detectar decenas de miles de secuencias específicas
de DNA o RNA simultáneamente en una sola muestra. Consiste en un soporte solido cubierto por sondas
de DNA que hibridan a DNA o cDNA de manera muy específica. Fueron originalmente diseñados para
estudiar la expresión diferencial de transcritos en sistemas simples, como líneas celulares o tejidos
(Green y Sambrook, 2012). En hongos filamentosos, los microarreglos ha sido utilizados principalmente
para estudiar el metabolismo, desarrollo, patogenicidad, simbiosis y aspectos biotecnológicos
(Breakspear y Momany, 2007). Se ha identificado la naturaleza molecular y fisiológica de las propiedades
medicinales de algunos hongos comestibles (e.g. Jedinka y Silva, 2008; Kobori et al., 2007). Por otro lado,
se han utilizado para estudios de diversidad ecológica y funcional en sistemas complejos como los
arrecifes de coral, pesquerías o producción de miel (Kammenga et al., 2007).

Tal como se ha hecho ampliamente para bacterias (Zhou, 2003), se ha planteado el uso de filochips
(microarreglos diseñados para detectar especies mediante marcadores como 16S o ITS) como una
estrategia para conocer la diversidad fúngica en una muestra ambiental, sin embargo, el obstáculo
principal es que solo se pueden detectar organismos previamente secuenciados (Bruns et al., 2008), lo
que para el caso de los hongos es una limitante importante, principalmente en regiones de alta
diversidad y endemismo como el Neotrópico. No obstante se han diseñado algunos filochips con la
capacidad de recuperar la microbiota completa (bacterias, arqueas y hongos) de muestras de suelo (e.g.
DeSantis et al., 2005; Hyden et al., 2012). El uso de filochips para el monitoreo de la diversidad puede
usarse como una herramienta diagnostica dirigida hacia la conservación.

Consideraciones generales

Como hemos visto en este capítulo, las herramientas moleculares han permitido avances en el
entendimiento de la biología de los HCS, su identificación, la discriminación entre especies similares, la
trazabilidad y control de calidad, así como la identificación de propiedades culinarias o farmacológicas, e
incluso han puesto en evidencia el uso de los hongos comestibles y medicinales por parte de nuestros
ancestros prehistóricos. Por otra parte, estas herramientas permiten el seguimiento y la predicción de la
productividad de hongos en un bosque o plantío.

26
Los costos de los reactivos y equipos han disminuido mientras que los rendimientos y la cantidad de
información que ofrecen han aumentado sorprendentemente (van Dijk et al., 2014); así como la
capacidad de análisis bioinformático ofrecido por los programas y las plataformas en línea (Muir et al.,
2016). Se alienta a todos los estudiosos de las relaciones de las personas con los hongos a hacer uso de
las herramientas aquí sugeridas para facilitar su trabajo, incrementar el alcance de sus investigaciones, el
impacto de sus resultados y responder nuevas preguntas de investigación. Pero además, se destaca que
el uso de secuencias de DNA y su deposito en bases de datos publicas permite que los estudiosos de los
hongos de cualquier lugar del mundo hagan comparaciones más rápidas y veraces entre sus ejemplares,
que las que podrían hacer mediante nombres científicos o tradicionales.

Dada la enorme riqueza biocultural del Neotrópico y zonas tropicales en general, existen altas
probabilidades de encontrar especies nuevas siendo aprovechadas por los pueblos tradicionales, por lo
que sugerimos complementar los estudios etnomicológicos con secuencias de DNA de los ejemplares
voucher, ya que tanto las prácticas como los organismos podrían presentar altos grados de endemismo
regional.

Protocolos

E1.- Protocolo de extracción de DNA de esporomas o micelio con el kit XNAP (Sigma-Aldrich)

Protocolo original e información adicional: https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-

aldrich/docs/Sigma/Bulletin/xnaprbul.pdf. Objetivo: Extraer DNA de esporomas frescos o deshidratados.
Material biológico: Esporomas frescos o deshidratados. Equipos: Refrigerador a 4 °C, vortex,
termociclador y campana de flujo laminar. Instrumental, plásticos y cristalería: Bitácora, rotulador,
micropipeta (libre de productos de PCR) de 10 a 100 µl, puntas estériles de 10 a 100 µl, gradilla para
tubos de 100 µl, tubos de 100 µl (tamaño PCR), pinzas de punta, lámpara de alcohol y matraz Erlenmeyer
de 50 ml. Reactivos: Solución de Extracción (ES) y solución de Dilución (DS). Formato: F1.

Consideraciones previas: Haber esterilizado los plásticos requeridos. El material biológico (fragmentos de
esporomas frescos o secos) se deberá encontrar en buenas condiciones, separado (una sola muestra por
tubo) y rotulado. Apartar por un lapso de una hora el termociclador. Ingresar al termociclador el
programa de incubación XNAP. Todos los pasos de pipeteo se hacen dentro de la campana de flujo.

Procedimiento: 1.- En una gradilla se colocarán tubos de 100 µl (uno por muestra) y se rotularán
apropiadamente. El rotulo se coloca en la tapa y el costado del tubo. 2.- Dentro de la campana de flujo

27
laminar, se colocan 20 µl de ES en el fondo de un tubo de 100 µl. La solución ES debe estar totalmente
descongelada y haber sido homogeneizada por vortex. 3.- Con el uso de unas pinzas de punta, flameadas
y frías, se toma un segmento de esporoma de ≈1 mm3 (preferentemente del himenio), y se coloca en el
tubo con la solución ES. Para el micelio de cepas cultivadas en caja Petri, es importante tomar micelio
aéreo joven (preferiblemente libre de agar o medio de cultivo). La muestra deberá estar totalmente
cubierta por la solución. Es preferible no tocar la solución con las pinzas para evitar que ésta se adhiera a
las pinzas y su volumen en el tubo disminuya. La muestra no deberá traer residuos de agua o alcohol al
ser colocada en la solución para así evitar diluir el reactivo de interés, para lo cual, se usa un papel
absorbente irradiado con UV por 40 min 4.- Incubar la reacción en el termociclador con el programa
XNAP. El programa XNAP es: 10 mins a 65 °C, 10 mins a 95 °C, ∞ a 4 °C. 5.- Sacar los tubos del
termociclador, colocarlos en la gradilla y agregar 20 µl de DS, e incubar a temperatura ambiente por 30
min La solución DS deberá estar totalmente descongelada y homogeneizada por vortex antes de usarse.
6.- Almacenar la solución resultante en un refrigerador a 4 °C.

Otras consideraciones: Después de cada paso de incubación es recomendable revisar los volúmenes de
las soluciones, de este modo identificaremos si alguna de las muestras se evaporó, secó o concentró. Las
soluciones de colores obscuros tienden a ser problemáticas para la PCR, por lo que es recomendable
diluirlas antes de hacer PCR. Los materiales deshidratados absorberán la solución y aumentan su
tamaño, por lo que se recomienda esperar 5 mins para verificar esto antes del siguiente paso, y usar
fragmentos pequeños. El tejido del himenio o sus inmediaciones suelen dar mejores resultados en la
PCR. En caso de que el DNA extraído sea almacenado por más de una semana, se deberá transvasar la
solución a tubos nuevos sin la muestra.

E2.- Protocolo de extracción de DNA de ectomicorrizas con el kit XNAP (Sigma-Aldrich)

De manera general, se siguen los mismos pasos que en el protocolo E1, sólo se presentan las
particularidades propias de esta modificación. Objetivo: Extraer DNA de ectomicorrizas frescas o
previamente fijadas en etanol al 96%. Material biológico: Ectomicorrizas frescas en agua, fijadas en
etanol o en CTAB.

Consideraciones previas: El material biológico (puntas ectomicorrízicas) se deberá encontrar en buenas

condiciones (fresco, sano, turgente y libre de suelo), separado (una sola muestra por tubo) y rotulado.

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Procedimiento: Remplazar en los pasos indicados los siguientes procedimientos: 2.- Colocar 10 µl de ES a
cada uno de los tubos. 5.- Agregar 30 µl de DS, e incubar a temperatura ambiente por 30 min

Otras consideraciones: Las extracciones de ectomicorrizas suelen presentar mayores cantidades de

inhibidores de la PCR.

E3.- Protocolo de extracción de DNA de esporomas o ectomicorrizas con el kit DNeasy Plant Mini Kit
(QIAGEN)

Protocolo original e información adicional:

http://clough.cropsci.illinois.edu/protocols/qiagen/DNeasy_Plant_Handbook_October_2012.pdf
Objetivo: Extraer DNA de alta integridad, concentración y pureza. Material biológico: Esporomas, micelio
o ectomicorrizas. Equipos: TissueLyser, vortex, baño María o thermoblock, centrifuga para tubos de 2 ml,
congelador a -20 °C, ultracongelador a -70º C. Instrumental y plásticos: Bitácora, rotulador, mortero y
pistilo de porcelana (en caso de no contar con TissueLyser), balines metálicos y dispensador de balines,
flotador para tubos de 2 ml (en caso de usar baño María), micropipetas (libre de productos de PCR) de
0.5 a 10 µl, 10 a 100 µl y 100 a 1000 µl, puntas estériles para micropipeta de 0.5 a 10 µl, 10 a 100 µl y 100
a 1000 µl, gradillas para tubos de 2 ml, charola con hielo o placa fría, tubos de 2 ml, sample tubes RB 2
ml, columnas QIAshredder (blancas), columnas Mini DNeasy (lilas). Reactivos: Etanol al 96%, buffer AP1,
RNasa A, buffer AW1, buffer AW2, buffer AE, ddH2O estéril (opcional), nitrógeno líquido (opcional).

Consideraciones previas: Tener los plásticos estériles. Centrifugar la muestra en los tubos RB (no
incluidos en el kit) para llevar todas las partículas al fondo del tubo. Redisolver cualquier precipitado
presente en los buffers AP1 y AW1. Agregar etanol a los buffers AW1 y AW2 de no haberlo hecho antes.
Precalentar el baño María o el thermoblock a 65 °C. Tener a la mano la charola con hielo o la placa fría.
Colocar las muestras en el ultracongelador para cristalizarlas antes de molerlas, y molerlas
inmediatamente después de sacarlas para evitar que se descongelen.

Procedimiento: 1.- Pesar la muestra (100 mg de tejido fresco o 20 mg de tejido seco) en un tubo RB de 2
ml, colocar un balín estéril dentro y congelar la muestra en el ultracongelador o con nitrógeno líquido.
2.- Moler la muestra en el TissueLyser. En su defecto, moler la muestra con nitrógeno líquido, mortero y
pistilo estériles. 3.- Añadir 400 µl del buffer AP1 y 4 µl de RNasa A en cada tubo con la muestra,
homogeneizar con vortex, colocar los tubos en un flotador e incubar por 10 min en el baño María o
thermoblock a 65 °C. Agitar manualmente la solución cada 2 min. No mezclar el buffer AP1 y la RNasa A

29
previamente. 4.- Agregar 130 µl del buffer P3, agitar con vortex e incubar en hielo por 5 min. 5.-
Centrifugar por 5 min a 14000 rpm. 6.- Vaciar el lisado en la columna QIAshredder y centrifugar por 2
min a 14000 rpm. Para mantener el peso de las muestras equilibrado en la centrifuga se deberá retirar el
balín de todas las muestras al momento de vaciar, o se dejará en todas las columnas. 7.- Transferir el
sobrenadante a un tubo nuevo de 2 ml con una pipeta. No resuspender el precipitado si se presenta.
Añadir el buffer AW1 en un volumen 1.5 veces mayor al de la muestra y mezclar por pipeteo. 8.- Tomar
con una pipeta 650 µl de la mezcla y colocarlos en una columna Mini DNeasy (lilas), centrifugar por 1
minuto a 8000 rpm, descartar el fluido que atraviese la columna y repetir el procedimiento hasta agotar
la muestra. 9.- Añadir 500 µl del buffer AW2, centrifugar por 1 minuto a 8000 rpm y descartar el fluido
que atraviese la columna. 10.- Repetir el paso anterior, pero esta vez centrifugar por 2 min a 14000 rpm.
Tener cuidado de que la parte inferior de la columna no entre en contacto con el fluido. 11.- Colocar la
columna en un tubo con tapa nuevo de 1.5 o 2 ml, añadir 50 µl del buffer de elución AE, incubar a
temperatura ambiente (15-25 °C) durante 15 min y después centrifugar por 1 minuto a 8000 rpm. 12.-
Repetir el paso anterior. 13.- Descartar la columna y almacenar el DNA a -20 °C.

Otras consideraciones: Si en el paso 2, la muestra se ve pastosa o muy espesa, se recomienda agregar

100 o 200 µl extra de buffer AP1. Cuando el DNA extraído y purificado va a ser almacenado por un
tiempo largo, es conveniente eluir como se propone arriba (pasos 9 y 10), mientras que si el DNA es
destinado para su uso inmediato puede, se puede eluir con agua destilada estéril. Cuando el DNA es
destinado para secuenciación masiva, es recomendable eluir con agua. Evaporar la totalidad de la
muestra centrifugando en una VacoFuga a 30 °C por 40 min, y resuspender la muestra en 20 o 50 µl de
agua. De este modo el DNA estará más concentrado en solución y sin CTAB ni TRIS (componentes del
buffer de elución AE). Cuando se desea una mayor cantidad de DNA total, se pueden hacer réplicas de la
misma muestra, someterlas a todo el proceso, para finalmente ejecutar del paso 8 en adelante en una
sola columna de afinidad Mini DNeasy.

E4.- Protocolo de extracción de DNA de suelo o mezcla de ectomicorrizas con el kit PowerSoil DNA
Isolation Kit (MO BIO/QIAGEN)

Protocolo original e información adicional:

https://mobio.com/media/wysiwyg/pdfs/protocols/12888.pdf. Objetivo: Extraer DNA de alta integridad,
concentración y pureza a partir de muestras compuestas y químicamente complejas. Material biológico:
Suelo o muestra compuesta de ectomicorrizas. Equipos: Vortex, baño María, refrigerador a 4 °C,

30
congelador a -20 °C, ultracongelador a -70 °C (opcional) y vacofuga (opcional). Instrumental y plásticos:
Bitácora, rotulador, micropipetas (libre de productos de PCR) de 0.5 a 10 µl, 10 a 100 µl y 100 a 1000 µl,
puntas estériles para micropipeta de 0.5 a 10 µl, 10 a 100 µl y 100 a 1000 µl, gradillas para tubos de 2 ml,
tubos PowerBead, tubos de recolección de 2 ml, columnas Spin Filter, broches, ligas y cinta adhesiva.
Reactivos: Solución C1, solución C2, solución C3, solución C4, solución C5, solución C6, ddH2O estéril
(opcional), etanol absoluto (opcional), NaCl 5M (opcional) y tris 10 mM (opcional).

Consideraciones previas: Tener puntas estériles. Asegurarse de que la solución C1 no presente

precipitados. De presentarlos, calentar la solución en baño María a 60 °C y homogeneizar manualmente
hasta disolver los precipitados.

Procedimiento: 1.- Colocar 0.25 g de cada muestra un tubo PowerBead, mismos que contienen buffer de
lisis. Mezclar con pulsos cortos en el Vortex. 2.- Añadir 60 µl de la solución C1 y homogeneizar con pulsos
cortos en el Vortex. 3.- Usando broches sujetadores de documentos, cinta adhesiva y ligas, colocar
horizontalmente los tubos PowerBead en la parte superior del Vortex y mezclar a máxima velocidad por
15 min. Se recomienda colocar 4 tubos simultáneamente, ya que muchos tubos dificultan su acomodo
sobre el vortex y se agitan heterogéneamente y con menor fuerza, disminuyendo la lisis celular. 4.-
Centrifugar los tubos a 10000 g por 30 segundos a temperatura ambiente (15 a 25 °C). Si se excede de
10000 g, los tubos se rompen. 5.- Transferir el sobrenadante (≈ 500 µl) a un tubo nuevo de recolección
de 2 ml, añadir 250 µl de la solución C2, hacer vortex por 5 segundos e incubar por 5 min a 4 °C. 6.-
Centrifugar por 1 minuto a 10000 g a temperatura ambiente y transferir el sobrenadante (>600 µl) a un
tubo nuevo de 2 ml. Evitar resuspender el pellet precipitado. 7.- Añadir 200 µl de la solución C3, mezclar
pipeteando e incubar por 5 min a 4 °C. 8.- Colocar 1.2 ml de la solución 4 en tubos nuevos de 2 ml. Agitar
la solución 4 antes de usarla. 9.- Transferir 750 µl del sobrenadante a los tubos con la solución 4 teniendo
precaución de no derramarlos. Hacer vortex por 5 segundos. 10.- Transferir 675 µl de la mezcla en una
columna Spin Filter, centrifugar a temperatura ambiente por 1 minuto a 10000 g, y descartar el fluido
que atraviesa la columna. Repetir hasta agotar la mezcla. 11.- Cargar 500 µl de la solución C5 en la
columna, centrifugar a temperatura ambiente por 30 segundos a 10000 g y descartar el fluido que
traviesa la columna. 12.- Centrifugar nuevamente la columna vacía a temperatura ambiente por 1
minuto a 10000 g. 13.- Colocar la columna en un tubo nuevo de 2 ml. Evitar tocar con la parte inferior de
la columna el líquido que la atravesó en el paso anterior. Esperar por 10 min a que se evapore cualquier
traza de etanol (componente de la solución C5). 14.- Con la pipeta, colocar 50 µl de la solución C6 (buffer
de elución) justo en el centro blanco del interior de la columna (membrana de filtrado y afinidad por el

31
DNA). Tener precaución de no romper la membrana con la punta de la pipeta. Asegurarse de que toda la
membrana se humedezca con la solución C6. 15.- Centrifugar a temperatura ambiente por 30 segundos a
10000 g. 16.- Repetir los 2 pasos anteriores. 17.- Retirar la columna y almacenar a -20 °C.

Otras consideraciones: Si se desea concentrar la muestra se usa agua destilada estéril en sustitución de
la solución C6, colocar la muestra con los tubos destapados en la VacoFuga a 30 °C durante 40 min, y
resuspender la muestra en 20 o 50 µl de agua. De este modo el DNA estará muy concentrado en solución
y sin Tris (componente de la solución C6). Si se desea concentrar la muestra que ha sido eluida en C6, se
agrega 4 µl de NaCl 5M, se agita invirtiendo el tubo 5 veces, se agregan 200 µl de etanol 100% y se agita
nuevamente. Posteriormente se centrifuga por 5 min a 10000 g, se decanta el líquido y se seca
totalmente en la VacoFuga 30 °C por lapsos de 15 min, revisando entre cada lapso si ya se secó.
Finalmente, se resuspende el DNA precipitado con 20 o 50 µl de agua destilada estéril o Tris 10 mM. Para
las aplicaciones de secuenciación masiva se recomienda resuspender en agua, pero si el DNA será
almacenado durante meses, se recomienda estabilizar con Tris. Cuando se desea obtener mayores
cantidades de DNA total, se pueden someter a todo el proceso varias réplicas de la misma muestra, para
finalmente ejecutar los pasos 9 en adelante en la misma columna de afinidad Spin Filter.

G1.- Protocolo para electroforesis en gel de agarosa 1% de DNA extraído

Objetivo: Comprobar visualmente la presencia e integridad de DNA. Material biológico: Extracción de

DNA. Equipos: Cámara de electroforesis, fuente de poder, transiluminador, computadora con el
programa “Doc-ItLS Image Analysis”, balanza analítica y horno de microondas o parrilla eléctrica.
Instrumental, cristalería y plásticos: Bitácora, matraz Erlenmeyer de 100, 250 o 500 ml, jícara plástica,
molde para gel de 50, 100 o 200 ml, peines para gel de 20, 40 o 100 pozos, cinta adhesiva maskin tape,
micropipeta (para productos de PCR) de 10 µl, puntas de micropipeta de 10 µl (no necesitan estar
estériles) y parafilm. Reactivos: Agarosa, buffer TBE 1X, GelRed y agua destilada. Formato: F2.

Consideraciones previas: Agitar para disolver precipitados en el buffer si se presentan.

Procedimiento: 1.- Pesar la agarosa y disolverla en buffer TBE 1X contenido en un matraz. Las
proporciones se presentan en el formato F1. El matraz debe ser de al menos el doble de capacidad del
volumen contenido, usar un recipiente pequeño propicia que el buffer se derrame el alcanzar la
ebullición. 2.- Pesar el matraz. 3.- Calentar la mezcla contenida en el matraz usando un microondas. Se
recomienda usar un pulso inicial de 40 segundos seguido de pulsos de 10 segundos hasta estar seguro de

32
que la agarosa se cristalizó totalmente, para evitar que se derrame al hervir violentamente. 4.- Pesar el
matraz con la mezcla y agregar la cantidad de agua destilada que se perdió por la evaporación hasta
alcanzar el peso original. 5.- Colocar el matraz en una jícara con agua. Cuando la temperatura baje a
menos de 60 °C, agregar el GelRed (ver formato F2 para las concentraciones). Una temperatura
adecuada es cuando el matraz no queme al tacto. El reactivo GelRed debe almacenarse en la oscuridad y
a temperatura ambiente. 6.- Vaciar la mezcla en el molde, colocar los peines y esperar su polimerización
a temperatura ambiente. Es recomendable asegurarse con un nivel de que la mesa en la que se deja
polimerizar esté perfectamente horizontal. 7.- Llenar la cámara de electroforesis con Buffer TBE 1X y
colocar el gel. Este deberá estar totalmente cubierto por el buffer. 8.- Cortar una tira de parafilm,
colocarla sobre una gradilla y marcar con el dedo los pozos de la gradilla. En cada pozo sobre el parafilm,
colocar 2 µl de LB. Colocar también el C+ y C- de la PCR. 9.- Con una pipeta tomar 4 µl de la muestra,
colocarlo en la gota de LB, revolver pipeteando y colocar los 6 µl en un pozo del gel. Hacer lo mismo con
el marcador de peso molecular. 10.- Programar la fuente de poder a 80 voltios por 50 min. 11.- Colocar el
gel en el transiluminador y tomar una fotografía bajo luz UV con el programa Doc-ItLS (o alguno similar).

Consideraciones finales: Este protocolo puede usarse para electroforesis de productos de PCR en los que
la mezcla maestra no contenga colorante ni glicerol. Las mezclas maestras como RedEX y Ruby taq
contienen colorantes que permiten ver la muestra en el gel y que esta se precipite al fondo del pozo, por
lo que no es necesario usar LB. Hay que asegurarse de que los dos cables estén conectados
adecuadamente con relación al gel. El DNA, por su carga eléctrica negativa, migra en dirección al polo
positivo, por lo que los pozos deberán estar al extremo negativo del gel. El buen funcionamiento de la
cámara de electroforesis se hace evidente al aparecer una “cortina de pequeñas burbujas de cada
electrodo. Es recomendable usar siempre la misma intensidad de luz UV en el transiluminador, para así
poder hacer comparaciones entre distintas PCR. Se puede usar varias veces el buffer de la cámara, pero
eventualmente el DNA se sale del gel y contamina el buffer.

G2.- Protocolo para electroforesis en gel de agarosa 1% de productos de PCR con colorante

De manera general, se siguen los mismos pasos que en el protocolo G1, sólo se presentan las
modificaciones. Objetivo: Comprobar visualmente la amplificación del DNA. Material biológico: Producto
de PCR. Instrumental, cristalería y plásticos: Omitir el parafilm. Reactivos: Omitir el LB. Procedimiento:
Remplazar los pasos 8 y 9 por los siguientes procedimientos: 8.- Colocar 4 µl de cada producto de PCR
directamente en el fondo de cada pozo del gel. Colocar también el C+ y C- de la PCR.

33


A1.- Protocolo de PCR

Objetivo: Amplificar una región del DNA de ectomicorrizas, esporomas o cepas. Material biológico: DNA
extraído o purificado. Equipos: Calculadora, termociclador, refrigerador a -20 °C, refrigerador a 4 °C,
centrífuga y campana de flujo laminar. Instrumental y plásticos: Bitácora y formatos, rotulador, tubos de
100 µl (tamaño PCR), tubos de 1.5 o 2 ml, gradilla para tubos de 100 µl, micropipetas (libre de productos
de PCR) de 0.5 a 10 µl, 10 a 100 µl y 100 a 1000 µl y puntas estériles para micropipeta de 0.5 a 10 µl, 10 a
100 µl y 100 a 1000 µl. Reactivos: ddH2O estéril, Taq polimerasa, Buffer 10x, dNTPs 10 mM, Mg,Cl2
primers frontal y reverso. Formatos: F1 y F3.

Consideraciones previas: Hacer los cálculos para preparar la mezcla maestra para la PCR siguiendo el
formato F3. Por cada reacción (muestras mas C+ y C-), la mezcla maestra lleva 15.5 µl de agua, 2 µl de
buffer 10x, 0.4 µl de dNTPs 10 mM, 0.6 mM MgCl2, 0.2 µl 50 mM de cada primer y 1.0 µl de Taq
polimerasa (volumen final de 20 µl c/u). Se recomienda calcular una reacción extra por cada 25
reacciones, ya que se pierde un poco de mezcla durante el pipeteo. Colocar las muestras en una gradilla
atendiendo al arreglo registrado en el mapa de carga (F1). Haber apartado el termociclador. Ingresar el
programa de PCR específico para el par de primers que se usará y DNA polimerasa en el termociclador.

Procedimiento: 1.- En un tubo de 1.5 o 2 ml preparar la mezcla maestra agregando primero el ddH2O,
seguida del buffer, dNTPs, MgCl2, primers y al final la enzima (del más barato al más caro). Todos los
reactivos deberán estar descongelados y homogeneizados antes de usarse. Mezclar con vortex al
terminar. 2.- Colocar tubos de 100 µl en una gradilla con el mismo arreglo registrado en el formato 2 y
poner al fondo del tubo 19 µl de la mezcla maestra. 3.- Añadir 1 µl de DNA extraído a cada tubo y
mezclar por pipeteo. 4.- Si es necesario, bajar la muestra al fondo del tubo con una centrífuga por 5
segundos. 5.- Incubar en el termociclador con el programa específico para cada par de primers y enzima
usada. Asegurarse de que los tubos están bien cerrados para evitar evaporación. 6.- Almacenar a 4° C.

Consideraciones finales: Rotular los tubos en la tapa y en el costado. En la tapa para verlo fácilmente al
estar en la gradilla, y en el costado por si se borra el rótulo al salir del termociclador o con la
manipulación. Cuando se presentan inhibidores de la PCR en la extracción se coloca sólo 0.5 µl de DNA
extraído en el paso 3 y se ajusta el volumen total de la reacción aumentando agua. También se pueden
hacer diluciones 1:10, 1:100 o 1:1000, para disminuir la concentración de la extracción simple, la cual

34
suele llevar inhibidores de la PCR. La Taq debe salir del refrigerador únicamente cuando se va a usar, y
una vez usada deberá devolverse al refrigerador inmediatamente.

A2.- Protocolo de PCR con el kit REDExtract-N-Amp Plant PCR (Sigma-Aldrich)

De manera general, se siguen los mismos pasos que en el protocolo A1, sólo se presentan las
particularidades propias de esta modificación. Protocolo original e información adicional:
https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/Sigma/Bulletin/xnaprbul.pdf. Objetivo:
Amplificar una región del DNA de ectomicorrizas, esporomas o cepas con una enzima Taq polimerasa hot
start. Reactivos: ddH2O estéril, MasterMix REDex y primers frontal y reverso. Formatos: F1 y F3.

Consideraciones previas: Hacer los cálculos para preparar la mezcla maestra para la PCR siguiendo el
formato F3. Por cada reacción (muestras mas C+ y C-), la mezcla maestra lleva 7.6 µl de agua, 0.2 µl 50
mM de cada primer, 10 µl de REDex PCR (volumen final de 20 µl c/u). Ingresar el programa de PCR
específico para el par de primers que se usará y DNA polimerasa en el termociclador. En este caso, el
programa (hot start) necesita una desnaturalización inicial (para remover el anticuerpo que inhibe la
enzima) de 3 min a 94° C.

Procedimiento: 2.- Colocar tubos de 100 µl en una gradilla con el mismo arreglo registrado en el formato
2 y poner al fondo del tubo 18 µl de la mezcla maestra. 3.- Añadir 2 µl de DNA extraído a cada tubo y
mezclar por pipeteo.

A3.- Protocolo de PCR con el kit USB RubyTaq PCR Master Mix (Affymetrix)

De manera general, se siguen los mismos pasos que en el protocolo A1, sólo se presentan las
particularidades propias de esta modificación. Protocolo original e información adicional:
http://www.isogen-lifescience.com/uploads/eF/c7/eFc7c928kqP-LdnzA1g1wg/USB-RuBYTaq-PCR-
MM.pdf. Objetivo: Amplificar la una región del DNA de ectomicorrizas o esporomas o cepas.
Instrumental y plásticos: Charola con hielo. Reactivos: MasterMix RubyTaq.

Consideraciones previas: Hacer la mezcla maestra y todos los pasos de pipeteo con la gradilla dentro de
la charola con hielo. Sacar la Ruby Taq del refrigerador por el menor tiempo posible.

L1.- Limpieza de productos de PCR mediante ExoSap-IT (Affymetrix)

35
Protocolo original e información adicional:
https://www.fimm.fi/sites/default/files/SeqLab_Exosap_USB.pdf. Objetivo: Purificar productos de PCR
para su secuenciación Sanger. Material biológico: Producto de PCR. Equipos: Termociclador y
refrigerador a -20º C. Instrumental y plásticos: Micropipeta (para productos de PCR) de 1 a 10 µl y de 10
a 100, puntas para micropipeta de 10 y de100 µl, tubos Eppendorf de 100 µl, tubos de 1.5 ml, gradilla y
charola con hielo. Reactivos: ExoSAP y ddH2O

Consideraciones previas: Usar solo pipetas destinadas para productos de PCR. Mantener el ExoSAP y la
mezcla en hielo todo el tiempo. Dado que en este protocolo se manejan volúmenes muy pequeños, es
importante colocar los reactivos al fondo del tubo con la pipeta, para no perder volumen en las paredes.
Ingresar en el termociclador el programa de incubación de ExoSAP.

Procedimiento: 1.- Preparar la mezcla colocando en un tubo de 1.5 ml 1 µl de ddH2O y 1 µl de ExoSAP

por cada reacción que se desea procesar. Considerar una reacción extra por cada 25 reacciones para no
perder volumen durante el pipeteo. 2.- Colocar 2 µl de la mezcla en un tubo de 100 µl por cada reacción.
3.- Colocar 3.5 µl de producto de PCR en cada tubo y mezclar mediante pipeteo. 4.- Incubar la reacción
en el termociclador a 37º C por 15 min, seguido de 15 min a 80º C. 5.- Almacenar la reacción a -20º C.

Consideraciones finales: Hacer la secuenciación lo más pronto posible (menos de dos semanas), ya que
los volúmenes pequeños se tienden a evaporar fácilmente en refrigeración.

36
Formatos

F1.- Mapa de carga

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A
13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24
B
25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36
C
37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48
D
49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60
E
61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72
F
73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84
G
85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96
H

F2.- Preparación de geles de agarosa 1%

Buffer TBE 1X Agarosa GelRed

100 pozos 200 ml 2 g 2 µl
40 pozos 100 ml 1 g 1 µl
20 pozos 50 ml 0.5 g 0.5 µl

F3.- Mezcla maestra

Reactivo 1X NX
ddH2O
Buffer
Mg
dNTPs
Primer frontal
Primer reverso
Taq polimerasa o mezcla maestra
DNA

37
 Volúmenes
Volumen de c/reacción Volumen total de la mezcla

Agradecimientos

Se agradece a todo el equipo de investigación, estudiantes, profesores, colegas y amigos del Laboratorio
de Sistemática Ecología y Aprovechamiento de Hongos Ectomicorrízicos del Instituto de Biología de la
Universidad Nacional Autónoma de México por sus experiencias en la generación de datos, en el análisis
y discusión de resultados moleculares de hongos silvestres de México, así como por la revisión de este
texto. Al Grupo Interdisciplinario para el Desarrollo de la Etnomicología en México (GIDEM) por su
constante lucha por la revalorización del patrimonio micocultural local; así como a los coordinadores de
este libro y a dos revisores anónimos por sus nutritivos comentarios y correcciones.

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